선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 하지만 아직 미세조류의 항균성 물질 탐색은 기초 단계에 있다고 할 수 있으며, 국내에 분포하고 있는 미세조류에 대한 정확한 정보가 없는 실정이고 미세조류의 이용성에 대한 연구도 미미한 실정이다. 이에 본 연구에서는 미세조류를 이용한 식품보존료의 개발 가능성을 검토하고자 4종의 해양 미세조류로부터 99.9% 에탄올로 추출한 추출물의 식중독균에 대한 항균활성과 그 성분을 조사하였다.
제안 방법
- C. vulgaris 에탄올 추출물의 성분 분석은 GC/MS (GC-MSCTC, 7890A/5975C MSD, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하였다(25).
- Mixed A, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata, Chaetoceros calcitrans 등 4종류의 미세조류로부터 99.9% 에탄올로 추출한 성분의 항균활성을 검증하기 위해 그람음성세균 2종(E. coli, S. Typhimurium)과 그람양성세균 2종(S. aureus, B. cereus)에 대하여 paper disk diffusion assay, MIC, MBC를 측정하였다. 4종류의 미세조류 추출물은 공시균주에 대하여 0.
- 멸균한 tube에 BHI broth 100 µL, 미세조류 에탄올 추출물 50 µL, 균 배양액 50 µL를 순차적으로 첨가하여 37oC에서 24시간 배양한 후, tube를 육안(visible)으로 봤을 때, 균이 증식하지 않은 최소농도를 최소저해농도로 설정하였다.
- 각 균주는 균수를 1.0×105 CFU/mL로 조절하였으며 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
- 미세조류로부터 항균물질을 추출하기 위하여 미세조류 세포를 동결건조한 분말 시료에 중량대비 25배에 해당하는 99.9% 에탄올(Duksan Pure Chemicals, Seoul, Korea)을 가하고 실온에서 3일 동안 추출하여 상층액을 모아 거름종이(Advantec No. 5C, Tokyo, Japan)로 여과한 후, rotary evaporator (Rotavapor R-200, BUCHI Co., New Castle, DE, USA)로 감압 농축하였다. 이 농축한 추출물에 남아있는 에탄올을 질소생성기로 제거한 후 밀봉하여 4oC냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 세포수 1.0×106 cells/mL의 Chlorella vulgaris, Chaetoceros calcitrans, Nannochloropsis oculata 각각 400 mL와 세포수 1.0×106 cells/mL의 미세조류 4종(Pavlova sp., Thalassiosira weissflogii, Tetraselmis suecica, Isochrysis galbana)을 각각 100 mL씩 혼합한 mixed microalgae (이하 Mixed A) 400 mL 등 4종류의 미세조류배양액을 원심분리(4oC, 5,000×g, 20분)하여 세포를 취한 후, 3% 식염수를 넣고 다시 원심분리(4oC, 5,000×g, 20분)하였다.
- vulgaris의 추출물이 세균에 대하여 항균활성을 가진다고 보고된 바 있다(29-31). 이에 GC/MS를 이용하여 C. vulgaris 에탄올 추출물로부터 항균활성을 나타내는 성분의 존재를 확인하였다.
- MIC의 경우, 통상 육안으로 증식이 인정되지 않는 농도로 결정하는데, 본 실험의 경우, 미세조류 고유의 색으로 인하여 증식여부를 결정하는 데 있어서 다소 곤란함이 있었다. 이에 최소살균농도를 측정하여 미세조류 추출물의 항균활성 근거를 확인하였다.
- 최소살균농도는 streak plate method를 사용하여 측정하였다(24). 최소저해농도 전후 농도의 배양액을 백금이로 취하여 각각 BHA plate에 streak하고, 37oC에서 48시간 배양한 후, 균이 증식하지 않는 최소농도를 최소살균농도로 설정하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
- 항균 활성은 disk 주위로 미생물의 생장이 저해되는 inhibition zone의 크기(mm)로 측정하였으며, 미세조류 추출물의 희석에 사용된 에탄올을 음성 대조군, 항균성이 보고된 allyl isothiocyanate (AIT,>98% purity, Fluka Co., Haan, Germany)를 양성 대조군으로 사용하였다.
- 항균활성 측정에 사용된 모든 균주는 균배양액 1 mL를 9 mL의 brain heart infusion (BHI) broth (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에 접종하여 37oC에서 2회 계대배양 하였고, UV-분광광도계(spectrophotometer, UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 균수를 1.0×105 CFU/mL 농도로 조정한 후 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- CCMP 459, Thalassiosira weissflogii CCMP-1051, Tetraselmis suecica KMMCC P-9, Isochrysis galbana KMMCCH-2는 염도를 33‰로 조정한 F/2 배지(21)에서 6일간 배양하였다.
- 본 실험에서 사용된 미세조류는 강릉원주대학교 해양생물연구 교육센터에서 분양받았다. Chlorella vulgaris (Daesang Co., Ltd., Fresh water heterotrophic tank culture) 는 OECD medium (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan)에서 OECDguideline No. 201에 따라 6일간 배양하였다. Chaetoceros calcitrans KMMCC B-258, Nannochloropsis oculata KMMCC C-16, Pavlova sp.
- 항균활성 측정에 사용된 균주는 그람음성세균 2종 (Escherichia coli ATCC 11775, Salmonella Typhimurium KCCM 11862)과 그람양성세균 2종(Staphylococcus aureus ATCC 12692, Bacillus cereus ATCC 11778)이었다. 각 균주는 American Type Culture Collection (ATCC)과 Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM)에서 분양받아 사용하였다. 항균활성 측정에 사용된 모든 균주는 균배양액 1 mL를 9 mL의 brain heart infusion (BHI) broth (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에 접종하여 37oC에서 2회 계대배양 하였고, UV-분광광도계(spectrophotometer, UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 균수를 1.
- 본 실험에서 사용된 미세조류는 강릉원주대학교 해양생물연구 교육센터에서 분양받았다. Chlorella vulgaris (Daesang Co.
- 성분 분석에 사용한 컬럼은 SE-54 (30 m×0.25 mm I.D. 0.25 µm film thickness; HP-5MS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)이었으며, 운반기체는 헬륨가스를 사용하였다.
데이터처리
- 오븐온도는 40oC에서 2분간 유지 시킨 후, 5oC/min의 속도로 150oC까지 올리고 24분간 유지하였으며, 150oC에서 15oC/min의속도로 300oC까지 올린 후 10분간 유지하였다. 분석한 결과는 Wiley 7N Library를 이용하여 동정하였다.
이론/모형
- 미세조류 에탄올 추출물의 공시균주에 대한 최소저해농도는 broth dilution method를 사용하여 측정하였다(23). 미세조류 에탄올 추출물을 membrane filter로 멸균한 다음 BHI broth로 0.
- 미세조류 에탄올 추출물의 항균활성 유무를 paper disk diffusion method로 측정하였다(22). 공시균주의 배양액(1.
- 25 µm film thickness; HP-5MS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)이었으며, 운반기체는 헬륨가스를 사용하였다. 주입구 온도를 250oC로 하여 splitless mode 주입방법을 사용하였다. 오븐온도는 40oC에서 2분간 유지 시킨 후, 5oC/min의 속도로 150oC까지 올리고 24분간 유지하였으며, 150oC에서 15oC/min의속도로 300oC까지 올린 후 10분간 유지하였다.
- 최소살균농도는 streak plate method를 사용하여 측정하였다(24). 최소저해농도 전후 농도의 배양액을 백금이로 취하여 각각 BHA plate에 streak하고, 37oC에서 48시간 배양한 후, 균이 증식하지 않는 최소농도를 최소살균농도로 설정하였다.
성능/효과
- cereus에 대한 항균활성의 유무를 disk diffusion method로 측정한 결과는 Table 1과 같다. 4종류의 미세조류 에탄올 추출물은 공시균주 모두에 대해 항균활성을 나타내었으며, 12.25-15.75 mm의 inhibition zone을 나타내었다. Mixed A, C, vulgaris, C, calcitrans의 추출물은 E.
- 4종류의 미세조류 에탄올 추출물의 공시균주에 대한 최소살균농도를 Table 3에 나타내었다. 4종류의 미세조류 추출물은 2.50-10.00 mg/mL의 최소살균농도를 나타내었으며, C. vulgaris 추출물의 항균활성(최소살균농도, 2.50-5.00)이 가장 강한 것으로 나타났다. C.
- cereus)에 대하여 paper disk diffusion assay, MIC, MBC를 측정하였다. 4종류의 미세조류 추출물은 공시균주에 대하여 0.62-1.66 mg/mL의 MIC를 나타내었으며, C. vulgaris 추출물이 4종의 공시균주에 대한 MIC 가 0.62 mg/mL로 가장 강한 항균활성을 나타내었으며, MBC 또한 C. vulgaris 에탄올 추출물이 E. coli에 대해 2.50 mg/mL, S. aureus, B. cereus와 S. Typhimurium에 대해서는 4.16-5.00 mg/mL 로 가장 강한 항균활성을 나타내었다.
- 공시균주에 대한 4종류의 미세조류 에탄올 추출물의 최소저해농도는 Table 2와 같다. 4종류의 미세조류 추출물은 공시균주에 대하여 0.62-1.66 mg/mL의 MIC를 나타내었으며, C. vulgaris 추출물이 4종의 공시균주에 대한 최소저해농도가 0.62 mg/mL로 가장 강한 항균활성을 나타내었다. 그 다음이 C.
- 2와 Table 4에 나타내었다. C. vulgaris 에탄올 추출물의 성분 분석 결과, 동정된 화합물은 모두 9종이었고(Fig. 2), 동정된 성분 중에서 함량이 가장 많은 성분은 9,12-octadecadienoic acid (linoelaidic acid, peak 5, 7)로 38.8%이었으며, 그 다음이 2-Hexadecen-1-o1, 3,7,11,15-tetramethyl (phytol, peak 2,6)로 30.0%이었다.
- 75 mm의 inhibition zone을 나타내었다. Mixed A, C, vulgaris, C, calcitrans의 추출물은 E. coli에 대하여 보다 강한 항균활성을 나타내었으며, 그 중 C. vulgaris 추출물의 E. coli에 대한 inhibition zone이 15.75 mm로 가장 강한 항균활성을 나타내었다. 이러한 결과는 미세조류의 항균물질에 관한 연구에서 유기용매 추출물이 수용성 추출물보다 항균활성이 높게 나타났다는 보고(26)와 극성이 다른 3 종류의 유기용매 중 에탄올 추출물의 항균활성이 가장 강하다고 보고한 연구(25-27)와 유사하였다.
- 본 연구에서 C. vulgaris로부터 에탄올로 추출한 추출물에서 가장 함량이 많은 것으로 동정된 옥타데카다이엔산(octadecadienoic acid)는 일명 리노엘라이드산(linoelaidic acid)로 탄소수 18개의 고도불포화지방산인 것과 두 번째로 함량이 많은 피톨(Phytol)은 클로로필을 구성하는 불포화 제1급 알코올의 일종으로서 엽록소의 한 성분이며, 병원성 대장균 및 황색포도상구균에 항균활성을 나타내는 것으로 보고된(39) 것으로 볼 때, 이 2가지 성분이 항균 활성의 주성분인 것으로 사료된다. 또한 따라서 미세조류인 C.
- 항균활성 측정에 사용된 균주는 그람음성세균 2종 (Escherichia coli ATCC 11775, Salmonella Typhimurium KCCM 11862)과 그람양성세균 2종(Staphylococcus aureus ATCC 12692, Bacillus cereus ATCC 11778)이었다. 각 균주는 American Type Culture Collection (ATCC)과 Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM)에서 분양받아 사용하였다.
- 항균활성이 가장 강한 C. vulgaris 에탄올 추출물의 성분을 분석한 결과, 함량이 가장 많은 성분은 9,12-octadecadienoic acid (linoelaidic acid, peak 5, 7)로 38.8%이었으며, 그 다음이 2-Hexadecen-1-o1, 3,7,11,15-tetramethyl (phytol, peak 2,6)로 30.0%이었다. Octadecadienoic acid는 일명 linoelaidic acid로 탄소수 18개의 고도불포화지방산이며, 두 번째로 함량이 많은 Phytol은 클로로필을 구성하는 불포화 제1급 알코올의 일종으로서(엽록소의 구성 성분) 병원성 대장균 및 황색포도상구균에 항균활성을 나타낸다는 보고로 볼 때, 이 2가지 성분이 항균활성의 주성분인 것으로 사료된다.
후속연구
- vulgaris로부터 에탄올로 추출한 추출물에서 가장 함량이 많은 것으로 동정된 옥타데카다이엔산(octadecadienoic acid)는 일명 리노엘라이드산(linoelaidic acid)로 탄소수 18개의 고도불포화지방산인 것과 두 번째로 함량이 많은 피톨(Phytol)은 클로로필을 구성하는 불포화 제1급 알코올의 일종으로서 엽록소의 한 성분이며, 병원성 대장균 및 황색포도상구균에 항균활성을 나타내는 것으로 보고된(39) 것으로 볼 때, 이 2가지 성분이 항균 활성의 주성분인 것으로 사료된다. 또한 따라서 미세조류인 C. vulgaris의 에탄올 추출물은 항균활성이 강한 고도불포화지방산과 엽록소를 함유하고 있어 천연식품보존료로서의 이용이 가능할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.