[논문]면역유도누에 추출물을 이용한 병원성 대장균의 불활성화

박종우; 정찬영; 이창훈; 강상국; 주완택; 김성완; 김남숙; 김기영

doi:10.5352/jls.2021.31.8.755

면역유도누에 추출물을 이용한 병원성 대장균의 불활성화
Inactivation of Pathogenic Escherichia coli Using Crude Extract of Immunized Silkworm 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.8, 2021년, pp.755 - 760

박종우 (국립농업과학원 농업생물부) , 정찬영 (국립농업과학원 농업생물부) , 이창훈 (국립농업과학원 농업생물부) , 강상국 (국립농업과학원 농업생물부) , 주완택 (국립농업과학원 농업생물부) , 김성완 (국립농업과학원 농업생물부) , 김남숙 (국립농업과학원 농업생물부) , 김기영 (국립농업과학원 농업생물부)

초록
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돼지 설사병은 부종병과 함께 양돈 농가에 막대한 경제적 손실을 입히는 가축질병으로 알려져 있으며, 병원성 대장균의 증식에 의하여 설사 및 대장균 생성 독소에 의한 부종병이 동반된다. 본 연구에서는 항균펩타이드를 포함하는 면역유도누에의 조추출물을 이용하여 돼지 설사 및 부종을 유발하는 F4+ 및 F18ab+ 대장균의 사균체를 제작하고 사균백신으로서 이용가능성을 검토하였다. 면역유도누에 추출물의 항균활성을 환확산법을 통해 분석한 결과 F4+ 및 F18ab+ 대장균에 대하여 높은 활성을 나타내었으며, 평판계수법을 이용하여 대장균의 사균체 생산효율을 분석한 결과 50 mg/ml의 농도를 4℃에서 처리했을 때 가장 높게 나타났다. 또한 제작된 사균체에 대해서 투과전자현미경을 이용하여 분석한 결과 세포질은 유출되고 세포막만이 남아있는 대장균이 확인되었다. 따라서 면역유도누에 추출물을 이용하여 제작된 F4+ 및 F18ab+ 대장균은 부종병 예방을 위한 사균백신으로서 이용가능성이 매우 높을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Swine diarrhea is a livestock disease that causes huge economic losses to pig farms. In general, diarrhea occurs because of the proliferation of pathogenic Escherichia coli (E. coli). The toxins produced by the proliferated E. coli cause edema in pigs. Although the proliferation of these coliforms can be prevented by using a vaccine, the vaccines containing chemically produced dead bacteria are not very effective, making it difficult to control the proliferation of E. coli. Therefore, there is a need to develop new, more effective vaccines. In this study, we prepared killed F4+ and F18ab+ E. coli, which induce diarrhea and edema in pigs, using the extracts of immune-induced silkworms containing antimicrobial peptides and examined their availability as a killed-bacteria vaccine. First, the antimicrobial activity analysis of the prepared immune-induced silkworm extract was conducted using the radial diffusion assay. The results showed high activity against both F4+ and F18ab+ E. coli. The production efficiency of E. coli dead cells was determined using the colony-counting method. The concentration of the E. coli dead cells was the highest (50 mg/ml) when treated at 4℃. In addition, the analysis of the prepared dead cells using a transmission electron microscope confirmed that E. coli leaked out of the cytoplasm and the cell membrane remained intact. Therefore, F4+ and F18ab+ E. coli produced using immune-induced silkworms extract are considered to be highly available as bacterial ghost vaccines that can help prevent swine diarrhea and the resulting edema.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. Primers used in RT-PCR
그림 Fig. 1. Relative gene expression of antimicrobial peptide genes in immune-induced silkworm. RNA was extracted from the silkworms, followed by (A) quantitative real time PCR and (B) reverse transcriptase PCR to check the expression of antimicrobial peptide genes. GAPDH was used as a control for normalization. Data is shown as mean ± SD, n = 3.
그림 Fig. 2. Antimicrobial activity of immune-in-duced silkworm extract against F4+ and F18ab+ E. coli.
표 Table 2. Changes in viable bacteria following treatment with immune-induced silkworm extract for 12 hr
그림 Fig. 3. Antimicrobial activity analysis of IBM. (A-C) A Colony forming of live F4+ E. coli were counted in no treated control, 50 mg/ml IBM, and 50 mg/ml IBM with 1% CHX were treated for 24 hr, respectively. (D) The number of E. coli colonies was counted according to (A-C). Data are shown as mean ± SD of three experiments and were analyzed by one-way ANOVA, *p<0.05 relative to the no treated control. IBM, immune-induced Bombyx mori extract; CHX, Chlorhexidine digluconate.
그림 Fig. 4. Transmission electron microscopy image of F4+ and F18ab+ E. coli cells after incubation with or without immune- induced silkworm extract. Scale bar 0.2 μm.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 식품 첨가제 및 건강기능식품으로 이용되는 N-acetyl-D-glucosamine을 면역유도제로 이용하여 누에 항균펩타이드의 발현량을 증가시키고, 항균펩타이드가 포함된 누에 추출물을 제작하여 돼지에서 부종병을 유발하는 병원성 대장균의 불활성화 및 사균백신으로서 이용가능성에 대하여 알아보고자 하였다.

제안 방법

또한 세포의 불활성화 여부를 확인하기 위하여 사균체 원액과 10배 단계 희석액 각각 100 μl를 고체 배지 도말 후 배양하고 생균수를 분석하였다.
면역유도누에 추출물 처리 후 생균수가 감소하였으나 모든 균이 사멸되지는 않아 이를 백신 또는 사료첨가제 형태로 이용하기 위해서는 생균에 의한 감염예방을 위하여 잔존 생균에 대한 불활성화 절차가 필요하다고 판단하고, 면역유도누에 추출물을 24시간 처리한 F4+ 대장균 희석액에 CHX를 처리하여 배양 검사 및 생균수를 분석하였다(Fig. 3).
면역유도누에 추출물을 제작하기 위하여, 건조된 면역유도 누에 30 g을 믹서기(Hanil, Korea)를 이용하여 분쇄하고 300 ml의 0.3% acetic acid (Duksan, Korea)를 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 교반 후 95℃에서 10분간 열처리를 하였다. 이후 원심분리기(Tomy, Japan)를 이용하여 4℃에서 10, 000 ×g로 40 분간 원심분리한 후 상등액을 수거하고, ammonium sulfate (Sigma, USA)를 60%까지 첨가하여 2시간 동안 교반하였다.

대상 데이터

실험에 사용한 누에는 휴면계통 보급 품종인 백옥잠(잠 123×124)을 이용하였으며, 누에 사육은 농촌진흥청 농업생물 부의 표준 사육기준(온도, 24~27℃, 습도, 70~90%) 준하여 신선한 뽕잎을 급여하고 25℃, 16L8D 조건에서 사육하였다

데이터처리

모든 실험결과는 평균값(mean value) ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, IBM SPSS Statistics 23 (IBM, USA)를 이용한 일원 배치 분산분석(Oneway Analysis of Variance; ANOVA)을 실시하고, 각 평균값의 유의성(p<0.05)은 Duncan’s multiple rage test를 실시하여 검정하였다.

이론/모형

누에의 면역을 유도한 후 항균펩타이드 유전자 발현의 변화를 관찰하기 위하여, 일반 누에와 면역이 유도된 누에로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 total RNA 를 추출하였다. cDNA는 500 ng의 RNA와 PrimeScript 1st strand cDNA 합성 키트(TaKaRa, Japan)를 이용하여 합성 후 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 및 quantitative real time-PCR (qPCR)에 이용하였다. 항균펩타이드 유전자의 발현 분석을 위한 프라이머(Table 1)와 TB Green Premix EX Taq (TaKaRa, Japan)을 이용하여 qTOWER3 (Analytik Jena, Germany)를 통해 각 유전자를 증폭하고, BmGAPDH 유전자를 이용하여 각 시료의 표적 유전자 발현을 표준화하고 일반 누에를 기준으로 ddCt 방법을 이용하여 유전자의 발현을 비교하였다.
cDNA는 500 ng의 RNA와 PrimeScript 1st strand cDNA 합성 키트(TaKaRa, Japan)를 이용하여 합성 후 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 및 quantitative real time-PCR (qPCR)에 이용하였다. 항균펩타이드 유전자의 발현 분석을 위한 프라이머(Table 1)와 TB Green Premix EX Taq (TaKaRa, Japan)을 이용하여 qTOWER3 (Analytik Jena, Germany)를 통해 각 유전자를 증폭하고, BmGAPDH 유전자를 이용하여 각 시료의 표적 유전자 발현을 표준화하고 일반 누에를 기준으로 ddCt 방법을 이용하여 유전자의 발현을 비교하였다.

성능/효과

3). 그 결과, 면역유도 누에 추출물 처리 후 남아있던 생균은 CHX 처리에 의하여 완전히 사멸하여 생균이 관찰되지 않았다. 하지만 축산 시설에 대한 소독제로 이용되는 CHX 이용 시 제거 과정이 필요한 만큼 경구용 백신이나 사료첨가제에 이용하기에 적합하지 않은 만큼 추가적인 연구를 통해 열처리를 통한 잔존 생균의 불활성화 방법에 대해 논의해볼 필요가 있다고 판단된다.

후속연구

본 연구 결과와 같이 항균펩타이드가 포함된 조 추출물의 처리를 통해 병원성 대장균의 세포막과 표면의 항원을 보유한 불활성화 사균체 제작이 이루어 진다면, 돼지 부종병을 포함한 대장균성 가축 질병 예방을 위한 경구용 사균백신 또는사료첨가제 제작 기술로서 이용가치가 매우 높을 것으로 판단되며, 향후 추가적인 동물 적용 실험을 통해 세균성 질환의 예방 효과가 검증 된다면 경제적 가치가 매우 높을 것으로 기대된다.
그 결과, 면역유도 누에 추출물 처리 후 남아있던 생균은 CHX 처리에 의하여 완전히 사멸하여 생균이 관찰되지 않았다. 하지만 축산 시설에 대한 소독제로 이용되는 CHX 이용 시 제거 과정이 필요한 만큼 경구용 백신이나 사료첨가제에 이용하기에 적합하지 않은 만큼 추가적인 연구를 통해 열처리를 통한 잔존 생균의 불활성화 방법에 대해 논의해볼 필요가 있다고 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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