[논문]포도당으로 유도된 신경세포 손상에 대한 고사리 아세트산에틸 분획물의 개선 효과

박선경; 궈텐쟈오; 김종민; 강진용; 박상현; 강정은; 권봉석; 이창준; 이욱; 허호진

doi:10.9721/kjfst.2017.49.4.430

[국내논문] 포도당으로 유도된 신경세포 손상에 대한 고사리 아세트산에틸 분획물의 개선 효과
Ameliorating effect of the ethyl acetate fraction of Pteridium aquilinum on glucose-induced neuronal apoptosis 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.49 no.4, 2017년, pp.430 - 437

초록
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고사리(Pteridium aquilinum)의 4가지 분획물(n-헥산, 클로로포름, 아세트산에틸 및 증류수)의 총 페놀 함량은 아세트산에틸 분획물이 265.08 mg GAE/g으로 가장 높게 나타났으며, 라디칼 소거활성 및 지질 과산화 생성 억제효과 결과 또한 아세트산에틸 분획물의 활성이 가장 높게 나타났다. 고사리의 아세트산에틸 분획물은 알파-글루코시데이스에 대하여 뛰어난 억제활성($IC_{50}=205.26{\mu}g/mL$)을 나타내었으며, 억제 형태는 혼합형 제해 특성임을 확인하였다. 또한, PC12 신경세포에서의 고농도 포도당으로 유도된 산화적 스트레스에 대한 고사리 아세트산에틸 분획물은 세포 내 ROS 생성을 억제시키고, 세포 생존율을 증가 및 세포막 손상에 대한 보호효과를 나타내었다. 고사리 아세트산에틸 분획물의 주요 페놀성 화합물을 HPLC로 분석한 결과는 켐페롤-3-글루코사이드인 것으로 나타났다. 본 연구 결과를 종합해볼 때, 주요 페놀성 물질로서의 켐페롤-3-글루코사이드을 함유한 고사리 아세트산에틸 분획물은 소장 내 알파-글루코시데이스를 억제를 통한 혈당 강하 효과뿐만 아니라, 고농도 포도당으로 발생되는 산화적 스트레스에 대한 억제효과를 통하여 신경세포 사멸에 대한 효과적인 개선 효과를 갖는 고부가가치 자연 소재로의 활용가치가 높다고 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The protective effect of Pteridium aquilinum on high glucose-induced cytotoxicity was examined in vitro to investigate the relationship between diabetic condition and neuronal dysfunction. The ethyl acetate fraction of P. aquilinum (EFPA), with total phenolic content of 265.08 mg gallic acid equivalent/g, showed higher 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)/2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging activities and lipid peroxidation inhibitory effect than any other fraction. In addition, EFPA showed a significant reduction in the inhibitory effect on ${\alpha}$-glucosidase activity ($IC_{50}$ value=$205.26{\mu}g/mL$) compared to the acarbose positive control. The anti-oxidative effect in PC12 cells, protective effects on high glucose-induced oxidative stress in neuronal cells, and neurotoxicity were measured using 2',7'-dichlorofluorescin diacetate, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide, and lactate dehydrogenase assays, respectively. EFPA showed conspicuous inhibitory effect on cellular reactive oxygen species production and neuronal cell apoptosis. Finally, kaempferol-3-glucoside was identified as the main phenolic compound of EFPA using high performance liquid chromatography.

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AI 본문요약
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문제 정의

특히, 플라보노이드 계열의 물질들에 대한 항산화 활성에 대한 연구 및 단백다당류의 면역 활성에 관한 연구들이 주를 이루어 진행되고 있으며, 항당뇨에 대한 생리활성연구는 아직 부족한 실정이다(10-12). 따라서 본 연구는 고사리를 활용하여 알파 글루코시데이스 억제효과 및 고농도 포도당으로 유도된 산화적 스트레스에 의한 신경세포 보호 효과를 확인하고, 고사리에 존재하는 주요 생리활성 물질의 분석을 통하여, 자연 자원 유래 기능성 식품 소재로서의 활용 가능성을 연구하고자 하였다.
그렇기 때문에 지질 과산화물을 측정하는 것은 단백질 손상 등의 척도뿐만 아니라 신경세포 손상의 척도로도 판단될 수 있다(23). 따라서 본 연구에서는 마우스 뇌 신경세포막으로부터 추출한 지질성분에 대한 지질 과산화 중간생성물인 MDA 생성 억제효과를 측정함으로써 고사리의 지질과산화 생성 억제효과를 살펴보았다(Fig. 3). 고사리 모든 분획물에서 뛰어난 지질 과산화 억제 효과를 나타냈으며, 농도 500 μg/mL에서 n-헥산 분획물(76.

제안 방법

ABTS 라디칼 소거 활성은 1.0 mM 2,2'-azobis-(2-amidinopropane)-HCl (AAPH)와 2.5 mM ABTS를 150 mM NaCl이 더해진 100 mM 인산완충용액(phosphate buffered saline, pH 7.4)와 함께 혼합하여 68℃ water bath에서 30분 동안 열을 가한 후, 약 24시간 방치 후 실험에 사용하였다.
상기 환경에서 사육한 ICR 마우스의 뇌를 적출하여, 10 volumes의 ice cold 20 mM 트리스-염산 완충용액(Tris-HCl buffer, pH 7.4)를 균질화 시켜 원심분리(6,000×g,10분)하여, 지질성분을 추출하였다.
시료 용액 20 μL에 ABTS 용액 980 μL를 vortex mixer로 균일하게 혼합한 후, 37℃에서 10분 반응시켜 734 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다(14).
, Cambridge, UK)를 이용하여 측정하였다. 측정된 흡광도는 gallic acid 보정선을 이용하여 총 페놀성 화합물 함량을 계산하였다(13).
9 mL를 가한 후 균일하게 혼합하여, 실온에서 30분간 방치한 후 분광광도계를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 사용한 비타민 C를 기준물질로 사용하여 시료와의 항산화력을 비교하였다(14).
지질 과산화물(malondialdehyde, MDA) 생성 억제효과는 Chang 등(15)의 방법을 변형하여 측정하였다. ICR 마우스(수컷, 4주령)를 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입 한 후,항온(22±2℃), 항습(50-55%)을 유지하며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 환경에서 사육하였다(경상대학교 동물실험 인가번호 GNU-131105-M0067).
알파 글루코시데이스 억제효과는 Watanbe 등(16)의 방법을 변형하여 이용하였으며, 시료용액과 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH6.9) 및 0.5 U/mL 알파 글루코시데이스 효소용액을 혼합하여 37℃에서 10분간 반응하였다. 배양 후, 5 mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (50 μL)를 가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 405 nm에서 마이크로플레이트 판독기(microplate reader) (model 680, Biorad, Tokyo, Japan)로 흡광도를 측정하였다.
분석 조건 중 컬럼(column)은 C18 컬럼(250×4.6 mm, 5.0 μm, ZORBAX Eclipse Plus C18, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였다,이동상은 0.1% 폼산(formic acid)을 함유한 증류수(A) 및 0.1% 폼산을 함유한 메탄올(B)을 이용하였으며, 조성비 %B(분)는 0-25%(0-5분), 25-35%(5-20분), 35-90%(20-35분)으로 총 35 분간 분석하였다.
예비 배양 후, 10 μM DCF-DA를 넣어 50분 동안 처리 후, 모든 용액을 제거하고 PBS (100 μL)를 첨가하여, 최종적으로 형광 마이크로플레이트 판독기(Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)를 사용하여 485 nm (excitation wave)와 535 nm(emission wave)에서 형광수준(flourescence level)을 측정하였다(18).
실험 방법은 PC12 세포(5,000 cell/well)를 24시간 동안 배양한 후, 시료 40 μL를 30분 동안 배양한 후에, 대조구(5 mM)를 제외한 그룹에 50 mM 포도당을 24시간 동안 예비 배양하였다(17).
시료의 이동상 유속은 1 mL/min, 주입량은 20 μL, UV 검출 장치의 파장은 270 nm에서 다이오드검출기(diode array detector)로 분석하였다.
시료와 포도당을 PC12 세포에 24시간 동안 예비배양 후, MTT 스톡용액(stock solution)을 처리하여, 3시간 동안 배양하였다. 3시간 후, 모든 용액을 제거한 후 DMSO를 첨가하여 반응을 종결시키고, 흡광도는 마이크로플레이트 판독기에서 570 nm (determination wave)와 660 nm (reference wave)에서 측정하였다(19).
고사리 아세트산에틸 분획물의 신경세포막 보호효과를 측정하기 위하여, 시료와 포도당을 PC12 세포에 48시간 동안 예비배양 후, 배지로 방출된 락트산 수소제거효소(lactate dehydrogenase,LDH) 함량을 측정하였다. LDH 함량은 LDH cytotoxicity assay kit (Dogen, Seoul, Korea)을 이용하였다.
고사리 아세트산에틸 분획물의 신경세포막 보호효과를 측정하기 위하여, 시료와 포도당을 PC12 세포에 48시간 동안 예비배양 후, 배지로 방출된 락트산 수소제거효소(lactate dehydrogenase,LDH) 함량을 측정하였다. LDH 함량은 LDH cytotoxicity assay kit (Dogen, Seoul, Korea)을 이용하였다.
고사리의 주요 생리활성물질은 HPLC (Ultramate 3000 series,Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석 조건 중 컬럼(column)은 C₁₈ 컬럼(250×4.
30 %)와 유사한 MDA 생성 억제효과를 보였다. 고사리 분획물의 효과적인 라디칼 소거활성 및 지질 과산화물 생성 억제효과는 인체 내 활성산소를 조절함으로써 혈당 상승 조건에서 나타날 수 있는 다양한 질병(당뇨성 합병증 등) 예방 등에 도움을 줄 수 있는 소재로 유추되며, 이후의 실험은 항산화 활성이 가장 높게 나타난 아세트산에틸 분획물을 이용하여 진행하였다.
26μg/mL으로 대조구인 아카보스(acarbose)보다 상대적으로 우수하였다. 더불어 고사리 아세트산에틸 분획물의 알파-글루코시데이스에 대한 억제특성을 알아보고자 기질의 농도에 따른 고사리 아세트산에틸 분획물을 농도별로 첨가하여 억제패턴을 분석하였으며, 그 결과는 Lineweaver-Burk plot을 사용하여 나타내었다(Fig. 4(B)).

대상 데이터

PC12 세포를 25 mM 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 25 mM HEPES, 10% 소태아혈청,50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된RPMI 1640 배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
ICR 마우스(수컷, 4주령)를 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입 한 후,항온(22±2℃), 항습(50-55%)을 유지하며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 환경에서 사육하였다(경상대학교 동물실험 인가번호 GNU-131105-M0067).
본 실험에 사용한 고사리는 제주도에서 2014년 10월 수확된 고사리를 구매한 뒤 냉장보관(4℃)하여 사용하였다. 2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic-acid) (ABTS), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), trichloroacetic acid, 2',7'-dichloro-fluoresceindiacetate (DCF-DA), glucose, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zoliumbromide (MTT), lactate dehydrogenase (LDH) assay kit은 Sigma-Aldrich Chemical Co.
(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)와 HEPES 및 나머지 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. 제품을 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 신경세포는 마우스의 pheochromocytoma에서 유도된 PC12 세포(KCLB 21721, Korean Cell Line Bank, Seoul,Korea)를 실험에 사용하였다. PC12 세포를 25 mM 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 25 mM HEPES, 10% 소태아혈청,50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된RPMI 1640 배지에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

데이터처리

각각의 평균에 대한 검증 방법은 SAS version 9.1 software (SAS institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)를 실시하였고, Duncan의 다중범위검정법(Duncan's multiple range test)으로 각 시료의 유의적인 차이를 5% 수준에서 검증하여 나타내었다.

이론/모형

알파 글루코시데이스 억제패턴 분석은 고사리 아세트산에틸 분획물(62.5, 125, and 500 μg/mL)을 인산완충용액(pH 6.8)에 기질인 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (1.25, 2.5, 5, 10, 20 mM)와 반응성을 통하여, 알파 글루코시데이스에 대한 억제 형태를 측정하였으며, 그 결과는 Lineweaver-Burk plot 방법으로 나타내었다(7).
세포 내 산화적 스트레스 생성 억제효과는 DCF-DA 방법으로 측정하였다. 실험 방법은 PC12 세포(5,000 cell/well)를 24시간 동안 배양한 후, 시료 40 μL를 30분 동안 배양한 후에, 대조구(5 mM)를 제외한 그룹에 50 mM 포도당을 24시간 동안 예비 배양하였다(17).
PC12 세포에 대한 세포생존율은 MTT reduction 방법을 이용하였다. 시료와 포도당을 PC12 세포에 24시간 동안 예비배양 후, MTT 스톡용액(stock solution)을 처리하여, 3시간 동안 배양하였다.

성능/효과

농축된 추출물은 3차 증류수로 300 mL로 정용한 후, 1:1의 비율로 n-헥산, 클로로폼 및 아세트산에틸 용매 순으로 분획하여 냉동건조 후, −20 ℃에 보관하면서 실험에 사용하였다. n-헥산, 클로로폼, 아세트산에틸 및 증류수 분획물의 추출 수율은 1.2, 0.64, 0.98% 및 2.88%로 각각 나타났다.
이러한 결과는 ABTS assay의 경우, 친수성 물질과 친유성 물질 모두에 적용이 가능하고, DPPH assay의 경우 소수성 물질에 적용이 가능하기 때문이며, 또한, 총 페놀 화합물 함량과 ABTS/DPPH assay간의 Spearmans-Rho 계수를 비교 하였을 경우, ABTSassay는 ρ=0.949, DPPH assay는 ρ=0.897으로 ABTS assay에서의 상관 관계가 높은 것으로 나타났다.
최적의 추출 조건을 확립하기 위하여, 60% 에탄올 및 4가지 분획물(n-헥산, 클로로포름, 아세트산에틸 및 증류수)의 총 페놀성 화합물 함량을 측정한 결과, 60% 에탄올 추출물에서 105.33mg gallic acid equivalent (GAE)/g, n-헥산 63.41 mg GAE/g, 클로로포름 29.91 mg GAE/g, 아세트산에틸 265.08 mg GAE/g, 증류수 139.42 mg GAE/g으로 각각 나타냈으며, 아세트산에틸 분획물에서 가장 높은 총 페놀성 화합물 함량을 나타내었다(Fig. 1).
2(B)와 같다. 모든 분획물은 농도가 증가함에 따라 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 나타내었지만, 대부분 20% 이하의 결과로 ABTS 라디칼 소거활성보다 다소 낮은 결과값을 나타내었다. Floegal 등(14)의 연구에 따르면 일반적으로 항산화능이 높다고 평가되는 과일류 18종, 채소류 13종을 대상으로 ABTS/DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, DPPH 라디칼 소거활성 대비 ABTS 라디칼 소거활성에서 뛰어난 항산화능을 나타냈으며, ABTS assay가 다양한 식품에서의 항산화능을 평가하는데 적절하다고 보고하였다.
897으로 ABTS assay에서의 상관 관계가 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과를 종합해 볼 때,고사리에서의 뛰어난 ABTS 라디칼 소거활성은 고사리에 포함되어 있는 페놀성 화합물에 의한 결과로 판단되며, 그 중 친수성 물질들이 많이 존재 함에 따라 DPPH 라디칼 소거활성이 다소 낮게 나타난 것으로 판단된다. Yi와 Lim(9)의 연구에 따르면, 건조된 제주도 고사리의 아세트산에틸 분획물에서 다른 분획물(헥산, 아세트산에틸, 부탄올 및 물) 대비 뛰어난 ABTS 라디칼과DPPH 라디칼 소거활성 및 산소라디칼흡수능력분석(oxygen radical absorbance capacity assay) 등에서 뛰어난 항산화 활성을 나타내었다.
고사리 모든 분획물에서 뛰어난 지질 과산화 억제 효과를 나타냈으며, 농도 500 μg/mL에서 n-헥산 분획물(76.16%), 아세트산에틸 분획물(78.34%), 증류수 분획물(75.50%)은 양성 대조군으로 사용된 카테킨(catechin) 100 μg/mL (75.30 %)와 유사한 MDA 생성 억제효과를 보였다.
고사리 아세트산에틸 분획물의 농도가 증가함에 따라 억제효과가 증가함을 확인 할 수 있었으며, IC50값은 205.26μg/mL으로 대조구인 아카보스(acarbose)보다 상대적으로 우수하였다.
따라서 고사리 아세트산에틸 분획물 또한 아카보스의 IC50=216.38 μg/mL (data not shown) 값과 비교하였을 경우, 상대적으로 뛰어난 억제활성을 나타냈으며, 아카보스의 간 독성과 같은 부작용을 나타내는 기존제재를 대체할 수 있는 안전한 자연소재 유래 혈당 강하제로의 개발 가능성이 높을 것으로 사료된다.
고사리 아세트산에틸 분획물 20 μg/mL 이하의 농도에서는 신경세포막 손상에 대한 보호효과를 나타내지 못하였으나, 그 이상의 농도 특히 100 μg/mL 농도에서는 양성 대조군보다 유의적으로 우수한 신경세포막 보호효과를 확인할 수 있었다.
고사리 아세트산에틸 분획물을 처리한 군(5-100 μg/mL)은 고농도 포도당 처리군 대비 상대적으로 높은 PC12 신경 세포 생존율을 나타내었으며, 특히 50, 100 μg/mL 농도에서는 양성대조군과 유사한 생존율을 나타내었다.
고사리 아세트산에틸 분획물 처리 군에서는 10-100 μg/mL 농도에서 양성 대조군인 비타민 C와 유사한 세포 내 산화적 스트레스 함량을 나타냄에 따라 뛰어난 신경 세포 내 산화적 스트레스 생성억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
고농도의 포도당에 의해 발생되는 산화적 스트레스로 인한 포도당독성(glucotoxicity)은 세포의 손상을 유발하게 되어 당뇨 합병증을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 특히 다가 불포화지방산이 풍부하지만 항산화 효소의 활성이 낮은 뇌조직에서 지질과산화를 유발하게 되고, 유리기의 연쇄 반응에 뇌 신경세포 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다(24). 따라서, 고사리 아세트산에틸 분획물의 고농도 포도당으로 유발된 산화적 스트레스에 대한 PC12 신경세포 내 산화적 스트레스 생성억제효과와 신경세포 보호 효과를 확인하였다.
5(A)에 나타내었다. 고농도 포도당(50 mM) 처리군(122%)에서는 대조군(100%) 대비 형광 강도가 22% 증가하였으며, 양성 대조군으로 사용된 비타민 C 군에서는 82%로 약 40% ROS 생성 억제효과를 나타냈다. 고사리 아세트산에틸 분획물 처리 군에서는 10-100 μg/mL 농도에서 양성 대조군인 비타민 C와 유사한 세포 내 산화적 스트레스 함량을 나타냄에 따라 뛰어난 신경 세포 내 산화적 스트레스 생성억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
5(B)와 같다. 고농도 포도당(50 mM) 처리 군(67.01%)에서는 대조군(100%) 대비 약 33% 감소된 세포 생존율을 나타냈고, 비타민 C를 처리한 군에서는 114.87%의 신경세포 생존율을 보였다. 고사리 아세트산에틸 분획물을 처리한 군(5-100 μg/mL)은 고농도 포도당 처리군 대비 상대적으로 높은 PC12 신경 세포 생존율을 나타내었으며, 특히 50, 100 μg/mL 농도에서는 양성대조군과 유사한 생존율을 나타내었다.
5(C)와 같다. 고농도 포도당(50 mM) 처리 군의 LDH 방출량은 81% 정도로 대조군(63%) 대비 약 20% 정도 증가하였으며, 양성 대조군으로 사용된 비타민 C는 약 44%로 방출량이 40% 정도 감소됨을 나타내었다. 고사리 아세트산에틸 분획물 20 μg/mL 이하의 농도에서는 신경세포막 손상에 대한 보호효과를 나타내지 못하였으나, 그 이상의 농도 특히 100 μg/mL 농도에서는 양성 대조군보다 유의적으로 우수한 신경세포막 보호효과를 확인할 수 있었다.
켐페롤-3-글루코사이드의 함량은 건조중량 mg당 137.94±3.55 μg/mg으로 확인되었으며,아세트산에틸 분획물의 수율(0.98%) 대비 건조된 고사리 원물에서의 켐페롤-3-글루코사이드 함량은 건조중량 mg당 1.35±0.03 μg/mg으로 추정된다(Table 1).
57분에서 확인된 피크는 표준물질 켐페롤-3-글루코사이드(kaempferol-3-glucoside) (Fig. 6(A))의 retention time (29.53 분)과 UV-VIS spectrum (similarity: 999.56)을 비교하였을 때 고사리 아세트산에틸 분획물의 크로마토그램(chromatograms)과 일치하는 것으로 확인되었다(Fig. 6(B)).
03 μg/mg으로 추정된다(Table 1). 또한, 켐페롤-3-글루코사이드 함량은 총 페놀성 화합물 함량(265.08 mg GAE/g) 대비 약 52%에 해당하는 함량으로 고사리 아세트산에틸 분획물의 페놀성 화합물 중 켐페롤-3-글루코사이드가 가장 많은 함량을 차지하는 것으로 판단된다.
고사리(Pteridium aquilinum)의 4가지 분획물(n-헥산, 클로로포름,아세트산에틸 및 증류수)의 총 페놀 함량은 아세트산에틸 분획물이 265.08 mg GAE/g으로 가장 높게 나타났으며, 라디칼 소거활성 및 지질 과산화 생성 억제효과 결과 또한 아세트산에틸 분획물의 활성이 가장 높게 나타났다. 고사리의 아세트산에틸 분획물은 알파-글루코시데이스에 대하여 뛰어난 억제활성(IC₅₀=205.
고사리의 아세트산에틸 분획물은 알파-글루코시데이스에 대하여 뛰어난 억제활성(IC50=205.26 μg/mL)을 나타내었으며, 억제 형태는 혼합형 제해 특성임을 확인하였다.
26 μg/mL)을 나타내었으며, 억제 형태는 혼합형 제해 특성임을 확인하였다. 또한, PC12 신경세포에서의 고농도 포도당으로 유도된 산화적스트레스에 대한 고사리 아세트산에틸 분획물은 세포 내 ROS 생성을 억제시키고, 세포 생존율을 증가 및 세포막 손상에 대한 보호효과를 나타내었다. 고사리 아세트산에틸 분획물의 주요 페놀성 화합물을 HPLC로 분석한 결과는 켐페롤-3-글루코사이드인 것으로 나타났다.
또한, PC12 신경세포에서의 고농도 포도당으로 유도된 산화적스트레스에 대한 고사리 아세트산에틸 분획물은 세포 내 ROS 생성을 억제시키고, 세포 생존율을 증가 및 세포막 손상에 대한 보호효과를 나타내었다. 고사리 아세트산에틸 분획물의 주요 페놀성 화합물을 HPLC로 분석한 결과는 켐페롤-3-글루코사이드인 것으로 나타났다. 본 연구 결과를 종합해볼 때, 주요 페놀성 물질로서의 켐페롤-3-글루코사이드을 함유한 고사리 아세트산에틸 분획물은 소장 내 알파-글루코시데이스를 억제를 통한 혈당 강하 효과뿐만 아니라, 고농도 포도당으로 발생되는 산화적 스트레스에 대한 억제효과를 통하여 신경세포 사멸에 대한 효과적인 개선 효과를 갖는 고부가가치 자연 소재로의 활용가치가 높다고 판단된다.
뿐만 아니라, 이러한 결과는 제주산 식용 고사리의 항산화 활성은 총페놀 함량의 관계에서 밀접한 상관관계를 나타낸다고 보고하였으며, 결과적으로 페놀성 화합물이 중요하게 작용할 것으로 보고 하였다. 이러한 연구 결과를 고려할 때, 본 in vitro 실험에서의 고사리 분획물 또한 아세트산에틸 분획물에서 가장 높은 총페놀 함량과 가장 높은 라디칼 소거 활성을 나타냄에 따라 고사리 아세트산에틸 분획물에 함유되어 있는 페놀성 화합물에 의한 효과일 것으로 판단된다.

후속연구

퇴행성 뇌신경질환은 대부분산화적 스트레스에 의한 뇌신경 세포의 사멸에 의해 발생되며, 자연 항산화제인 플라보노이드를 포함한 페놀성 화합물들의 신경세포 보호 효과가 우수한 것으로 보고되고 있다(22,25,26). 이러한 결과를 통하여 볼 때, 고사리 아세트산에틸 분획물의 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과 역시 고사리 아세트산에틸 분획물에 포함된 페놀성 화합물들에 의한 결과로 추정되며, 고혈당으로 유도될 수 있는 포도당독성으로 발생될 수 있는 뇌 신경질환에 있어 신경세포 보호효과를 나타낼 수 있는 잠재적인 물질을 포함하고 있을 것으로 사료된다.
이러한 결과들을 종합해 볼 때, 켐페롤-3-글루코사이드를 포함하고 있는 고사리 아세트산에틸 분획물은 알파 글루코시데이스 억제 효과에 의한 자연 혈당 강하제로서의 개발 가능성과 고농도 포도당에 의하여 발생 될 수 있는 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호 효과를 확인함으로써, 당뇨병성 뇌 신경병증과 같은 2차 합병증에 대한 예방 효과를 가질 수 있을 것이라고 사료된다. 다만, 고사리에 존재할 수 있는 캠페롤 이외의 페놀성 화합물들에 의한 효과를 배제할 수 없으므로 보다 구체적인 물질 분석 및 in vivo 당뇨 model의 혈당강하 효과와 당뇨성 인지기능 저하에 대한 개선효과 검증과 같은 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
이러한 결과들을 종합해 볼 때, 켐페롤-3-글루코사이드를 포함하고 있는 고사리 아세트산에틸 분획물은 알파 글루코시데이스 억제 효과에 의한 자연 혈당 강하제로서의 개발 가능성과 고농도 포도당에 의하여 발생 될 수 있는 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호 효과를 확인함으로써, 당뇨병성 뇌 신경병증과 같은 2차 합병증에 대한 예방 효과를 가질 수 있을 것이라고 사료된다. 다만, 고사리에 존재할 수 있는 캠페롤 이외의 페놀성 화합물들에 의한 효과를 배제할 수 없으므로 보다 구체적인 물질 분석 및 in vivo 당뇨 model의 혈당강하 효과와 당뇨성 인지기능 저하에 대한 개선효과 검증과 같은 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
고사리 아세트산에틸 분획물의 주요 페놀성 화합물을 HPLC로 분석한 결과는 켐페롤-3-글루코사이드인 것으로 나타났다. 본 연구 결과를 종합해볼 때, 주요 페놀성 물질로서의 켐페롤-3-글루코사이드을 함유한 고사리 아세트산에틸 분획물은 소장 내 알파-글루코시데이스를 억제를 통한 혈당 강하 효과뿐만 아니라, 고농도 포도당으로 발생되는 산화적 스트레스에 대한 억제효과를 통하여 신경세포 사멸에 대한 효과적인 개선 효과를 갖는 고부가가치 자연 소재로의 활용가치가 높다고 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	당뇨병 환자 치료를 위해 사용하는 혈당 강하제는 무엇인가?	그렇기 때문에 혈당 상승으로 유발될 수 있는 다양한 합병증들의 예방을 위하여 산소유리기와 같은 산화적 스트레스를 제거를 위한 항산화 물질을 섭취하는 것도 매우 중요한 것으로 알려져 있다(3,6). 현재 혈당 강하제로 사용 되고 있는 알파 글루코시데이스(α-glucosidase) 억제제(acarbose, migiltol 등) 또는 인슐린 감수성 촉진 약제(metformin, thiazolidinedione 등)가 사용되고 있으며, 젖산축적, 신부전증, 간 독성과 같은 부작용을 나타냄에 따라 보다 안전하고 뛰어난 효과를 나타낼 수 있는 자연물 소재로부터의 연구가 요구되고 있는 실정이다(1,7,8).
	당뇨병은 무엇인가?	당뇨병은 고혈당을 수반하는 질환으로써, 인슐린의 합성 억제나 저항성에 의하여 발생되는 탄수화물 대사장애로 알려져 있다(1). 포도당은 포유동물의 뇌가 정상적인 기능을 유지하기 위한 필수적인 에너지원이지만(2), 과도한 포도당은 체내에서 알데하이드(aldehyde)기를 쉽게 카복실(carboxyl)기로 산화시키고, 이러한 당들은 자동산화(autoxidation)나 단백질당화(protein glycosylation) 반응에 의하여 superoxide (O2-), 과산화수소(hydrogen peroxide,H2O2)와 같은 반응성이 높은 활성산소종(reactive oxygen species,ROS) 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(3).
	고사리의 대표적 생리활성물질은 무엇인가?	고사리(Pteridium aquilinum)는 열대 지방에서부터 온대 지방에 이르기까지 전세계적으로 분포되어 있는 가장 흔한 식물 중 하나로 우리나라에서는 제주도뿐만 아니라 경남 남해, 전북 남원,강원도 고성 등 널리 재배 되고 있다(9,10). 고사리의 대표적인 생리활성을 나타내는 물질로는 플라보노이드(flavonoids), 테페노이드(terpenoids), 스테로이드(steroids), 프테로신(pterosins) A 및 B와 같은 물질들이 보고되어 있다(6). 특히, 플라보노이드 계열의 물질들에 대한 항산화 활성에 대한 연구 및 단백다당류의 면역 활성에 관한 연구들이 주를 이루어 진행되고 있으며, 항당뇨에 대한 생리활성연구는 아직 부족한 실정이다(10-12).

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