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문제 정의
- . 본 연구에서는 센나엽 전탕액을 1주일간 투여한 다음 주 등18)의 방법을 응용한 비허점수 평가를 통해 비허 유발 여부를 평가하였다. 모든 실험동물에서 비허기준을 충족시킨 유발 농도로서 저농도 750mg/kg과 고농도 1,000mg/kg를 도출하여(Fig.
- 이러한 아토피 피부염의 변증유형 발생에서 비허(脾虛)는 매우 중요한 역할을 하는데 『素問·至眞要大論』10)에서 “諸濕腫滿 皆屬於脾”라 하여 脾가 정상적 생리기능을 잃으면(脾失健運) 습열이 생겨 피부에 영향을 끼친다고(蘊聚肌膚) 하였고, 『難經·二十二難』11)에서 “血主潤之”라 하여 비허로 생화지원(生化之源)이 결핍되어 혈허(血虛)가 오래되면 화조생풍(化燥生風)하여 피부를 자윤(滋潤)하지 못하고 병변을 일으킬 수 있다는 근거를 제시함으로써 脾와 피부의 밀접한 상호 관계를 설명할 수 있다. 이에 한의학 원리에 더욱 충실한 연구의 기반을 마련하고자 아토피 피부염의 한의학적 주요 특성인 비허 양상을 반영하는 동물모델을 개발하고자 하였다.
- 의 방법에 따라 센나엽(Senna leaves) 전탕액을 투여하여 사하(瀉下)를 유도하고 비허점수에 따라 비허 유발을 확인한 다음 제모한 실험동물의 등 피부에 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB) 용액을 도포하여 피부염을 유발하였다. 피부염 수치, 혈액학적 검사, 혈청생화학검사, 염증세포에 대한 형광유세포분석, 관련 cytokine에 대한 real-time PCR 검사를 시행하여 비허를 유발하지 않은 시험군 및 양성대조군과 비교하여 비허형 아토피 동물모델의 제작 기술을 탐색함으로써 한의학 특성을 반영하는 아토피 피부염 기초연구에 도움이 되고자 한다.
제안 방법
- A score of spleen deficiency was defined as the sum of the individual scores graded as table 1. ICR mice were divided into five groups and were orally administered PBS, or SFE(250, 500, 750, 1000 mg/kg) for one week. (One-way ANOVA test ***P <0.
- A total clinical index of dermatitis severity was defined as the sum of the individual scores graded as follows:0(none), 1(mild), 2(moderate),and 3(severe) for each of five signs and symptoms(erythema/hemorrhage, edema/hematoma, excoriation/erosion, itching/dryness, and lichenification(thickness of the skin)). NC/Nga mice were divided into five groups and were orally administered PBS, dexamethasone(3 mg/kg) or SFE(750, 1000 mg/kg) for one week. The dorsal skin of these groups was treated with 1%, 0.
- NC/Nga 마우스의 등을 귀 하단에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모하고 24시간 방치 후 1%, 0.2% 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB; Sigma-Aldrich, USA) 용액(아세톤:올리브오일=3:1)을 도포하여 유발하였다. 실험군은 아무런 처치도 시행하지 않은 정상군(이하 정상군), 단순 아토피 피부염 대조군(이하 대조군),dexamethasone(Dexa; 3mg/kg) 투여 양성대조군(이하 양성대조군), 센나엽추출물 1,000mg/kg와 750mg/kg를 1주일간 경구 투여한 비허 아토피 피부염 고농도군(이하 비허 고농도군), 비허 아토피 피부염 저농도군(이하 비허 저농도군)으로 나누었다(Fig.
- NC/Nga 생쥐의 혈장을 분리하여 mouse IgE ELISA kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 ELISA를 시행하였다. 먼저, coating antibody를 microplate에 100 ㎕ 씩 분주하고 4℃에서 24시간 두었다.
- cDNA와 IL-4, IL-13, TNFα, TGF-β, glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase(GAPDH) primer를 적정 농도로 각각 희석하여 넣고 Power SYBR®Green PCR Master Mix와 TaqMan®Gene Expression Master Mix시약을 이용하여 real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) system으로 분석하였다.
- 평가항목은 홍반(erythema), 가려움과 피부건조(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoriation), 짓무름(erosion), 그리고 태선화(lichenification)이다. 각각의 항목에 대해 중상 없음(0점), 증상 약함(1점), 보통(2점), 심함(3점)으로 채점한 후 5항목의 점수를 합산함으로써 최소 0점(아무 증상 없는 상태)에서 최고 15점(모든 항목의 증상이 심한 상태) 사이의 평가 점수를 부여하였으며, 실험동물이 긁는 횟수(scratching behavior)는 20분 동안 관찰하였으며, 일주일에 한번, 일정한 시간에 측정하였다.
- 비허 유발여부를 객관적으로 판단하기 위하여 주 등(Zhu HW 등)의 방법을 변형한 평가기준(Table 1)에 따라 비허점수를 부여하여 대변, 식이, 체중 중 2개 이상 양성이면서 기타 증상이 4개 이상 양성이면 비허가 유발된 것으로 평가하였다.
- 비허 유발을 위한 적정 농도를 확인하기 위하여 ICR 마우스에 센나엽추출물을 250, 500, 750, 1,000mg/kg의 농도로 1주일간 경구 투여하였다. 피부염 모델에서 비허를 유발할 농도를 결정하고 치사율 및 간독성 등을 평가하였다.
- 비허를 유발하기 위하여 NC/Nga 마우스에 센나엽 전탕액을 투여하고 피부염을 유발하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 생쥐로부터 각각 피부를 적출하여 세포를 분리하고, staining buffer에 anti-CD3, CD4, CD8, CD11b, Gr-1를 넣어 각각 4℃에서 30분 동안 반응시킨 뒤 Cell-Quest software를 사용하여 유세포 분석기(FACScan analyzer; BD Biosciences, San Jose, CA)를 통해 분석하였다.
- 2% 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB; Sigma-Aldrich, USA) 용액(아세톤:올리브오일=3:1)을 도포하여 유발하였다. 실험군은 아무런 처치도 시행하지 않은 정상군(이하 정상군), 단순 아토피 피부염 대조군(이하 대조군),dexamethasone(Dexa; 3mg/kg) 투여 양성대조군(이하 양성대조군), 센나엽추출물 1,000mg/kg와 750mg/kg를 1주일간 경구 투여한 비허 아토피 피부염 고농도군(이하 비허 고농도군), 비허 아토피 피부염 저농도군(이하 비허 저농도군)으로 나누었다(Fig. 1).
- 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐의 IL-4, IL-13, TNF α, TGF-β mRNA 발현에 영향의 정도를 파악하기 위하여 dorsal skin에서 얻은 세포 내 RNA를 분리하고 cDNA를 제조하여 real-time PCR 방법으로 mRNA 발현 정도를 측정하였다.
- 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐의 dorsal skin 내 면역세포 변화에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위해 실험 종료 후 생쥐를 치사한 뒤 dorsal skin 내 면역세포를 염색하여 FACS로 분석하였다. 면역기전에 중요한 T세포를 나타내는 CD4+/CD8+세포와 과립구세포인 CD11b+/Gr-1+ 세포는 정상군에 비해 대조군에서 증가 하였으며, 양성대조군에서 대조군보다 유의하게 감소를 보였고, 비허 고농도군에서 대조군보다 증가 양상을 보였으나 유의하지는 않았다(Fig.
- 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐의 혈청 내 IgE 생성에 영향정도를 알아보기 위해 실험 종료 후 생쥐를 치사하여 혈액을 얻은 뒤 원심 분리하여 혈청에 있는 IgE를 ELISA 방법으로 측정하였다. 정상군과 비교하여 대조군에서는 IgE의 생산이 5배 가량 증가하여 생성되었고, 비허 고농도군과 저농도군 모두에서 대조군보다 유의하게 증가된 양상을 보였다.
- 일정량의 NC/Nga 생쥐의 등 피부조직을 분리하여 Trizol을 1㎖넣고 homogenizer로 잘게 분쇄한 다음 Chloroform을 100 ㎕ 넣었다. 얼음에 10분 동안 두고 13,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 하였다.
- 비허 유발을 위한 적정 농도를 확인하기 위하여 ICR 마우스에 센나엽추출물을 250, 500, 750, 1,000mg/kg의 농도로 1주일간 경구 투여하였다. 피부염 모델에서 비허를 유발할 농도를 결정하고 치사율 및 간독성 등을 평가하였다.
- 피부염 수치는 아토피피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가방법을 사용하여 아토피피부염의 심각성 정도를 다음 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총합으로 나타내었다. 평가항목은 홍반(erythema), 가려움과 피부건조(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoriation), 짓무름(erosion), 그리고 태선화(lichenification)이다.
대상 데이터
- 본 실험 사용한 IgE ELISA kit는 R&D systems(USA), Real Time PCR 실험시에 사용한 Trizol(Ambion, USA), Chloroform, isopropanol, ethanol(Sigma-Aldrich), diethylpyrocarbonate-treated water(DEPC-water; Invitrogen, USA), PrimeScript™RT reagent kit(TaKaRa, Shiga, Japan), Power SYBR®Green PCR Master Mix와 TaqMan®Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems, USA), real-time polymerase chain reaction(realtime PCR) system (Applied Biosystems, USA) 등을 사용하였다.
- 비허유발에 사용된 센나엽은 허브스토리메디신(Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 센나엽 300 g에 70% 에탄올 10배를 가하여 환류 추출기에서 2시간 동안 2회 가열하여 얻은 액을 여과하였다. 이를 감압 증류장치(Buchi B-480, Switzerland)로 농축하고, 다시 동결 건조기(Eyela FDU-540, Japan)를 이용하여 완전 건조한 추출물을 냉동(-84℃) 보관하면서 사용하였다.
- 실험에 사용한 동물은 NC/Nga 7주령 수컷 생쥐(오리엔트바이오, Korea)로서 물과 고형 사료를 제약 없이 섭취하도록 하였으며, 22-24℃ 의 온도와 50±10%의 습도가 유지되고, 밤낮 주기(12시간 주/야)가 조절되는 조명을 갖춘 실험실 환경에서 사육하였다.
데이터처리
- 실험 집단 간 수치 데이터는 각 실험군 결과 값은 mean ±standard deviation (SD)으로 나타내었으며, 동물실험에서는 SPSS 11.0 software (IBM-SPSS Inc., Chicago, IL)를 이용하여 일원배치 분산분석(One-way analysis of variance; ANOVA) 후에 Duncan’s multiple comparison tests로 유의성을 검증하였고, 세포실험에서는 독립표본 T-검정(independent samplesT-test)을 이용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 비허를 유발하기 위하여 NC/Nga 마우스에 곡 등12)의 방법에 따라 센나엽(Senna leaves) 전탕액을 투여하여 사하(瀉下)를 유도하고 비허점수에 따라 비허 유발을 확인한 다음 제모한 실험동물의 등 피부에 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB) 용액을 도포하여 피부염을 유발하였다. 피부염 수치, 혈액학적 검사, 혈청생화학검사, 염증세포에 대한 형광유세포분석, 관련 cytokine에 대한 real-time PCR 검사를 시행하여 비허를 유발하지 않은 시험군 및 양성대조군과 비교하여 비허형 아토피 동물모델의 제작 기술을 탐색함으로써 한의학 특성을 반영하는 아토피 피부염 기초연구에 도움이 되고자 한다.
성능/효과
- Fig. 3A은 유발 후 피부염유발 정도와 개선 정도를 나타내주는 사진으로, 대조군, 비허 고농도군 및 비허 저농도군에서 홍반, 피부건조, 부종, 짖무름, 태선화 등의 증상이 확인되었고, 양성대조군은 대조군에 비해서 그 증상이 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있었다. Fig.
- 3A은 유발 후 피부염유발 정도와 개선 정도를 나타내주는 사진으로, 대조군, 비허 고농도군 및 비허 저농도군에서 홍반, 피부건조, 부종, 짖무름, 태선화 등의 증상이 확인되었고, 양성대조군은 대조군에 비해서 그 증상이 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있었다. Fig. 3B는 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에서 피부염 지수에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위해 피부염의 중증도를 점수화하여 측정한 결과로, 유발 후 정상군에 비해 대조군, 비허 고농도군 및 비허 저농도군의 피부염 지수가 증가하는 것으로 확인되었으며, 비허 고농도군과 비허 저농도군 모두 대조군보다 단순 아토피 피부염유발군에서 경구투여 농도의존적으로 피부염 지수가 더 높은 수치를 보였다.
- 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐의 IL-4, IL-13, TNF α, TGF-β mRNA 발현에 영향의 정도를 파악하기 위하여 dorsal skin에서 얻은 세포 내 RNA를 분리하고 cDNA를 제조하여 real-time PCR 방법으로 mRNA 발현 정도를 측정하였다. 그 결과 양성대조군에서는 대조군에 비하여 IL-4를 제외한 모든 항목에서 유의하게 발현을 억제하였고, 비허 고농도군과 저농도군에서는 대조군에 비하여 유의한 발현 증가가 나타났다(Fig. 7).
- 등피부조직 세포에서 IL-4, IL-13, TNF-α, TGF-β mRNA 발현은 대조군에 비하여 비허유발군에서 유의하게 증가하였다.
- 정상군과 비교하여 대조군에서는 IgE의 생산이 5배 가량 증가하여 생성되었고, 비허 고농도군과 저농도군 모두에서 대조군보다 유의하게 증가된 양상을 보였다. 또한, dexamethasone을 투여한 양성대조군에서 IgE의 생성이 유의하게 억제되었음을 알 수 있었다.
- 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐의 dorsal skin 내 면역세포 변화에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위해 실험 종료 후 생쥐를 치사한 뒤 dorsal skin 내 면역세포를 염색하여 FACS로 분석하였다. 면역기전에 중요한 T세포를 나타내는 CD4+/CD8+세포와 과립구세포인 CD11b+/Gr-1+ 세포는 정상군에 비해 대조군에서 증가 하였으며, 양성대조군에서 대조군보다 유의하게 감소를 보였고, 비허 고농도군에서 대조군보다 증가 양상을 보였으나 유의하지는 않았다(Fig. 5, 6).
- 본 연구에서는 센나엽 전탕액을 1주일간 투여한 다음 주 등18)의 방법을 응용한 비허점수 평가를 통해 비허 유발 여부를 평가하였다. 모든 실험동물에서 비허기준을 충족시킨 유발 농도로서 저농도 750mg/kg과 고농도 1,000mg/kg를 도출하여(Fig. 2), 이를 아토피 피부염 모델에 적용한 결과 관능평가에서 대조군, 비허유발군 모두에서 홍반, 피부건조, 부종, 짖무름, 태선화 증상이 확인되었으며, 피부염 지수는 대조군에 비하여 비허유발군에서 유의하게 증가하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 위장관 이상 증상과 아토피 피부염의 중증도와의 연관성은 밝혀지지 않고 있으나19) 음식 알레르기가 있으면 성인 시기 아토피 피부염 발병의 위험을 높인다고 알려져 있으며20), 아토피 피부염 환자의 사상체질 분포 중 비위허약(脾胃虛弱)한 체질인 소음인(少陰人)의 비율이 가장 높이 것으로 나타나21) 아토피 피부염의 발생에서 비위허약(脾胃虛弱)의 상태가 중요한 조건이 될 수 있음을 알 수 있다.
- 본 실험의 dorsal skin에서 IL-4, IL-13, TNF-α, TGF-β의 mRNA 발현이 비허유발군에서 대조군에 비하여 유의한 발현 증가가 나타나(Fig. 7) 비허 조건이 관련 사이토카인의 증가를 통해 피부증상을 더욱 증가시킬 가능성을 시사하였다.
- 또한 아토피 피부염의 알레르기 반응에서 주요한 역할을 하는 호산구에서 CD11b 분자가 과발현되는 것으로 알려져 있으며29), CD11b+/Gr-1+ 세포로서 호중구는 피부의 기계적 손상에서 leukotrien 증가에 중요한 역할을 한다30). 본 실험의 병변 유발부위인 dorsal skin에서 T세포의 양상을 보여주는 CD4+/CD8+세포와 과립구세포인 CD11b+/Gr-1+ 세포는 정상군에 비해 대조군과비허유발군에서 증가하는 것으로 나타나(Fig. 5, 6) 아토피 피부염의 이러한 병리기전이 반영됨을 보여주었다
- 80±1.30으로 나타나 농도의존적으로 증가하였고, 비허 기준에 부합하는 개체수의 비율은 750 및 1,000 mg/kg 투여군에서만 100%로 나타났다(Fig. 2)
- 비허 판단의 기준으로 정한 평가기준을 토대로 센나엽 추출물 투여에 따른 비허점수를 평가한 결과 정상군의 2.00±0.71에 비하여 250, 500, 750, 1,000 mg/kg 투여군에서 각각 8.00±2.35, 11.40±1.67, 17.60±0.89, 18.80±1.30으로 나타나 농도의존적으로 증가하였고, 비허 기준에 부합하는 개체수의 비율은 750 및 1,000 mg/kg 투여군에서만 100%로 나타났다(Fig. 2)
- 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐의 혈청 내 IgE 생성에 영향정도를 알아보기 위해 실험 종료 후 생쥐를 치사하여 혈액을 얻은 뒤 원심 분리하여 혈청에 있는 IgE를 ELISA 방법으로 측정하였다. 정상군과 비교하여 대조군에서는 IgE의 생산이 5배 가량 증가하여 생성되었고, 비허 고농도군과 저농도군 모두에서 대조군보다 유의하게 증가된 양상을 보였다. 또한, dexamethasone을 투여한 양성대조군에서 IgE의 생성이 유의하게 억제되었음을 알 수 있었다.
- 이를 감압 증류장치(Buchi B-480, Switzerland)로 농축하고, 다시 동결 건조기(Eyela FDU-540, Japan)를 이용하여 완전 건조한 추출물을 냉동(-84℃) 보관하면서 사용하였다. 최종적으로 센나엽 초기 약재로부터 68g의 추출물을 얻어 22.67%의 수율을 나타내었다. 얻어진 분말은 –80℃에 분주하여 보관하였고 사용하기 전 증류수 또는 식염수로 희석하여 필터 후 사용하였다.
- 피부염 점수는 대조군에 비하여 비허유발군에서 유의하게 증가하였다.
후속연구
- 특히 습열형에 손 등13)은 비위기허(脾胃氣虛)로 운화기능(運化機能)이 실조되어 습열이 발생하는 허증이 포함되어 있다고 하였고, 소화불량, 복부창만의 증상이 있거나 기름진 음식을 좋아하는 경우, 비만, 음식알레르기 등을 동반하는 아토피 피부염을 비위기허로 인한 습열로 분류하는 연구들14,15)이 보고되고 있어 아토피 피부염의 발생에 비위(脾胃)가 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있다. 따라서 비허 양상을 반영하는 아토피 피부염 동물모델을 개발하는 것이 한의학 원리에 기반한 아토피 피부염 연구에 중요한 연구방법을 제공할 것으로 판단되었다.
- 본 연구는 우리나라에서 아토피 피부염을 대상으로 변증유형을 반영하는 동물모델을 개발하고자 하는 첫 시도라는 측면과 일반 아토피 피부염 동물모델에 비하여 아토피 피부염 양상을 더욱 현저하게 나타내는 결과를 얻었다는 점에서 의의가 있으나 이러한 결과가 성공적인 비허 모델 제작을 전적으로 입증한다고 보기는 어렵다. 피부염 발생 실험군 중 비허유발군의 저농도군과 고농도군에서 비허와 관련되는 지표들을 평가하지 못하였다는 한계가 있으며 비허에 적용할 수 있는 단미 약재 또는 처방을 통하여 추가적인 검증이 필요하다고 판단된다. 향후 이를 보완하여 더욱 확립된 비허형 아토피 피부염 동물모델이 구축된다면 기존 아토피 치료 한약 효능의 객관적 근거를 더욱 확고히 할 수 있을 뿐만 아니라 한의학 이론에 입각한 새로운 한약치료제의 개발에 유용하게 활용될 것으로 사료된다.
- 피부염 발생 실험군 중 비허유발군의 저농도군과 고농도군에서 비허와 관련되는 지표들을 평가하지 못하였다는 한계가 있으며 비허에 적용할 수 있는 단미 약재 또는 처방을 통하여 추가적인 검증이 필요하다고 판단된다. 향후 이를 보완하여 더욱 확립된 비허형 아토피 피부염 동물모델이 구축된다면 기존 아토피 치료 한약 효능의 객관적 근거를 더욱 확고히 할 수 있을 뿐만 아니라 한의학 이론에 입각한 새로운 한약치료제의 개발에 유용하게 활용될 것으로 사료된다.
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