본 연구에서는 해양미세조류 A. carterae의 기능성 평가를 위해 에탄올 추출을 하였고, 기존의 건강기능성식품인 클로렐라를 에탄올 추출하여 기능성을 비교하였다. 클로렐라 에탄올 추출물(CE)과 A. carterae 에탄올 추출물(AE)의 총페놀성 화합물은 각각 47.39 mg/g과 8.88 mg/g 으로 CE가 5.33배 높았으나, DPPH 라디컬소거능은 22.42%와 20.16%로 비슷한 수준이었다. 반면에 CE와 AE의 ABTS 라디컬 소거능은 각각 28.58%와 17.69%로 CE가 높아 CE의 항산화능은 페놀성 화합물의 효과로 판단된다. AE(10 mg/mL)의 항균활성은 그람음성균 6종과 그람양성균 10종에서 확인하였다. 그리고 CE(10 mg/mL)의 항균활성은 그람음성균 3종과 그람양성균 3종에서 확인되었다. ${\alpha}$-glucosidase의 억제활성은 AE($500{\mu}g/mL$)에서 82.07%이었고, CE는 효소활성을 촉진하는 것으로 나타났다. 암세포 생장억제활성은 $125{\mu}g/mL$ 농도의 AE를 첨가했을 때, HepG2와 HT-29의 생존율이 각각 38%와 11.27%이었다. $31.25-125{\mu}g/mL$의 농도범위에서 CE 첨가가 HepG2와 HT-29의 생장을 촉진하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과를 종합하면, A. carterae 에탄올 추출물은 페놀성 화합물 이외의 항산화 물질을 보유하고, 항균활성, 항당뇨효과와 암세포 억제활성이 우수한 기능성 물질을 함유하고 있는 것으로 판단되어 기능성 소재로써의 활용가치가 높을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 해양미세조류 A. carterae의 기능성 평가를 위해 에탄올 추출을 하였고, 기존의 건강기능성식품인 클로렐라를 에탄올 추출하여 기능성을 비교하였다. 클로렐라 에탄올 추출물(CE)과 A. carterae 에탄올 추출물(AE)의 총페놀성 화합물은 각각 47.39 mg/g과 8.88 mg/g 으로 CE가 5.33배 높았으나, DPPH 라디컬소거능은 22.42%와 20.16%로 비슷한 수준이었다. 반면에 CE와 AE의 ABTS 라디컬 소거능은 각각 28.58%와 17.69%로 CE가 높아 CE의 항산화능은 페놀성 화합물의 효과로 판단된다. AE(10 mg/mL)의 항균활성은 그람음성균 6종과 그람양성균 10종에서 확인하였다. 그리고 CE(10 mg/mL)의 항균활성은 그람음성균 3종과 그람양성균 3종에서 확인되었다. ${\alpha}$-glucosidase의 억제활성은 AE($500{\mu}g/mL$)에서 82.07%이었고, CE는 효소활성을 촉진하는 것으로 나타났다. 암세포 생장억제활성은 $125{\mu}g/mL$ 농도의 AE를 첨가했을 때, HepG2와 HT-29의 생존율이 각각 38%와 11.27%이었다. $31.25-125{\mu}g/mL$의 농도범위에서 CE 첨가가 HepG2와 HT-29의 생장을 촉진하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과를 종합하면, A. carterae 에탄올 추출물은 페놀성 화합물 이외의 항산화 물질을 보유하고, 항균활성, 항당뇨효과와 암세포 억제활성이 우수한 기능성 물질을 함유하고 있는 것으로 판단되어 기능성 소재로써의 활용가치가 높을 것으로 판단된다.
In this study, the antimicrobial, antioxidant activities and ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activities of Amphidinium carterae ethanol extract (AE) was evaluated for using as a functional food ingredient. Chlorella ethanol extract (CE) was used to the comparison as a control. Anticance...
In this study, the antimicrobial, antioxidant activities and ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activities of Amphidinium carterae ethanol extract (AE) was evaluated for using as a functional food ingredient. Chlorella ethanol extract (CE) was used to the comparison as a control. Anticancer activities of the AE and CE were analyzed by HepG2 and HT-29 human cancer cell. The AE showed antimicrobial activities for all tested bacterial strains. Whereas, CE showed antimicrobial activities for several tested bacterial strains only. The CE showed higher total phenolics contents, DPPH and ABTS radical-scavenging activities (47.36 mg/g, 22.42% and 28.58%, respectively) than those of AE (8.88 mg/g, 20.16% and 17.69%, respectively). AE showed anti-diabetic effect on ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activity with dose-dependantly manner. The cell viability of AE ($125{\mu}g/mL$) on HepG2 and HT-29 human cancer cells were 38.12% and 11.27%, respectively. It was demonstrated that ethanol was efficient solvent for extracting functional components from A. carterae. These results indicated that AE can be described as a good candidate for using as a functional food ingredient.
In this study, the antimicrobial, antioxidant activities and ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activities of Amphidinium carterae ethanol extract (AE) was evaluated for using as a functional food ingredient. Chlorella ethanol extract (CE) was used to the comparison as a control. Anticancer activities of the AE and CE were analyzed by HepG2 and HT-29 human cancer cell. The AE showed antimicrobial activities for all tested bacterial strains. Whereas, CE showed antimicrobial activities for several tested bacterial strains only. The CE showed higher total phenolics contents, DPPH and ABTS radical-scavenging activities (47.36 mg/g, 22.42% and 28.58%, respectively) than those of AE (8.88 mg/g, 20.16% and 17.69%, respectively). AE showed anti-diabetic effect on ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activity with dose-dependantly manner. The cell viability of AE ($125{\mu}g/mL$) on HepG2 and HT-29 human cancer cells were 38.12% and 11.27%, respectively. It was demonstrated that ethanol was efficient solvent for extracting functional components from A. carterae. These results indicated that AE can be described as a good candidate for using as a functional food ingredient.
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문제 정의
carterae와 클로렐라 에탄올 추출물을 동결건조하여 분말화하여, 항산화, 항균활성과 항당뇨 효과를 측정하였고, 그리고 암세포주를 이용한 항암활성 평가에 대해 농도의존성을 평가하였다. A. carterae 의 기능성 평가결과를 토대로 건강기능성 식품으로서 A.carterae 에탄올 추출물의 가능성을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.
본 연구에서는 건강기능식품의 소재로서 해양 미세조류인 A. carterae의 이용 가능성을 클로렐라와 비교하여 확인하고자 하였다. 이를 위해 A.
본 연구에서는 해양미세조류 A. carterae의 기능성 평가를 위해 에탄올 추출을 하였고, 기존의 건강기능성식품인 클로렐라를 에탄올 추출하여 기능성을 비교하였다. 클로렐라 에탄올 추출물(CE)과 A.
가설 설정
3)ND, not detected.
제안 방법
24시간 후 추출물 시료농도가 1 mg/mL가 되도록 DMEM 배지를 사용하여 제조한 후, 이를 단계적으로 희석(31.25, 62.5 와 125 μg/mL)하여 각각 100 μL씩 첨가하고 37℃로설정된 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였다.
암세포 생장억제능은 흡광도 측정결과를 아래의 식에 대입하여 세포 생존율로써 비교하였다. Blank는 시료액 대신 PBS를 사용하였고, control은 DMSO의 세포 생장 저해활성 고려하고자 시료액 대신 농도별 DMSO를 첨가하여 측정하였다.
DMEM 배지에 penicillin(100 U/mL), streptomycin(100 μg/mL) 그리고 FBS를 10%로 첨가하여 조제하고, 세포 현탁과 배양배지도 사용하였다.
이 반응액을 분광광도계(UV-1650PC, Shimadzu Co, Kyoto, Japan)를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하 였다. Gallic acid로 작성한 표준 검량곡선을 이용하여 시료의 흡광도로부터 총 페놀 함량(mg/g)을 구하였다.
Kano 등(16)의 방법을 일부 변형하여 미세조류 에탄올 추출물에 대한 DPPH 라디컬 소거능을 측정하였다. 시료 100 μL에 100 μM DPPH용액 2 mL를 첨가하여 암소에서 20분간 반응시킨 후에 515 nm에서 흡광도를 측정하였으며 비교구로는 ascorbic acid를 사용하였다.
미세조류 에탄올 추출물에 대한 항균활성은 paper disc 확산법으로 비교분석하였다. 각각의 추출물 시료를 DMSO 를 이용하여 100 mg/mL 농도로 stock solution을 조제한 후 일정한 농도범위로 희석하였다. 본 실험에 사용된 세균은 NB에 접종하여 37℃와 200 rpm에서 18시간 진탕 배양시켜 활성 시킨 후 멸균된 면봉을 사용하여 NA에 도말하였다.
그람음성세균 6종과 그람양성세균 10종이 도말된 배지에 추출물을 일정농도(1-10 mg/mL)로 분주하고 성장억제 능을 측정하여 미세조류 에탄올 추출물의 항균활성을 확인 하였다. Disc 주변으로 clear zone의 생성농도를 기록해 최소저해농도(MIC)로 하였고, 10 mg/mL의 농도로 희석된 추출물의 항균활성 결과는 Table 2와 같다.
25 M Na 2 CO 3 500 μL를첨가하여 반응을 종료시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구(control)는 시료(sample) 대신 증류수를 첨가하여 반응시켰다. 양성대조구로는 acarbose(100 μg)를 시료 대신 첨가해서 저해활성을 비교하였다.
미세조류 에탄올 추출물의 암세포 생장억제는 HepG2(간암 세포)와 HT-29(대장암 세포) 세포주의 세포 생존율을 측정하여 평가하였다. DMEM 배지에 penicillin(100 U/mL), streptomycin(100 μg/mL) 그리고 FBS를 10%로 첨가하여 조제하고, 세포 현탁과 배양배지도 사용하였다.
미세조류 에탄올 추출물의 항당뇨 효과(in vitro)를 분석하기 위해 AGI 활성을 측정하였고, 그 결과를 Fig. 1에 나타 내었다. α-glucosidase의 활성은 CE의 경우 검출 한계치가 100 μg/mL이었으며, 농도증가에 따라 효소의 활성이 촉진되는 것으로 분석되었다.
미세조류 에탄올 추출물의 항당뇨 효과는 α-glucosidase inhibition(AGI) 활성을 이용하였고, Lim 등(18)의 방법을 실험조건에 맞게 변형하여 사용하였다.
각각의 추출물 시료를 DMSO 를 이용하여 100 mg/mL 농도로 stock solution을 조제한 후 일정한 농도범위로 희석하였다. 본 실험에 사용된 세균은 NB에 접종하여 37℃와 200 rpm에서 18시간 진탕 배양시켜 활성 시킨 후 멸균된 면봉을 사용하여 NA에 도말하였다. 각 균이 도말된 NA 표면에 6 mm paper disc(ADVANTEC, Tokyo, Japan)을 올리고, 그 위에 시료를 20 μL 점적하여 37℃에서 18시간동안 정치 배양하였다.
1 N HCl을 10 μL 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포 생장억제능은 흡광도 측정결과를 아래의 식에 대입하여 세포 생존율로써 비교하였다. Blank는 시료액 대신 PBS를 사용하였고, control은 DMSO의 세포 생장 저해활성 고려하고자 시료액 대신 농도별 DMSO를 첨가하여 측정하였다.
양성대조구로는 acarbose(100 μg)를 시료 대신 첨가해서 저해활성을 비교하였다.
에탄올 추출은 A. carterae 및 클로렐라 분말에 10배의 95% 에탄올을 가한 후, 환류냉각기를 부착시킨 항온수조를 이용하여 1시간동안 70℃에서 가열추출 하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 각 추출물은 여과지 Whatman No.
, Maidstone, England)로 여과한 다음 rotatory vacuum evaporator로 감압농축한 후 동결건조하여 분말로 제조하였다. 이를 -70℃ 이하의 암소에 보관하면서 DMSO 에 녹여 시료를 제조하였으며 일정농도로 희석하여 항산화, 항균활성, 항당뇨 활성과 항암활성 측정을 위해 사용하였다. 각각의 추출물 시료는 chlorella ethanol extract(CE), A.
carterae의 이용 가능성을 클로렐라와 비교하여 확인하고자 하였다. 이를 위해 A. carterae와 클로렐라 에탄올 추출물을 동결건조하여 분말화하여, 항산화, 항균활성과 항당뇨 효과를 측정하였고, 그리고 암세포주를 이용한 항암활성 평가에 대해 농도의존성을 평가하였다. A.
각 균이 도말된 NA 표면에 6 mm paper disc(ADVANTEC, Tokyo, Japan)을 올리고, 그 위에 시료를 20 μL 점적하여 37℃에서 18시간동안 정치 배양하였다. 이후 paper disc 주위로 형성된 clear zone(mm)을 측정하여 항균력을 확인하였고, 항균활성이 확인되는 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하기 위해 추출물의 농도를 조정하여 점적한 후 clear zone의 생성여부을 확인하였다. Clear zone의 생성여부에 따라 최소저해농도를 결정하였다.
대상 데이터
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS(2,2-azinobis-3-ethylenebenzothiozoline-6-sulfonic acid), ascorbic acid, pyrogallol, gallic acid, Folin-Ciocalteau reagent, α-glucosidase, 4-PNP-glycoside(p-NPG; p-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside) 와 sodium carbonate등은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA), nutrient broth(NB)와 nutrient agar(NA) 등은 Difco사 (Difco, MD, USA)에서 구입하였고, 그리고 그 밖의 시약들은 analytical 및 HPLC grade를 사용하였다.
본 실험에서 사용된 A. carterae는 아쿠아진텍(Busan, Korea)으로부터 분양받아 동결 건조하여 분석시료로 하였다. 실험 비교군인 클로렐라 분말은 ㈜대상(Gunsan, Korea)의 제품을 구입하여, -20℃ 이하의 암소에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다.
세포활성평가를 위한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), penicillin-streptomycin, Fetal Bovine Serum(FBS)와 Phosphate Buffer Saline(PBS)는 Gibco/BRL사(Burlington, ON, Canada) 제품을 구입하였고, Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan)을 사용하였다.
carterae는 아쿠아진텍(Busan, Korea)으로부터 분양받아 동결 건조하여 분석시료로 하였다. 실험 비교군인 클로렐라 분말은 ㈜대상(Gunsan, Korea)의 제품을 구입하여, -20℃ 이하의 암소에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다. 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO;Daejung chemical, Gwangju, Korea)에 녹여 사용하였다.
미세조류 에탄올 추출물의 항당뇨 효과는 α-glucosidase inhibition(AGI) 활성을 이용하였고, Lim 등(18)의 방법을 실험조건에 맞게 변형하여 사용하였다. 추출물 시료는 각각 10 mg/mL의 농도로 DMSO에 용해하여 단계적으로 ddH 2 O로 희석(0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 와 1 mg/mL)하여 사용하였다. 준비된 시료 100 μL에 0.
실험 비교군인 클로렐라 분말은 ㈜대상(Gunsan, Korea)의 제품을 구입하여, -20℃ 이하의 암소에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다. 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO;Daejung chemical, Gwangju, Korea)에 녹여 사용하였다.
항균활성측정을 위한 미생물은 Escherichia coli 3종, Micrococcus luteous, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. cereus 4종과 Pseudomonas aeruginosa를 한국농업미생물자원센 터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC, Wanju, Korea)에서 분양받았으며, E. coli KCTC1039와 Klebsiella pneumoniae KCTC 2246를 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Jeongup, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 항암세포 활성 평가를 위한 세포주는 HepG2 (간암세포)와 HT-29(대장암세포)를 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
coli KCTC1039와 Klebsiella pneumoniae KCTC 2246를 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Jeongup, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 항암세포 활성 평가를 위한 세포주는 HepG2 (간암세포)와 HT-29(대장암세포)를 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
항온수조(TW-PC-1, Universal Scientific Industrial Co., Ltd., Shanghai, China), 회전증발 농축기(RV 10 basic, IKA, Staufen, Germany)과 동결건조기(Supermodulyo 220, Thermo Electron Co., Waltham, MA, USA)는 추출과 농축을 위하여 사용되었다.
데이터처리
각 시료간의 유의성은 p<0.05 수준 에서 one way ANOVA로 분산분석한 후에 Duncan's multiple range test로 비교하였다.
각 실험에서 얻은 결과는 SPSS package program(Ver.12.0K, SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료간의 유의성은 p<0.
이론/모형
Anesini(15)의 방법을 이용하여 미세조류 에탄올 추출물에 대한 총 페놀 함량(total phenolics content, TPC)을 측정하 였다. 시료 1 mL에 10% Folin-ciocalteu’s phenol reagent 5 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후에 7.
Li 등(17)의 방법을 이용하여 미세조류 에탄올 추출물에 대한 ABTS radical 소거능을 측정하였다. 시료 30 μL에 ABTS radical 용액 3 mL를 첨가하여 암소에서 6분간 반응 시킨 후에 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 비교구로는 ascorbic acid를 사용하였다.
미세조류 에탄올 추출물에 대한 항균활성은 paper disc 확산법으로 비교분석하였다. 각각의 추출물 시료를 DMSO 를 이용하여 100 mg/mL 농도로 stock solution을 조제한 후 일정한 농도범위로 희석하였다.
성능/효과
α-glucosidase의 억제활성은 AE(500 μg/mL)에서 82.07%이었고, CE는 효소활성을 촉진하는 것으로 나타났다.
31.25-125 μg/mL의농도범위에서 CE 첨가가 HepG2와 HT-29의 생장을 촉진하는 것으로 확인되었다.
HepG2의 세포생존율 결과(Fig. 2A)에 의하면 추출물을 녹이는데 사용된 DMSO는 생장에 억제작용을 하지 않았으며, CE의 경우 추출물 첨가농도의 범위 31.25에서 125 μg/mL까지 첨가량이 증가함에 따라 세포생장이 촉진되는 것으로 확인되었다.
carterae 에탄올 추출물의 기능성 평가(in vitro)결과 항산화활성, 항당뇨 효과와 암세포 증식저해 활성이 농도의존성으로 증가하였다. 그리고 본 연구에 사용된 모든 세균류에 대한 항균활성이 확인되었다. 따라서, A.
그리고 본 연구에 사용된 모든 세균류에 대한 항균활성이 확인되었다. 따라서, A. carterae의 기능성 물질이 에탄올에 용출됨을 확인하였고, 페놀성 화합물 이외의 지용성 물질의 성분이 기능성을 보이는 것으로 추정된다. A.
본 연구에 사용된 16종의 세균류는 면역이 저하된 환자나 균이 오염된 식품의 섭취 시 인체에 유해하며, 식품에 오염되면 품질저하를 일으킬 수 있어 제어가 필요한 균주이다. 따라서, 이들 세균에 대한 CE의 항균활성은 E. coli 3종과 S. aureus, B. subtilis, B. licheniformis에 대해 확인되었으나, AE의 항균활성은 B. licheniformis를 제외한 모든 실험균에서 CE의 활성보다 높게 나타났다.
carterae 의 안전성을 제시하였다. 따라서, 천연 항균물질을 탐색하는 연구에서 해양미세조류인 A. carterae 에탄올 추출물의 항균활성은 높은 기대가치가 있다고 판단된다.
반면, AE의 경우 첨가농도 62.5 μg/mL에서 생존율이 58%로 감소하였고, 125 μg/mL에서 38%로 유의 적으로 감소하여 간암세포(HepG2)의 생장이 억제됨을 보였다.
반면에 AE는 25-500 μg/mL에서 농도 의존적으로 효소억제활성이 증가하였으며, 500 μ g/mL 농도에서 AGI 활성은 82.07%으로 확인되었다.
이와 같은 결과를 종합해보면, A. carterae 에탄올 추출물의 기능성 평가(in vitro)결과 항산화활성, 항당뇨 효과와 암세포 증식저해 활성이 농도의존성으로 증가하였다. 그리고 본 연구에 사용된 모든 세균류에 대한 항균활성이 확인되었다.
33배 높았다. 클로렐라와 A. carterae 에탄 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성의 경우, 추출물의 첨가량이 1-6 mg/mL까지 증가함에 따라 농도 의존적으로 활성이 증가하였으나 CE와 AE의 최고 활성이 각각 22.42%와 20.16%이었고 다중검정의 결과 다른 그룹으로 분류되었다. ABTS 라디칼 소거능의 경우 CE와 AE의 최고활성이 각각 28.
한편 AE의 경우 추출물 첨가량이 증가함에 따라 125 μg/mL농도에서 생존률이 11.27% 로 확인됨에 따라 75.41%의 억제됨이 확인되었다.
후속연구
carterae의 기능성 물질이 에탄올에 용출됨을 확인하였고, 페놀성 화합물 이외의 지용성 물질의 성분이 기능성을 보이는 것으로 추정된다. A. carterae 에탄올 추출물의 기능성 물질 분리조건을 확립하는 지속적인 연구가 필요하다고 판단된다.
25-125 μg/mL의농도범위에서 CE 첨가가 HepG2와 HT-29의 생장을 촉진하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과를 종합하면, A.carterae 에탄올 추출물은 페놀성 화합물 이외의 항산화 물질을 보유하고, 항균활성, 항당뇨효과와 암세포 억제활성이 우수한 기능성 물질을 함유하고 있는 것으로 판단되어 기능성 소재로써의 활용가치가 높을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
미세조류란?
미세조류는 광합성을 하는 수중 단세포 생물로 일반적으로 식물성 플랑크톤이라고 불린다. 최근 국내외 연구에 의해 미세조류에는 당질, 지질, 색소, 비타민, 스테로이드와 기타 의약성분 등과 같은 다양한 생리활성물질들이 함유되어 있음이 밝혀졌다(1-3).
녹조류에 속하는 클로렐라의 이용현황은?
미세조류의 기능성에 대한 연구의 결과로 클로렐라는 면역력 증진(12)과 항산화(13)에 도움되는 기능성 식품원료로 등재되어 있고(14), 클로렐라 세포를 건조 분말화한 원말을 정제 또는 과립으로 가공한 것과 열수 추출물이 건강식품으로 이용되고 있다. A.
미세조류에 함유된 성분은?
미세조류는 광합성을 하는 수중 단세포 생물로 일반적으로 식물성 플랑크톤이라고 불린다. 최근 국내외 연구에 의해 미세조류에는 당질, 지질, 색소, 비타민, 스테로이드와 기타 의약성분 등과 같은 다양한 생리활성물질들이 함유되어 있음이 밝혀졌다(1-3). 해양 미세조류 중 녹조류 (cyanobacteria)에 속하는 클로렐라는 다량의 엽록소, 필수 아미노산, 비타민, 미네랄, 핵산과 불포화지방산이 함유되어있어 다양한 생리활성 효과가 있는 것으로 알려져 있다(4).
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