[논문]소 β-casein 유전자 영역에서 소 Insulin-like Growth Factor 1을 생산하기 위한 Knock-in Vector

김상영; 박다솜; 김세은; 구덕본; 강만종

doi:10.12749/rdb.2017.41.3.51

[국내논문] 소 β-casein 유전자 영역에서 소 Insulin-like Growth Factor 1을 생산하기 위한 Knock-in Vector
Knock-in Vector for Expression of Insulin-like Growth Factor 1 on the Bovine β-casein Gene Locus 원문보기

Reproductive & developmental biology = 한국동물번식학회지, v.41 no.3, 2017년, pp.51 - 55

김상영 (전남대학교 농업생명과학대학 동물자원학부) , 박다솜 (전남대학교 농업생명과학대학 동물자원학부) , 김세은 (전남대학교 농업생명과학대학 동물자원학부) , 구덕본 (대구대학교 공과대학 생명공학과) , 강만종 (전남대학교 농업생명과학대학 동물자원학부)

Abstract ▼ AI-Helper

The production of therapeutic protein from transgenic domestic animal is the major technology of biotechnology. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) is known to play an important role in the growth of the animal. The objective of this study is construction of knock-in vector that bovine IGF-1 gene is inserted into the exon 7 locus of ${\beta}$-casein gene and expressed using the gene regulatory DNA sequence of bovine ${\beta}$-casein gene. The knock-in vector consists of 5' arm region (1.02 kb), bIGF-1 cDNA, CMV-EGFP, and 3' arm region (1.81 kb). To express bIGF-1 gene as transgene, the F2A sequence was fused to the 5' terminal of bIGF-1 gene and inserted into exon 7 of the ${\beta}$-casein gene. As a result, the knock-in vector is confirmed that the amino acids are synthesized without termination from the ${\beta}$-casein exon 7 region to the bIGF-1 gene by DNA sequence. These knock-in vectors may help to create transgenic dairy cattle expressing bovine bIGF-1 protein in the mammary gland via the expression system of the bovine ${\beta}$-casein gene.

주제어

AI 본문요약
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81 kb fragment as the 3’ recombination arm. C) Targeted structure of knock-in vector by homologous recombination. The bIGF-1 transgene is expressed by β-casein gene regulatory DNA sequence and the mRNA is translated with β-casein by ribosome.

제안 방법

PCR은 합성한 cDNA 2 uL를 주형으로 사용하였고, KpnI 제한효소 site가 포함된 소 IGF-1 특이적 sense primer(GCGGTACCATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCCA A)와 XbaI 제한효소 site가 포함된 소 IGF-1 특이적 anti-sense primer(GCTCTAGACTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCT)를 이용하였으며, Ex Taq DNA polymerase(TAKARA, Japan)를 이용하여 증폭하였다. PCR 조건은 Ex Taq DNA polymerase를 이용하여 denaturation 94℃ 30초, annealing 58℃ 30초, extension 72℃ 1분을 1 cycle로 35 cycle을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 확인하였으며, 확인된 PCR 산물은 Gel Elution을 통해 정제한 후 Ligation mix (TAKARA, Japan)를 이용하여 pGEM T-easy 벡터(Promega Co, USA)에 클로닝하였다.
소 IGF-1 cDNA을 동정하기 위하여 다음과 같이 합성된 cDNA를 이용하여 PCR를 수행하였다. PCR은 합성한 cDNA 2 uL를 주형으로 사용하였고, KpnI 제한효소 site가 포함된 소 IGF-1 특이적 sense primer(GCGGTACCATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCCA A)와 XbaI 제한효소 site가 포함된 소 IGF-1 특이적 anti-sense primer(GCTCTAGACTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCT)를 이용하였으며, Ex Taq DNA polymerase(TAKARA, Japan)를 이용하여 증폭하였다. PCR 조건은 Ex Taq DNA polymerase를 이용하여 denaturation 94℃ 30초, annealing 58℃ 30초, extension 72℃ 1분을 1 cycle로 35 cycle을 수행하였다.
따라서 본 연구에서는 젖소 β-casein 유전자의 exon 7위치에서 소 IGF-1이 소 β-casein과 함께 발현할 수 있는 knock-in 벡터를 제작하였다.
본 연구에서 구축된 knock-in 벡터는 소 β-casein 유전 자의 마지막 1개의 코돈(GTC)이 엑손 8에 존재하므로 knock-in 벡터의 5’ arm 구축시 엑손 7의 마지막 부분에 GTC를 삽입하여 소 β-casein 유전자로부터 소 β-casein아미노산이 정상적으로 합성될 수 있도록 하였다(Fig. 1과 2).
본 연구에서는 전신의 신체 성장을 자극하고, 신체의 거의 모든 세포의 성장 촉진 야기하는 소 IGF-1 유전자가소 β-casein exon 7의 3’ 말단에서 β-casein과 함께 발현할 수 있는 knock-in 벡터를 구축하였다.
반응 후 Ecoli RNase A (TaKaRa, Japan)를 1 μL(2 unit)를 넣은 다음 37℃에서 20분 반응 시킨 후 사용 전까지 ‒20℃에 저장하였다. 소 IGF-1 cDNA을 동정하기 위하여 다음과 같이 합성된 cDNA를 이용하여 PCR를 수행하였다. PCR은 합성한 cDNA 2 uL를 주형으로 사용하였고, KpnI 제한효소 site가 포함된 소 IGF-1 특이적 sense primer(GCGGTACCATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCCA A)와 XbaI 제한효소 site가 포함된 소 IGF-1 특이적 anti-sense primer(GCTCTAGACTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCT)를 이용하였으며, Ex Taq DNA polymerase(TAKARA, Japan)를 이용하여 증폭하였다.
이러한 연구결과는 본 연구에서 소 β-casein 유전자의 내인성 유전자 조절염기서열을 이용하여 소 IGF-1 유전자를 발현하고자 하는 시스템과는 다소 다른 knock-in 방법을 이용하였다.
이렇게 확보된 pBSK(-)- tEndo Knock-in 벡터를 EcoRI과 HindIII로 절단하여 neo 저항성 유전자를 제거하고, EGFP를 marker로 사용하기 위하여 CMV-EGFP-PolyA/EcoRI-HindIII 단편을 sub-cloning 하여 pBSK(-)m-bβCE5'-F2A-tEndo-polyA-EGFP-polyAbβCE3' knock-in 벡터를 제작하였다.
PCR 조건은 Ex Taq DNA polymerase를 이용하여 denaturation 94℃ 30초, annealing 58℃ 30초, extension 72℃ 1분을 1 cycle로 35 cycle을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 확인하였으며, 확인된 PCR 산물은 Gel Elution을 통해 정제한 후 Ligation mix (TAKARA, Japan)를 이용하여 pGEM T-easy 벡터(Promega Co, USA)에 클로닝하였다. 확보된 pGEM T-easy-bIGF-1 플라 스미드는 DNA 염기서열을 결정한 후 Genetyx-win (version 4.
최종 소 IGF-1이삽입된 knock-in 벡터를 제작하기 위하여 pBSK(-)m-bβ CE5'-F2A-tEndo-polyA-EGFP-polyA-bβCE3' knock-in 벡터를 KpnI과 XbaI 제한효소로 절단하여 tEndo DNA 부분을 제거한 다음 소 IGF-1/KpnI-XbaI 단편을 ligation 하여 최종 pBSK(-)m-bβCE5'-F2A-bIGF-1-polyA-EGFP- polyA-bβCE3' knock-in 벡터를 완성하였다.
최종 소 IGF-1이삽입된 knock-in 벡터를 제작하기 위하여 pBSK(-)m-bβ CE5'-F2A-tEndo-polyA-EGFP-polyA-bβCE3' knock-in 벡터를 KpnI과 XbaI 제한효소로 절단하여 tEndo DNA 부분을 제거한 다음 소 IGF-1/KpnI-XbaI 단편을 ligation 하여 최종 pBSK(-)m-bβCE5'-F2A-bIGF-1-polyA-EGFP- polyA-bβCE3' knock-in 벡터를 완성하였다. 최종 완성된 벡터는 염기서열 결정에 의하여 염기서열의 이상 여부를 확인하였으며 또한 NotI, KpnI, EcoRI, HindIII, SalI 제한 효소로 절단하여 각 DNA 단편의 크기로 벡터 구축 여부를 확인하였다.
증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 확인하였으며, 확인된 PCR 산물은 Gel Elution을 통해 정제한 후 Ligation mix (TAKARA, Japan)를 이용하여 pGEM T-easy 벡터(Promega Co, USA)에 클로닝하였다. 확보된 pGEM T-easy-bIGF-1 플라 스미드는 DNA 염기서열을 결정한 후 Genetyx-win (version 4.0)을 사용하여 염기서열을 분석하였다.

성능/효과

1과 2). 이러한 knock-in 벡터는 염기서열 결정과 NotI, KpnI, EcoRI, HindIII, SalI 제한효소 절단에 의하여 각 DNA단편이 정상적으로 연결되어 있음을 확인하였다(Fig. 3).

후속연구

이러한 결과를 종합하여 보면 본 연구에서 개발된 knock-in 벡터는 내인성 소 β-casein 유전자를 knock-out 시키지 않으면서 소의 유용 단백질(소 IGF-1)을 생산하는데 적절한 벡터이고, 이들 벡터를 이용하여 유용단백질을 생산하는 knock-in 소 개발에 이용할수 있을 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	소 β-casein 유전자 엑손 3위치에서 사람 FGF2가 발현하는 벡터와 체세포를 개발하는 데 사용된 유전자 가위는?	최근에는 유전자 가위인 Zinc Finger Nuclease (ZFN), Transcription activator-like effector nuclease (TALEN), Clustered regularly interspaed short palindromic repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9)를 이용하여 보다 효과적으로 형질전환동물을 생산하고 있다(Gaj 등, 2013). 이러한 유전자 가위의 한 종류인 ZFN을 이용하여 소 β-casein 유전자 위치에서 lysostaphin이 발현되는 knock-in된 소를 생산되었으며(Liu 등, 2013), 또한 소 β-casein 유전자 위치에 사람 lysozyme 유전자가 knock-in된 소는 유방염에 저항성을 가지는 것으로 보고되고 있다.
	knock-out 방법이란?	유전자 적중방법은 상동유전자 재조합을 이용하여 외래 유전자로 변이된 유전자를 특정 유전자 위치에 삽입 하여 내인성 유전자 발현을 억제하는 knock-out 방법과 유전체 상의 특정 위치에 외래유전자를 삽입하여 내인성 유전자의 유전자 발현 조절 염기서열을 이용하여 외래유전자를 발현시키는 knock-in 방법이 있다(Yáñez과 Porter, 1998; Müller, 1999; Clark 등, 2000). 가축에 있어서 유전자 적중에 의하여 재조합 단백질을 유즙으로부터 생산하고자 하는 연구는 2000년도에 McCreath 등에 의하여 양의 β-lactoglobine 프로모터를 사용하여 유선으로부터 인간 α1-antitypsin이 양의 α1(I) procollagen (COL1A1) 위치에서 발현할 수 있는 복제양이 생산되었다는 보고가 최초로 알려지고 있다.
	유전자 가위 종류는?	최근에는 유전자 가위인 Zinc Finger Nuclease (ZFN), Transcription activator-like effector nuclease (TALEN), Clustered regularly interspaed short palindromic repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9)를 이용하여 보다 효과적으로 형질전환동물을 생산하고 있다(Gaj 등, 2013). 이러한 유전자 가위의 한 종류인 ZFN을 이용하여 소 β-casein 유전자 위치에서 lysostaphin이 발현되는 knock-in된 소를 생산되었으며(Liu 등, 2013), 또한 소 β-casein 유전자 위치에 사람 lysozyme 유전자가 knock-in된 소는 유방염에 저항성을 가지는 것으로 보고되고 있다.

참고문헌 (15)

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원문보기 상세보기
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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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