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문제 정의
- 본 연구에서는 유전자원으로 보존되고 있는 동결 정자의 융해조건에 따라 2차 동결에 관한 정자의 생존성과 활력도에 관한 자료를 분석하였다. 동결된 정액 유전자원은 융해와 재동결 과정을 통하여 실험목적에 따라 원하는 정액의 농도와 부피로 재 조정하여 동결 보존할 수 있음을 보여주고 있다.
- 이 때에 영구보존된 유전자원은 그 가치를 발휘할 수 있으나 제한된 수량의 동결 정자는 사용 횟수가 제한되어 있을 수 밖에 없고 이용성이 자유롭지 못하기 때문에 정자의 재 동결기술을 적용하여 사용기회를 증대시킬 필요성이 존재한다. 소 정자의 재 동결 기법이 확립되면 우수 종축의 정자를 재활용하여 후대 생산을 위한 수정란생산 효율을 제고할 수 있으므로 본 연구에서는 소의 정자를 재 동결에 필요한 기초자료로서 2가지의 융해방법에 관한 연구를 실시하였으며 재 동결 및 융해 후 정자의 생존성 및 운동성을 비교하였다.
제안 방법
- 초당 30장의 프레임을 얻었으며 1초간 동영상에서 움직이는 정자의 이동거리와 방향을 계측하였으며 Farell 등(1988)에 의하여 발표된 논문의 조정치와 동일하게 분석하였다. CASA에 의하여 검사된 정자 운동성에 대한각 항목은 정자의 농도(total concentration, TC), 운동성 정자의 비율(total motility, TM), 전진성 운동 정자의 비율(progressive motility, PM), 정자두부 운동 경로(호)의 이동속도(curvilinear velocity, VCL), 정자 두부의 직선거리 이동속도(straight-line velocity, VSL), 정자두부의 이동속도 (path velocity, VAP), 정자 두부의 이동에 따른 좌우 진폭 평균 거리 (amplitude of lateral head displacement, ALH), 직진성(linearity, LIN), 정자가 각 방향에 따라 정자이동곡선을 가로지르는 진동수(beat cross frequency, BCF) 및 VCL에 대한 VAP의 비율(Wobble,WOB) 등을 조사하였다.
- 이를 위하여 동면하는 동물의 개체와 조직 및 세포를 연구하기 시작하였으며 세포를 저온 저장하는 방법(hypothermal preservation, HP)을 먼저 연구하였다. 그러나, Polge 등(1949)에 의하여 세포는 동결 상태에서 보존할 수 있음이 밝혀졌으며, glycerol에 대한 특성을 동결보호제로 기술하며 연구를 진행하였다. 눈 속에 저온 저장된 닭 정자에서 생명 연장이 유지되고 있음이 우연히 알려지게 되면서 이를 이용한 SA연구 영역은 드라이 아이스(dry ice, DI)위에서 동결된 상태로 초저온냉동고에 보존하는 방법(-70℃)을 개발하게 되었으며, 최종적으로 액체질소에 침지하여 세포를 영구 보존하는 방법이 강구되었다(Evans and Maxwell, 1987).
- 1차 동결을 실시하고 2~3개월 후 정자를 5℃에서 2분간 융해하거나 37℃에서 40초간 융해하여 2~3ml의 triladyl 난황희석액으로 바로 희석을 실시하였으며 1차 동결과 동일한 방법으로 2시간 동안 5℃로 냉각하였다. 냉각 후 첫번째 동결과 동일한 간이 동결 방법으로 2차 동결을 실시하였으며 이 때 0.25ml스트로를 이용하여 정액을 포장하였고 LN2 표면 위 6cm에서 7분간 노출하고 LN2에 침지시켰다.
- USA)을 활용하여 염색하였다. 도말된 슬라이드는 37℃로 가온된 슬라이드 건조대에서 공기 중에 노출시켜 건조시켰으며 완전히 건조 후, Diff Quik 고정제에 10~20초 노출하여 고정 후 Eosin 염색 용액과 Thiazin 염색용액에 연속적으로 동일한 시간으로 노출시킨 후 증류수에 3~5초 동안 노출하여 과도한 염색 시약을 제거하였다. 염색된 시료는 상온에 보관하였으며 X100 오일 렌즈에서 관찰하였고 형태적 이상을 가진 정자와 정상적인 형태를 가진 정자를 한 시료 당 전체 정자가 200개 이상이 되도록 최소 4군데 이상에서 측정하였다.
- 그러므로 37℃에서 융해한 정액을 2차 동결할 때 그 생존율이 급격히 떨어지는 경우에는 5℃에 융해하는 방법으로 동결하는 것이 유리할 수 있음을 보여주고 있다. 또한, 37℃에서 1차 융해의 생존성이 우수한 동결정액에서 2차 동결 생존성이 높아지는 경향을 관찰하였으나, 5℃ 융해 방법은 그 변이가 오히려 적다는 현상을 관찰하였다. 또한 활성화 정자의 비율 또한 개체에 따라 서로 다른 반응도를 보여주었으며, 보증씨 수소 KPN 757의 경우 5℃ 융해 방법이 불리하다는 증거를 관찰하였다.
- 상기 실험방법과 동일하게 희소한우의 정액과 보증씨수소의 정액을 5℃에서 2분간 융해 후 낮은 농도로 다시 희석하여 첫번째 동결방법과 동일하게 재 동결하고, 다시 융해하여 생존율을 검사하였다. Fig.
- 스트로 당 정자의 농도를 80~40×106이 되도록 희석하고 2~3시간에 걸쳐 22~27℃에서 5℃로 저온 중탕법으로 냉각시켰다. 스티로폼을 활용한 간이동결 방법으로 정자를 동결하였으며 액체질소(liquid nitrogen, LN2) 표면 위 5cm에서 10분간 노출시켜 예비동결을 실시하고 LN2에 침지시켰다. 1차 동결을 실시하고 2~3개월 후 정자를 5℃에서 2분간 융해하거나 37℃에서 40초간 융해하여 2~3ml의 triladyl 난황희석액으로 바로 희석을 실시하였으며 1차 동결과 동일한 방법으로 2시간 동안 5℃로 냉각하였다.
- 도말된 슬라이드는 37℃로 가온된 슬라이드 건조대에서 공기 중에 노출시켜 건조시켰으며 완전히 건조 후, Diff Quik 고정제에 10~20초 노출하여 고정 후 Eosin 염색 용액과 Thiazin 염색용액에 연속적으로 동일한 시간으로 노출시킨 후 증류수에 3~5초 동안 노출하여 과도한 염색 시약을 제거하였다. 염색된 시료는 상온에 보관하였으며 X100 오일 렌즈에서 관찰하였고 형태적 이상을 가진 정자와 정상적인 형태를 가진 정자를 한 시료 당 전체 정자가 200개 이상이 되도록 최소 4군데 이상에서 측정하였다. 균일한 결과가 얻을 수 있도록 훈련된 2명 이상의 연구자가 동일한 시료를 관찰 및 비교하여 균일하고 반복성 있는 실험을 유지하였다.
- 그러나 동결 유전자원의 대표적인 정액은 살아 있는 종축에서 채취하여 보존하고 있는데 동결자원은 그 수가 제한되어 있어 이용에 한계가 존재하고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 본 연구에서는 동결정액을 2가지 방법으로 융해하고 재 동결을 실시하여 그 정자의 특성을 CASA로 분석하고 생존성을 비교하였다. 일반적으로 사람의 정액은 재동결 과정을 극복하여 반복적인 동결 및 융해가 가능하다고 보고되었으나 한우 정액에 관한 재 동결 성적에 관한 연구는 자료는 찾아보기 힘들다.
- 동결학(cryobiology)에서는 살아있는 생명을 영구보존하기 위해 생명활동을 정지(suspended animation, SA)시키는 수 많은 방법이 연구되어왔다. 이를 위하여 동면하는 동물의 개체와 조직 및 세포를 연구하기 시작하였으며 세포를 저온 저장하는 방법(hypothermal preservation, HP)을 먼저 연구하였다. 그러나, Polge 등(1949)에 의하여 세포는 동결 상태에서 보존할 수 있음이 밝혀졌으며, glycerol에 대한 특성을 동결보호제로 기술하며 연구를 진행하였다.
- 정자의 운동성을 관찰하기 위하여 SAIS (MediSupply, Seoul,Korea) 정자자동분석프로그램 (computer assisted sperm analysis,CASA)을 이용하였으며 소 정자의 운동성을 판별하기 위하여 조정된 변수를 사용하였다. 초당 30장의 프레임을 얻었으며 1초간 동영상에서 움직이는 정자의 이동거리와 방향을 계측하였으며 Farell 등(1988)에 의하여 발표된 논문의 조정치와 동일하게 분석하였다. CASA에 의하여 검사된 정자 운동성에 대한각 항목은 정자의 농도(total concentration, TC), 운동성 정자의 비율(total motility, TM), 전진성 운동 정자의 비율(progressive motility, PM), 정자두부 운동 경로(호)의 이동속도(curvilinear velocity, VCL), 정자 두부의 직선거리 이동속도(straight-line velocity, VSL), 정자두부의 이동속도 (path velocity, VAP), 정자 두부의 이동에 따른 좌우 진폭 평균 거리 (amplitude of lateral head displacement, ALH), 직진성(linearity, LIN), 정자가 각 방향에 따라 정자이동곡선을 가로지르는 진동수(beat cross frequency, BCF) 및 VCL에 대한 VAP의 비율(Wobble,WOB) 등을 조사하였다.
- 희소한우의 정액과 보증씨수소의 정액을 37℃에서 40초간 융해 후 낮은 농도로 다시 희석하여 첫번째 동결방법과 동일하게 재 동결하고, 다시 융해하여 생존율을 검사하였다. Fig.
대상 데이터
- 가축유전자원센터에서 보유하고 있는 유전 자원축에서 인공질을 사용하여 정액을 채취하였다. 신선 정액은 32~34℃로 유지하여 15분 안에 실험실로 이동하였으며 상온에서 triladyl 난황희석액으로 1:1 희석방법을 반복하여 원하는 농도로 희석하였다.
- 국립축산과학원 가축유전자원센터에서 유전자원으로 보존하고 있는 칡소 2두(C006, C12044), 흑우 1두(B013) 및 백한우 2두(W001, W003)의 유전자원축을 동결 보존한 정액와 한우개량사업소의 KPN 757의 총 6두의 동결정액을 본 실험에 사용하였다.
- 전기자극으로 정장액이 많이 포함된 부분은 폐기하고 농후한 정액을 1차 동결 실험에 사용하였으며 황소들 간의 동결 직전 정자의 생존성에 있어서 차이는 존재하지 않았다(P>0.05).
- 0%의 기형율을 관찰할 수 있었고 칡소와 흑우 정자기형율은 양호한 수준임을 알 수 있었다. 정액의 부피는 약 5ml에서 7ml 수준으로 큰 변화가 없는 편이었으며 백우 1두는 전기자극으로 채정된 정액을 활용하여 동결정액을 제조하였다. 전기자극으로 정장액이 많이 포함된 부분은 폐기하고 농후한 정액을 1차 동결 실험에 사용하였으며 황소들 간의 동결 직전 정자의 생존성에 있어서 차이는 존재하지 않았다(P>0.
데이터처리
- 난자의 성숙율, 난할율 및 발생율은 Student’s t-test로 분석을 실시하였다.
이론/모형
- 정자의 운동성을 관찰하기 위하여 SAIS (MediSupply, Seoul,Korea) 정자자동분석프로그램 (computer assisted sperm analysis,CASA)을 이용하였으며 소 정자의 운동성을 판별하기 위하여 조정된 변수를 사용하였다. 초당 30장의 프레임을 얻었으며 1초간 동영상에서 움직이는 정자의 이동거리와 방향을 계측하였으며 Farell 등(1988)에 의하여 발표된 논문의 조정치와 동일하게 분석하였다.
성능/효과
- Fig. 2에서 보는 바와 같이 칡소 C006의 정자는 75.1±4.6%에서 35.7±1.8%로 낮아졌으며, C12044 개체는 79.5±2.2%에서 7.9±5.1%로, 흑우 B013은 79.1±3.2%에서 50.2±4.9%, 백우W001은 73.7±4.5%에서 34.3±0.9%, W004는 77.8±3.0%에서 37.9±4.0%로 낮아졌으며 이러한 경향은 한우 보증씨 수소 KPN 757에서도 동일한 경향치로 관찰되었고(72.9%±4.0%에서 39.3±6.6%), 동결정액 후 40초간 융해 하여 다시 동결한 정액의 생존성은 모두 유의적으로 낮아짐을 관찰하였다(P<0.05).
- 염색된 시료는 상온에 보관하였으며 X100 오일 렌즈에서 관찰하였고 형태적 이상을 가진 정자와 정상적인 형태를 가진 정자를 한 시료 당 전체 정자가 200개 이상이 되도록 최소 4군데 이상에서 측정하였다. 균일한 결과가 얻을 수 있도록 훈련된 2명 이상의 연구자가 동일한 시료를 관찰 및 비교하여 균일하고 반복성 있는 실험을 유지하였다.
- 2에서 보는 바와 같이 정자의 융해방법에 따라 생존율은 상당한 변이를 보인다는 것을 알 수 있으며 1차 융해 후 생존율이 낮은 개체는 재동결 방법으로 정자를 활용할 수 없는 것으로 판단된다. 그러나 6개체 중에서 5개체는 재동결에 의하여 활력이 우수한 정자를 얻을 수 있었으며 이는 1차 융해의 생존율이 우수하더라도 칡소 C12044와 같이 2차 융해 후 생존율과 활력도는 낮게 나타날 수 있다는 것을 보여주고 있다. 특히, 37℃에서 융해하고 동일한 희석액으로 희석한 후 재 동결한 정액에서 비교적 높은 생존성을 얻을 수 있었으며(23~60%), 이는 5℃에서 융해한 실험군(29.
- 그러므로 1개의 난자를 체외수정시키는데 필요한 정자의 수는 인공수정에 비하여 훨씬 낮으며, OPU기법이나 동결된 난자를 융해하여 적은 수의 난자를 활용할 경우, 우수한 종축이나 유전자원의 동결정액을 재 동결하여 이용하는 것이 유전자원을 활용하는 방법으로 효율적이라는 것을 추정할 수 있다. 그러나, 본 연구에서 이용된 한우 정액의 재 동결 연구 결과는 생존율이 최대 79.5%에서 7.9%로 낮아지는 경우도 관찰되었으며 79.1에서 50.2%로 저하되는 경우도 관찰되었다. 이러한 결과는 사람의 재동결 연구에 비하여 성적이 낮다고 판단되나 2차 동결 정액으로 체외수정에 응용이 가능하다는 것을 보여주고 있다.
- 이는 IVF에서는 사용될 수 있는 정자는 적절하게 처리될 때, 정자의 양은 작아도 상관이 없으나 AI에 비하여 높은 농도(75~100×106/ml vs 15~30×106/ml)의 정액이 필요하다고 알려져 있다(Parish 등,2014). 그러므로 1개의 난자를 체외수정시키는데 필요한 정자의 수는 인공수정에 비하여 훨씬 낮으며, OPU기법이나 동결된 난자를 융해하여 적은 수의 난자를 활용할 경우, 우수한 종축이나 유전자원의 동결정액을 재 동결하여 이용하는 것이 유전자원을 활용하는 방법으로 효율적이라는 것을 추정할 수 있다. 그러나, 본 연구에서 이용된 한우 정액의 재 동결 연구 결과는 생존율이 최대 79.
- 6%) 보다 생존율의 차이가 넓다는 것을 알 수 있다. 그럼에도 불구하고 5℃에 융해한 2차 동결 정액의 활력도는 37℃에 비하여 낮게 관찰되는 경우가 더 많이 관찰되는 것으로 보아 5℃에서 1차 융해를 실시하는 방법보다 37℃에서 1차 융해를 실시하는 방법이 더욱 유리하다는 것을 예측할 수 있다. 그러나, 37℃에서 1차 융해를 실시하는 방법으로 생존정자를 얻지 못하는 경우에 5℃에서 1차 융해를 실시하고 동결하는 방법은 다른 동결 방법으로 이용할 수 있음을 관찰하였다.
- 동결정액에 관한 법적 기준은 60%이상의 생존율을 보장되어야 하기 때문에 희소한우의 정액은 비교적 우수한 동결정액임을 확인할 수 있었으며 생존율 간 유의적 차이가 관찰되지 않았다(P>0.05).
- 또한 한우보증씨 수소 KPN 757에서도 60.4±8.4%에서 46.6±8.1%로 낮아 졌는데 이는 5℃에서 2분간 융해 후 재동결한 정액에서 그 생존성은 백우와 보증씨수소에서 유의적으로 낮아짐을 확인하였다(P<0.05).
- 또한, 37℃에서 1차 융해의 생존성이 우수한 동결정액에서 2차 동결 생존성이 높아지는 경향을 관찰하였으나, 5℃ 융해 방법은 그 변이가 오히려 적다는 현상을 관찰하였다. 또한 활성화 정자의 비율 또한 개체에 따라 서로 다른 반응도를 보여주었으며, 보증씨 수소 KPN 757의 경우 5℃ 융해 방법이 불리하다는 증거를 관찰하였다. 백우와 흑우의 경우, 정액의 재동결 후 활성화 정자의 비율에 관한 차이가 없었으나, 오히려 생존율의 정자비율이 5℃에서 융해한 동결정액에서 높게 관찰되었기에 재동결에 있어 5℃ 융해 방법이 유리할 수 있다는 보여주었다.
- 일반적으로 사람의 정액은 재동결 과정을 극복하여 반복적인 동결 및 융해가 가능하다고 보고되었으나 한우 정액에 관한 재 동결 성적에 관한 연구는 자료는 찾아보기 힘들다. 본 연구에서는 칡소 2두, 흑우 1두, 백한우 2두 및 보증씨수소 1두의 동결정액을 이용하여 재 동결에 관한 연구를 실시하였으며 개체에 따라 29.7%에서 46.6%의 생존율을 얻었다. 2차 동결 방법에 있어서 생존율은 5 ℃에서 융해하는 방법이 37℃ 융해방법보다 더 높으며 변이가 낮은 것으로 관찰되었다.
- 소의 성판별에 관한 재 동결 연구 결과(Underwood 등, 2009)에 따르면, 소의 성판별 정액 활용성을 높이기 위하여 재 동결을 실시하였으며 유의적으로 낮은 수준의 정자생존율, 운동성이 보고되었으며 acrosome의 반응도는 변화가 없었다고 보고되었다. 여기에서 2차 동결 후 생존율은 약 80%에서 55%로 감소하였으며 활성화된 정자의 비율은 약 48%에서 32%로 감소하였다. 이는 본 연구의 성적과 같이 생존율과 활성화 정자의 비율은 감소하는 결과와 동일하다고 판단된다.
- Table 3에서는 재동결 실험에 대한 결과가 우수한 B013개체에서 각 실험단계별 CASA자료를 관찰하였다. 여기에서 보는 바와 정자의 성상이 1차 융해 후 생존성이 우수할수록 재동결에 관한 동결정액의 재생산이 가능함을 보여주고 있다.
- 눈 속에 저온 저장된 닭 정자에서 생명 연장이 유지되고 있음이 우연히 알려지게 되면서 이를 이용한 SA연구 영역은 드라이 아이스(dry ice, DI)위에서 동결된 상태로 초저온냉동고에 보존하는 방법(-70℃)을 개발하게 되었으며, 최종적으로 액체질소에 침지하여 세포를 영구 보존하는 방법이 강구되었다(Evans and Maxwell, 1987). 정자는 SA를 유지하기 위한 여러 조건을 밝히는데 많이 이용되었으며, 동결학에서 가장 많은 성과를 얻었으며 소의 경우 산업화에 성공하였다. 특히 젖소의 육종과 육우의 형질 개량에 공헌한 바가 매우 커서 종축이 소실되어도 보존된 정액은 후대생산과 개량에 계속 사용되는 것이 일반화 되었다.
- 희소한우에서 인공질을 이용하여 채취한 정액은 Table 1에서와 보는 바와 같이 약 5~7ml 부피의 사출정액을 얻을 수 있었다. 총 3~5회의 반복 실험을 관찰할 때 실험실로 이송된 정액은 10분후 바로 희석하였으며 동결 전 생존율을 조사할 때 모두 90%이상의 정자가 생존하였으며 기형율은 백한우(albino line) 1두에서만 26.0%의 기형율을 관찰할 수 있었고 칡소와 흑우 정자기형율은 양호한 수준임을 알 수 있었다. 정액의 부피는 약 5ml에서 7ml 수준으로 큰 변화가 없는 편이었으며 백우 1두는 전기자극으로 채정된 정액을 활용하여 동결정액을 제조하였다.
- Table 2에서는 융해온도에 의하여 2차 융해 후 생존한 정자에서 활성도가 우수한 정액의 비율을 관찰하였다. 칡소 C006 개체의 재동결에서 37℃ 융해군이 활성화 정자가 더 많은 것(26.8% 대 17.5%)으로 관찰되었으나, 칡소 C12044 개체에서는 오히려 5℃ 융해군이 활성도가 비교적 높았다(1.3%대 14.3%). 흑우 B013과 백우 W001 및 W004의 경우에는 유의적 차이가 존재하지 않았으며, 보증씨 수소의 경우 37℃ 융해군에서 활성화 정자의 비율이 높게 관찰되었다.
- 그러나 6개체 중에서 5개체는 재동결에 의하여 활력이 우수한 정자를 얻을 수 있었으며 이는 1차 융해의 생존율이 우수하더라도 칡소 C12044와 같이 2차 융해 후 생존율과 활력도는 낮게 나타날 수 있다는 것을 보여주고 있다. 특히, 37℃에서 융해하고 동일한 희석액으로 희석한 후 재 동결한 정액에서 비교적 높은 생존성을 얻을 수 있었으며(23~60%), 이는 5℃에서 융해한 실험군(29.7~ 46.6%) 보다 생존율의 차이가 넓다는 것을 알 수 있다. 그럼에도 불구하고 5℃에 융해한 2차 동결 정액의 활력도는 37℃에 비하여 낮게 관찰되는 경우가 더 많이 관찰되는 것으로 보아 5℃에서 1차 융해를 실시하는 방법보다 37℃에서 1차 융해를 실시하는 방법이 더욱 유리하다는 것을 예측할 수 있다.
- 희소한우 동결 정액을 융해하고 생존성을 조사하였을 때, Fig. 1에서와 같이 칡소 C006은 73.4±5.5%, C12044는 73.0±4.5%로 관찰되었으며, 흑우 B013은 79.6±3.2%, 백우 W001은 76.7±4.7%, W004는 82.8±9.0%로 양호한 생존율을 관찰할 수 있었다.
- 희소한우의 경우, 5℃에서 융해한 동결정액은 생존율과 활력도가 상대적으로 저하되는 것을 알 수 있었으며 생존율은 최대 66.6%에서 45.4%로 낮아졌으며 최소 32.5%에서 29.7%로 낮아지는 것을 확인하였다. 그러므로 37℃에서 융해한 정액을 2차 동결할 때 그 생존율이 급격히 떨어지는 경우에는 5℃에 융해하는 방법으로 동결하는 것이 유리할 수 있음을 보여주고 있다.
후속연구
- 2차 동결 방법에 있어서 생존율은 5 ℃에서 융해하는 방법이 37℃ 융해방법보다 더 높으며 변이가 낮은 것으로 관찰되었다. 그럼에도불구하고 2가지 방법에 의한 재동결 기법은 체외 수정이나OPU 유래 수정란 생산을 위하여 한우의 증식에 적용할 수 있을 것으로 보이며 추후 수정란 생산에 관한 연구에 도움이 될 것으로 판단된다.
- 이러한 결과는 재동결에 관한 정액의 반응도가 개체간에 따라 서로 다를 수 있다는 것을 보여주고 있으나, 생존율에 관한 변이가 계통에 따른 차이라고 판단할 수 있는 자료를 축적하지는 못하였다. 특히, 재동결에 관한 개체간 변이가 높게 관찰되는 것으로 보아 아직 사람의 정액과 같이 연속적인 동결 방법을 적용할 수 없는 것으로 추측되며 추후 연구를 통하여 변이를 낮출 수 있는 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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