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문제 정의
- 관악산은 서울대학교 관악캠퍼스를 둘러싸고 있으며, 관악구민 뿐만 아니라 많은 시민들이 이용하고 있다. 이 연구는 관악산 도시자연공원 및 서울대 관악캠퍼스에서 참진드기를 채집하고 종을 동정하여 참진드기의 분포상황을 파악하며, 채집한 참진드기를 대상으로 SFTS 바이러스 감염을 조사하여 감염 여부를 확인하고 그 결과를 통해 관악산 이용에 대한 주의사항과 예방대책을 세워 관악산 이용객과 관악캠퍼스 학생들에게 관악산 이용 시 바이러스 감염 예방에 대한 주의를 고취하고자 하였다.
- 서울대학교 캠퍼스는 관악산에 둘러싸여 있고, 학교 내에도 잔디밭이 많이 있다. 이에 따라 SFTS 바이러스를 매개하는 참진드기를 접하는 기회가 많을 것으로 추정되어 학교 내 캠퍼스와 학교를 둘러싸고 있는 관악산에서 참진드기의 서식조사와 그 참진드기로부터 SFTS 바이러스 감염 여부를 확인해보았다.
제안 방법
- Nested PCR은 First PCR 산물 1 µL, SFTSV N2F(forward primer) 1 µL(10 pmol), SFTSV N2R(reverse primer) 1 µL(10 pmol)와 HiPi PCR premix(ELPIS-Biotech, Korea) 4 µL, DW 13 µL를 섞은 후, 94℃/5분 동안 변성을 시킨 후, 증폭반응을 94℃/20초, 55℃/40초, 72℃/30초로 25회 진행하였으며, 최종 신장과정을 72℃/5분 동안 진행하였다.
- PCR 결과 증폭된 유전자 밴드는 SFTS 바이러스 양성으로 판정하고, 유전자 염기서열을 확인하기 위하여 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 목표 DNA를 추출하고, DNA sequencing을 위하여 전문업체에 의뢰하여 분석하였다. 확인된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(USA)의 nucleotide blast search에서 상동성 높은 유전자들을 찾아내어 본 샘플의 염기서열과 기존 문헌에 언급된 염기서열을 Clustal W software를 통하여 Align을 실시하였고 [13], Align한 염기서열은 neighbor-joining method를 이용하여 MEGA 6 software [22]에서 neighbor-joining method를 이용하여 계통발생학적 관계를 분석하였다.
- 채집된 참진드기는 채집일자별, 채집장소별, 종별, 발육단계별, 암수별(성충) 참진드기 성충과 약충은 개체별로 구분하였고, 유충의 경우에는 10마리씩 pooling하여 유전자를 추출하였다. 바이러스 유전자를 추출하기 위하여 Viral Genespin Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)의 lysis buffer에 넣고, tungsten beads를 사용하여 TissueLyser II(Retsch, Germany)에서 30 Hz로 5분간 참진드기를 분쇄하였고, 바이러스 RNA 추출은 Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit의 매뉴얼에 따라 진행하였다.
- 5 µL(10 pmol)와 OneStep RT-PCR Pre-Mix(SolGent, Korea) 15 µL를 섞은 후, one-step RT nested PCR을 진행하였다. 역전사반응은 50℃/30분과 95℃/15분으로 진행되었으며, 그 후 증폭반응을 95℃/20초, 52℃/40초, 72℃/30초로 40회 진행하였고, 최종 신장과정을 72℃/5분 동안 진행하였다. Nested PCR은 First PCR 산물 1 µL, SFTSV N2F(forward primer) 1 µL(10 pmol), SFTSV N2R(reverse primer) 1 µL(10 pmol)와 HiPi PCR premix(ELPIS-Biotech, Korea) 4 µL, DW 13 µL를 섞은 후, 94℃/5분 동안 변성을 시킨 후, 증폭반응을 94℃/20초, 55℃/40초, 72℃/30초로 25회 진행하였으며, 최종 신장과정을 72℃/5분 동안 진행하였다.
- 이 연구는 학생들과 등산객들이 주로 다니는 학교 캠퍼스와 관악산 등산로를 주변으로 참진드기 채집을 진행하였으며, 서울 도심에 위치하는 관악산에 서식하는 참진드기에서 SFTS 바이러스를 발견할 수 있었다. 특정 지역에서만 진행된 연구지만, 서울에서 서식하고 있는 길고양이에서도 SFTS가 발견된 것처럼 서울에서 서식하고 있는 여러 야생동물 및 관악산을 방문하는 방문객들이 관악산에 있는 진드기를 통해 SFTS에 감염될 수 있다 [6].
- 참진드기에서 추출한 RNA 8 µL, distilled water(DW) 4 µL, SFTSV NP-2F(forward primer) 1.5 µL(10 pmol), SFTSV NP-2R(reverse primer) 1.5 µL(10 pmol)와 OneStep RT-PCR Pre-Mix(SolGent, Korea) 15 µL를 섞은 후, one-step RT nested PCR을 진행하였다.
- 채집된 참진드기는 채집일자별, 채집장소별, 종별, 발육단계별, 암수별(성충) 참진드기 성충과 약충은 개체별로 구분하였고, 유충의 경우에는 10마리씩 pooling하여 유전자를 추출하였다. 바이러스 유전자를 추출하기 위하여 Viral Genespin Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)의 lysis buffer에 넣고, tungsten beads를 사용하여 TissueLyser II(Retsch, Germany)에서 30 Hz로 5분간 참진드기를 분쇄하였고, 바이러스 RNA 추출은 Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit의 매뉴얼에 따라 진행하였다.
- 채집한 참진드기는 실험실 안에 있는 실체현미경(SZH10; Olympus, Japan)을 이용하여 기존 문헌에 따라 참진드기를 동정하였고 [23], 발육단계 [유충(Larva), 약충(nymph), 성충(Adult)]에 따라 분류하고, 성충은 성별(male, female)도 분류하였다. 동정이 끝난 참진드기는 개체별로 2.
- PCR 결과 증폭된 유전자 밴드는 SFTS 바이러스 양성으로 판정하고, 유전자 염기서열을 확인하기 위하여 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 목표 DNA를 추출하고, DNA sequencing을 위하여 전문업체에 의뢰하여 분석하였다. 확인된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(USA)의 nucleotide blast search에서 상동성 높은 유전자들을 찾아내어 본 샘플의 염기서열과 기존 문헌에 언급된 염기서열을 Clustal W software를 통하여 Align을 실시하였고 [13], Align한 염기서열은 neighbor-joining method를 이용하여 MEGA 6 software [22]에서 neighbor-joining method를 이용하여 계통발생학적 관계를 분석하였다. Bootstrapping은 1,000번 수행되었다.
대상 데이터
- 2015년 5월부터 10월까지 관악산의 등산로 4곳과 그 주변, 서울대학교 안에 있는 잔디밭 3곳 및 그 주변 수풀에서 월 2회(10월 제외) 이상 참진드기를 채집하였다. 참진드기의 채집은 백색 융천을 이용하여 dragging 방법과 flagging 방법을 이용하였다.
- 관악산 및 교내 잔디 주변에서 2015년 5월부터 10월까지 총 13회의 채집을 진행하여 총 273마리의 참진드기가 채집되었다. 관악산에서는 서울대학교 공과대학에서 시작하는 탐방로 주변과 제4 야영지 주변에서만 참진드기가 채집되었고, 서울대학교 관악캠퍼스 내 3곳의 잔디밭과 주변 수풀에서는 참진드기가 전혀 채집되지 않았다.
이론/모형
- SFTS 바이러스의 검출은 SFTS 바이러스 S 단편 증폭을 이용하였고, PCR primer 염기서열은 오 등 [18]이 보고한 염기서열을 사용하였다(Table 1). 참진드기에서 추출한 RNA 8 µL, distilled water(DW) 4 µL, SFTSV NP-2F(forward primer) 1.
- 2015년 5월부터 10월까지 관악산의 등산로 4곳과 그 주변, 서울대학교 안에 있는 잔디밭 3곳 및 그 주변 수풀에서 월 2회(10월 제외) 이상 참진드기를 채집하였다. 참진드기의 채집은 백색 융천을 이용하여 dragging 방법과 flagging 방법을 이용하였다. 채집한 참진드기는 습도를 유지하기 위하여 풀잎 한 잎을 15 mL cornical tube에 보관하여 실온 상태로 연구실로 운송하여 채집일자, 채집위치 그리고 채집지의 특성 등을 기록한 후, 냉장 보관하였다.
성능/효과
- 3%로 나타났다. 개피참진드기 약충 3 마리에서 SFTS 바이러스가 검출되어 약충 내에서는 감염률이 8.1%이었으며, 개피참진드기 내에서는 6.1%로 나타났다. 참진드기 유충 3개 풀에서 SFTS 바이러스가 검출되어 유충 내에서 최소야외감염률이 2.
- 2%)가 채집되었다(Table 2). 관악산에서 채집한 전체 참진드기 273마리 중에서 7개 시료가 SFTS 바이러스 양성으로 판정되어 전체 평균 최소야외감염률(minimum field infection rate)은 2.6%로 나타났다. 종별, 성장단계별 SFTS 바이러스 검출 결과, 성충은 작은소진드기, 개피참진드기 모두 발견되지 않았으며, 작은소진드기 약충 1 마리에서 검출되어 약충 내에서는 감염률이 1.
- 또한 관악산에 서식하는 참진드기로부터 검출된 SFTS 바이러스의 S 단편에 대한 유전자 염기서열 분석결과, 일본에서 보고된 유전자 염기서열과 가장 유사하게 나타났다(Fig. 1). SFTS 바이러스는 크게 중국형과 일본형으로 나누어 볼 수 있으며 [24], 일부 국내 SFTS 바이러스는 중국형과 비슷하지만 일본과 더 계통발생학적으로 가까운 것으로 나타난다.
- 1). 또한 이번 연구에서 검출된 유전자 염기서열은 국내에서 보고된 SFTS 바이러스 유전자 염기서열(KU507573)과 100% 일치하였다(Fig. 1).
- 3%(26/415)로 나타났다(unpublished data). 이번 연구에서는 성충에서 SFTS 바이러스가 검출되지 않았는데 이러한 차이는 채집된 성충의 숫자가 너무 적어서 바이러스가 발견되지 않은 것으로 추측된다. 종별로 분석해보면 작은소진드기의 감염률은 1.
- 이번 조사에서 채집한 참진드기 종은 총 2종으로서 작은소진드기(Haemaphysalis longicornis), 개피참진드기(Haemaphysalis flava)였다. 참진드기 총 273마리 중, 76마리의 작은소진드기(성충 암컷 4마리, 약충 72마리; 27.
- 6%로 나타났다. 종별, 성장단계별 SFTS 바이러스 검출 결과, 성충은 작은소진드기, 개피참진드기 모두 발견되지 않았으며, 작은소진드기 약충 1 마리에서 검출되어 약충 내에서는 감염률이 1.4%이었으며, 작은소진드기 내에서는 1.3%로 나타났다. 개피참진드기 약충 3 마리에서 SFTS 바이러스가 검출되어 약충 내에서는 감염률이 8.
- 이번 연구에서는 성충에서 SFTS 바이러스가 검출되지 않았는데 이러한 차이는 채집된 성충의 숫자가 너무 적어서 바이러스가 발견되지 않은 것으로 추측된다. 종별로 분석해보면 작은소진드기의 감염률은 1.3%, 개피참진드기의 감염율은 6.1%로 개피참진드기에서 더 높은 감염률을 나타내었다. 하지만 다른 연구에서는 주로 작은소진드기에서 더 높은 감염률을 나타냈는데 [18], 이러한 차이는 본 연구에서 진드기 채집 숫자가 적어서 발생한 오차로 판단된다.
- 1%로 나타났다. 참진드기 유충 3개 풀에서 SFTS 바이러스가 검출되어 유충 내에서 최소야외감염률이 2.0%로 나타났다(Table 2).
- 이번 조사에서 채집한 참진드기 종은 총 2종으로서 작은소진드기(Haemaphysalis longicornis), 개피참진드기(Haemaphysalis flava)였다. 참진드기 총 273마리 중, 76마리의 작은소진드기(성충 암컷 4마리, 약충 72마리; 27.8%)와 49마리의 개피참진드기(성충 암컷 9마리, 성충 수컷 3마리, 약충 37마리; 17.9%), 그리고 참진드기 유충 148마리(54.2%)가 채집되었다(Table 2). 관악산에서 채집한 전체 참진드기 273마리 중에서 7개 시료가 SFTS 바이러스 양성으로 판정되어 전체 평균 최소야외감염률(minimum field infection rate)은 2.
- 채집한 참진드기의 SFTS 바이러스 감염률을 비교해보면 성장단계별로는 성충에서 0%(0/16), 약충에서 3.2%(4/125),풀링한 유충의 최소야외감염률은 2.0%(3/148)로 나타났다. 다른 자연환경으로부터 진드기를 채집하여 SFTS 바이러스 검출을 진행했던 연구에서는 성충에서의 감염률은 약 6.
후속연구
- 특정 지역에서만 진행된 연구지만, 서울에서 서식하고 있는 길고양이에서도 SFTS가 발견된 것처럼 서울에서 서식하고 있는 여러 야생동물 및 관악산을 방문하는 방문객들이 관악산에 있는 진드기를 통해 SFTS에 감염될 수 있다 [6]. 이번 연구는 5월부터 진행되었는데, 진드기의 활동 시기는 날씨가 따뜻해지는 3월부터 시작되며 11월까지 활동을 하므로 정확한 조사를 위해 더 넓은 지역과 진드기가 활동하기 시작하는 3월에서 11월까지 조사가 필요할 것으로 생각한다.
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