자단향으로부터 밀 붉은곰팡이병균 Fusarium graminearum에 대한 항진균활성 물질의 분리 및 특성 규명 Isolation and Characterization of Antifungal Metabolites from Pterocarpus santalinus against Fusarium graminearum Causing Fusarium Head Blight on Wheat원문보기
붉은곰팡이병은 주로 Fusarium graminearum에 의해 발생하며 전세계적으로 주요 곡물에 치명적인 피해를 주는 식물병이다. 관행농가에서는 일반적으로 붉은곰팡이병 방제에 합성살균제를 사용하고 있지만 장기적인 합성살균제의 사용으로 인하여 환경 오염 문제와 인간의 건강을 위협하는 문제가 야기되었다. 때문에 천연물살균제를 포함한 친환경 생물농약 개발에 대한 관심이 고조되고 있는 실정이다. 본 연구에서는 100종의 식물추출물을 이용하여 F. graminearum에 항진균 활성을 갖는 식물 추출물을 탐색하였다. 그 결과 자단 심재부인 자단향의 조추출물이 가장 강한 항진균활성을 보였으며, GC-MS 분석을 통하여 자단향으로부터 ${\alpha}$-cedrol과 widdrol로 동정된 두개의 항진균 활성물질을 분리하였다. ${\alpha}$-Cedrol과 widdrol의 F. graminearum 포자발아 억제활성 최소저해농도는 각각 31.25 mg/l과 62.5 mg/l였으며, 이 두 물질은 F. graminearum 이외에도 다양한 식물병원균의 균사 생육을 저해하였다. 더욱이 자단향 추출물을 분말 수화제로 제형화하여 처리한 결과, 밀 붉은 곰팡이병에 대한 방제효과는 유효성분 농도가 높을수록 효과적인 방제가를 보였으며, 250배 희석처리 시 2,000배의 상용농도로 희석한 합성살균제의 방제가(92.6%)와 통계적으로 유사한 87.2%의 병방제가를 보였다. 본 연구결과는 붉은곰팡이병방제를 위한 효과적인 생물살균제로 자단향 추출물이 활용 가능하다는 것을 제시하고 있다.
붉은곰팡이병은 주로 Fusarium graminearum에 의해 발생하며 전세계적으로 주요 곡물에 치명적인 피해를 주는 식물병이다. 관행농가에서는 일반적으로 붉은곰팡이병 방제에 합성살균제를 사용하고 있지만 장기적인 합성살균제의 사용으로 인하여 환경 오염 문제와 인간의 건강을 위협하는 문제가 야기되었다. 때문에 천연물살균제를 포함한 친환경 생물농약 개발에 대한 관심이 고조되고 있는 실정이다. 본 연구에서는 100종의 식물추출물을 이용하여 F. graminearum에 항진균 활성을 갖는 식물 추출물을 탐색하였다. 그 결과 자단 심재부인 자단향의 조추출물이 가장 강한 항진균활성을 보였으며, GC-MS 분석을 통하여 자단향으로부터 ${\alpha}$-cedrol과 widdrol로 동정된 두개의 항진균 활성물질을 분리하였다. ${\alpha}$-Cedrol과 widdrol의 F. graminearum 포자발아 억제활성 최소저해농도는 각각 31.25 mg/l과 62.5 mg/l였으며, 이 두 물질은 F. graminearum 이외에도 다양한 식물병원균의 균사 생육을 저해하였다. 더욱이 자단향 추출물을 분말 수화제로 제형화하여 처리한 결과, 밀 붉은 곰팡이병에 대한 방제효과는 유효성분 농도가 높을수록 효과적인 방제가를 보였으며, 250배 희석처리 시 2,000배의 상용농도로 희석한 합성살균제의 방제가(92.6%)와 통계적으로 유사한 87.2%의 병방제가를 보였다. 본 연구결과는 붉은곰팡이병방제를 위한 효과적인 생물살균제로 자단향 추출물이 활용 가능하다는 것을 제시하고 있다.
Fusarium head bight (FHB) is a devastating disease on major cereal crops worldwide which causes primarily by Fusarium graminearum. Synthetic fungicides are generally used in conventional agriculture to control FHB. Their prolonged usage has led to environmental issues and human health problems. This...
Fusarium head bight (FHB) is a devastating disease on major cereal crops worldwide which causes primarily by Fusarium graminearum. Synthetic fungicides are generally used in conventional agriculture to control FHB. Their prolonged usage has led to environmental issues and human health problems. This has prompted interest in developing environmentally friendly biofungicides, including botanical fungicides. In this study, a total 100 plant extracts were tested for antifungal activity against F. graminearum. The crude extract of Pterocarpus santalinus heartwood showed the strongest antifungal activity and contained two antifungal metabolites which were identified as ${\alpha}$-cedrol and widdrol by GC-MS analysis. ${\alpha}$-Cedrol and widdrol isolated from P. santalinus heartwood extract had 31.25 mg/l and 125 mg/l of minimal inhibitory concentration against the spore germination of F. graminearum, and also showed broad spectrum antifungal activities against various plant pathogens. In addition, the wettable powder type formulation of heartwood extract of P. santalinus decreased FHB incidence in dose-dependent manner and suppressed the development of FHB with control values of 87.2% at 250-fold dilution, similar to that of chemical fungicide (92.6% at 2,000-fold dilution). This study suggests that the heartwood extract of P. santalinus could be used as an effective biofungicide for the control of FHB.
Fusarium head bight (FHB) is a devastating disease on major cereal crops worldwide which causes primarily by Fusarium graminearum. Synthetic fungicides are generally used in conventional agriculture to control FHB. Their prolonged usage has led to environmental issues and human health problems. This has prompted interest in developing environmentally friendly biofungicides, including botanical fungicides. In this study, a total 100 plant extracts were tested for antifungal activity against F. graminearum. The crude extract of Pterocarpus santalinus heartwood showed the strongest antifungal activity and contained two antifungal metabolites which were identified as ${\alpha}$-cedrol and widdrol by GC-MS analysis. ${\alpha}$-Cedrol and widdrol isolated from P. santalinus heartwood extract had 31.25 mg/l and 125 mg/l of minimal inhibitory concentration against the spore germination of F. graminearum, and also showed broad spectrum antifungal activities against various plant pathogens. In addition, the wettable powder type formulation of heartwood extract of P. santalinus decreased FHB incidence in dose-dependent manner and suppressed the development of FHB with control values of 87.2% at 250-fold dilution, similar to that of chemical fungicide (92.6% at 2,000-fold dilution). This study suggests that the heartwood extract of P. santalinus could be used as an effective biofungicide for the control of FHB.
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문제 정의
또한 원재료의 대량확보가 용이하며, 부가적으로 다양한 식물병원균에 대한 항진균 활성을 확인하여 실제적 이용가능성이 높은 것으로 판단된 자단향으로부터 항진균활성 물질을 분리하여 항진균활성을 조사하고, 분리한 항진균물질의 구조를 동정하였다. 더욱이 조추출물로 제제를 제조한 후밀 붉은곰팡이병에 대한 방제활성을 조사하여 생물농약 후보물로서 자단향의 가능성을 타진하였다. 이러한 연구는 기능성 천연물추출물의 생물농약개발을 통하여 화학농약을 보완하거나 대치하여 농작물의 친환경 재배 및 재배환경의 안전성을 향상시키는데 자단향 추출물의 항진균성분이 유용함을 제시하고 있다.
본 연구에서는 확보한 한약재 추출물 100종을 대상으로 밀 붉은곰팡이병의 원인균인 F. graminearum의 항진균 활성을 평가하여 자단 심재부(자단향) 추출물의 효과적인 항균활성을 확인하였다. 또한 원재료의 대량확보가 용이하며, 부가적으로 다양한 식물병원균에 대한 항진균 활성을 확인하여 실제적 이용가능성이 높은 것으로 판단된 자단향으로부터 항진균활성 물질을 분리하여 항진균활성을 조사하고, 분리한 항진균물질의 구조를 동정하였다.
6%의 방제효과를 보였다(Table 2). 자단향 분말수 화제의 경우 본 실험에서는 대조약제 상용농도와 통계적으로 동일한 방제효과를 보여 생물농약으로서의 가능성을 확인하였다.
하지만 밀 붉은곰팡이병의 원인균인 F. graminearum에 대한 a-cedrol과 widdrol의 항진균활성 보고는 지금까지 없었기에 본 보고에서 Pterocarpus속 식물체 추출물로부터 분리한 α-cedrol과 widdrol의 붉은곰팡이에 대한 항진균활성을 처음으로 보고하는 바이다.
제안 방법
α-cedrol과 widdrol의 항균활성 스펙트럼을 조사하고자, F. graminearum을 포함한 다양한 식물 병원균의 균사생육 억제 활성을 측정하였다.
48 well plate의 각 well에 포자 현탁액을 198 μl 씩 분주한 후, 시료 2 μl를 첨가하여, EtOH 추출물은 최종 농도가 2,000, 1,000, 500 mg/l, 4개의 자단향 용매 추출물은 최종농도가 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 mg/l, 그리고 분리한 두 물질은 최종농도가 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.81, 3.91 mg/l가 되도록 처리하였다.
F. graminearum 포자발아 억제 활성이 가장 우수한 n-hexane 분획물(3 g)을 silica gel column (3.6 cm i.d.×60 cm, Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 200 g; Merck, Darmstadt, Germany)에 가한 후 n-hexane:acetone (9:1, v/v)의 용출조 건하에서 항균활성 물질은 용출하였다.
GC-MS (QP2010; Shimadzu, Kyoto, Japan) 기기에 DB-5 column (0.25 mm i.d.×60 m, 0.25 mm film, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하였으며 시료 분석 시 ion source 온도 200oC, injector 온도 250oC에서 oven 온도를 100oC로 2분간 유지하다가 280oC까지 분당 10oC씩 증가시킨 후 최고온도 280oC 에서 3분간 유지하였다.
sp. lycopersici (KACC40043), 잔디 동전마름병균인 Scleotinia homoeocarpa (서울시립대), 고추 탄저병균인 Colletotrichum coccodes (한국화학연구원), 밤나무 줄기마름병균인 Cryphonectria parasitica (충북대학교) 등의 다양한 식물병원성 진균에 대하여 균사 생육 억제활성을 조사하였다. 자단향으로부터 분리한 두 물질은 DMSO로 용해시켜 사용하였다.
각 well의 배양액을 10 μl씩 취하여 포자발아 여부를 현미경(100배; Harris Swift M1000-D; Swift Optical Instruments, Schertz, TX, USA)으로 관찰하였다.
용출된 각 분획들은 silica gel 60 F254이 피복된 glass plate (Merck, Germany) 상에서 n-hexane:acetone (9:1, v/v) 전개용매조건으로 thin-layer chromatography (TLC) 분석을 진행하여 같은 TLC 패턴을 보이는 분획끼리 수합하여 총 5개의 분획(F1-F5)를 획득하였다. 각 분획의 F. graminearum 포자 발아 억제활성을 검정한 결과, 항균활성을 보인 F4와 F5를 수합한 후 상기 silica gel column chromatography와 동일한 조건으로 시료(2.75 g)를 통과시켜 4개의 분획으로 세분하였으며(F41-F44), 이 중 포자발아억제 활성이 가장 우수한 F41 (909.7 mg) 시료의 항균활성물 질을 분리하기 위하여 column chromatography를 재수행하 였다. F41 시료를 silica gel column (2.
자단향으로부터 분리한 두 물질은 DMSO로 용해시켜 사용하였다. 균사 생육 억제 활성조사에 사용할 균사체를 얻기 위하여 PDB에 식물병원 균이 배양된 agar plug를 접종하여 25oC에서 7일 동안 정치 배양한 후 멸균한 4겹 거즈에 걸러 얻어진 균사체는 50 mg 생체중/ml의 농도가 되도록 멸균수를 첨가하여 균질화하였다. 균질화된 균사액을 96 well plate의 각 well에 99 μl씩 분지한 후시료 1 μl를 첨가하여 최종 농도가 500, 250, 125, 62.
무처리구의 경우 1% DMSO 를 처리하였으며, 3반복으로 실험을 2회 반복하여 수행하였다. 균사생육을 완전히 억제하는 최소저해농도(MIC: minimum inhibitory concentration)를 결정하였다.
균질화된 균사액을 96 well plate의 각 well에 99 μl씩 분지한 후시료 1 μl를 첨가하여 최종 농도가 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 mg/l가 되도록 처리하고 25oC에서 정치 배양하였다.
EtOAc 추출물은 anhydrous sodium sulfate를 가하여 물을 제거한 후 감압 농축하였다. 또한 남아 있는 물층에 butanol (BuOH)을 2회 첨가하여 분획한 후 얻어진 BuOH 층과 물층을 각각 감압 농축하였다. 이와 같이 획득한 4개의 추출물에 대한 F.
graminearum의 항진균 활성을 평가하여 자단 심재부(자단향) 추출물의 효과적인 항균활성을 확인하였다. 또한 원재료의 대량확보가 용이하며, 부가적으로 다양한 식물병원균에 대한 항진균 활성을 확인하여 실제적 이용가능성이 높은 것으로 판단된 자단향으로부터 항진균활성 물질을 분리하여 항진균활성을 조사하고, 분리한 항진균물질의 구조를 동정하였다. 더욱이 조추출물로 제제를 제조한 후밀 붉은곰팡이병에 대한 방제활성을 조사하여 생물농약 후보물로서 자단향의 가능성을 타진하였다.
×60 cm, Kiesel gel 60, 230-400 mesh, 50 g; Merck, Germany)에 가한 다음 EtOAc:n-hexane (1:7, v/v)의 조건하에서 용출하여 물질 1 (99 mg)을 순수분리하였다. 또한 활성을 보인 F3 (342 mg)으로부터 활성물질을 분리하기 위하여 분취형 TLC (Kiesel gel 60, 0.5 mm film 두께; Merck, Germany)를 수행하였다. 전개용매는 toluene:EtOAc:acetic acid (60:20:1, v/v/v)였으며, 최종적으로 물질 2 (13 mg)을 순수분리하였다.
EtOH 추출 물은 EtOH로, n-hexane층과 EtOAc층은 acetone으로, BuOH 층은 MeOH, 물층은 10% EtOH, 그리고 분리한 두 물질은 dimethylsulfoxide(DMSO)로 용해하였다. 무처리구는 유기용매(acetone, MeOH, DMSO)를 최종농도 1%로 처리하였다. 처리당 3반복으로 실험을 수행하였으며, 25°C에서 진탕배양하여 무처리구의 포자가 모두 발아한 시간(6시간)에 모든 처리구의 포자발아 여부를 관찰하였다.
배양 후 무처리구의 균사가 육안으로 확인될 정도로 자란 시간을 기점으로 모든 처리구를 관찰하였다. 무처리구의 경우 1% DMSO 를 처리하였으며, 3반복으로 실험을 2회 반복하여 수행하였다. 균사생육을 완전히 억제하는 최소저해농도(MIC: minimum inhibitory concentration)를 결정하였다.
63 mg/l가 되도록 처리하고 25oC에서 정치 배양하였다. 배양 후 무처리구의 균사가 육안으로 확인될 정도로 자란 시간을 기점으로 모든 처리구를 관찰하였다. 무처리구의 경우 1% DMSO 를 처리하였으며, 3반복으로 실험을 2회 반복하여 수행하였다.
본 실험을 통하여 자단향으로부터 F. graminearum의 포자 발아억제활성이 우수한 두 개의 sesquitepene계 화합물, 즉 a-cedrol과 widdrol을 분리, 동정하였다. 또한 두 화합물을 주요 성분으로 포함하고 있는 n-hexane 분획층으로 제조한 분말수 화제는 포장에서 밀 붉은곰팡이병에 대하여 높은 방제효과를 보인다는 사실을 발견하였다.
분리한 물질의 화학구조를 동정하기 위하여 gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) 분석을 실시하였다. GC-MS (QP2010; Shimadzu, Kyoto, Japan) 기기에 DB-5 column (0.
분획과정을 통하여 획득한 4개의 분획층 중 가장 강한 항균활성을 보인 자단향 n-hexane 분획 농축물에서 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피와 분취형 TLC를 통하여 F. graminearum의 포자발아를 억제하는 두 개의 물질을 순수분리하였다. 분리한 두 개의 화합물은 GC-MS 분석 결과(Fig.
×8 cm)로 이삭을 덮고 큰 비닐로 밀 전체를 한번 더 포장하였다. 비닐은 2일 후에 제거하였고 접종 10일 뒤 이삭의 병발생여부를 관찰하였다. 처리 당 3반복으로 실험을 수행하였으며 모든 반복은 30개의 이삭을 사용하였다.
자단향 추출물의 밀 붉은곰팡이병에 대한 효과 및 약해 유무를 조사하기 위하여 전남대학교 밀 포장에서 실험을 수행하였다. 시험에 사용한 시료는 자단향 추출물을 분말수화제로 제형화하여 처리하였다. 자단향 n-hexane 분획물(2 g)을 소량의 acetone으로 용해한 후 white carbon (1.
×60 cm, Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 200 g; Merck, Darmstadt, Germany)에 가한 후 n-hexane:acetone (9:1, v/v)의 용출조 건하에서 항균활성 물질은 용출하였다. 용출된 각 분획들은 silica gel 60 F254이 피복된 glass plate (Merck, Germany) 상에서 n-hexane:acetone (9:1, v/v) 전개용매조건으로 thin-layer chromatography (TLC) 분석을 진행하여 같은 TLC 패턴을 보이는 분획끼리 수합하여 총 5개의 분획(F1-F5)를 획득하였다. 각 분획의 F.
graminearum을 접종하고 4일간 25oC에서 200 rpm으로 진탕배양한 후 멸균한 4겹 거즈로 거른 여과액을 4oC에서 10,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상징액은 버리고, 침전물에 potato dextrose broth (PDB; Becton, Dickinson and Company)를 가하여 항균활성조사에 사용할 포자를 회수하였다. 포자는 hemocytometer (0.
또한 남아 있는 물층에 butanol (BuOH)을 2회 첨가하여 분획한 후 얻어진 BuOH 층과 물층을 각각 감압 농축하였다. 이와 같이 획득한 4개의 추출물에 대한 F. graminearum 포자 발아 저해활성을 조사한 결과, n-hexane층이 가장 효과가 우수한 것으로 나타나, 이 시료 로부터 항진균활성 물질 분리를 실시하였다.
자단향 조추 출물을 이용한 생물농약 개발 가능성을 타진하기 위하여 항진 균활성이 가장 강한 n-hexane 분획층을 분말수화제(PS-WP20) 로 제조한 후 밀 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과를 포장에서 조사하였다. PS-WP20을 500배와 250배로 희석하여 포장에서 재배한 밀에 처리한 결과, 각각 47.
처리당 3반복으로 실험을 수행하였으며, 25°C에서 진탕배양하여 무처리구의 포자가 모두 발아한 시간(6시간)에 모든 처리구의 포자발아 여부를 관찰하였다.
추출액은 여과지에 걸러 MeOH 추출액을 확보하였 으며, residue에 다시 3 l의 MeOH을 가하여 한번 더 추출하였다. 추출액을 수합하여 rotary evaporator (OSB-2100, EYELA, Japan)로 45oC 이하의 수욕상에서 감압 농축하였다. 확보한 MeOH 추출물(305 g)을 70% MeOH로 다시 녹인 후 동량의 n-hexane을 가하여 2회 분획하였다.
포자 발아는 발아관의 길이가 포자 단면의 너비 이상인 경우를 발아로 하였다. 한 처리구 당 3반복하여 실험하였으며 각 well 당 300개 이상의 포자를 관찰하였다.
한국식물추출물은행으로부터 분양받은 100개의 EtOH 추출물, 자단향 조추출물로부터 획득한 4개의 용매 추출물(n-hexane층, EtOAc층, BuOH층, 물층) 및 자단 향으로부터 분리한 2개의 항진균활성 물질의 F. graminearum 의 macroconidia에 대한 포자발아 억제 효과를 조사하였다. CMC 배지에 F.
대상 데이터
처리 당 3반복으로 실험을 수행하였으며 모든 반복은 30개의 이삭을 사용하였다. 대조약제로는 difenoconazole과 propiconazole 성분이 각각 13% 함유된 알무리(Syngenta, 한국)를 사용하였으며, 시료처리와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다(Kim 등, 2016). 밀 붉은곰팡 이병에 대한 약제의 방제효과는 아래의 식에 대입하여 산출하였다.
graminearum에 대한 항균 활성 시험에 사용하였다. 또한 선발한 자단향으로부터 활성물질을 분리하기 위하여 광주 한약재도매시장에서 자단 줄기의 심재 부분을 건조한 자단향(전북 임실)을 구입하여 사용하였다.
붉은곰팡이병 방제에 유용한 식물유래 천연물 농약 후보물질을 개발하기 위하여 한국식물추출물은행(한국 생명공학연구원, 오창, 한국)으로부터 분양받은 한약재 100종의 ethanol (EtOH) 조추출물을 F. graminearum에 대한 항균 활성 시험에 사용하였다. 또한 선발한 자단향으로부터 활성물질을 분리하기 위하여 광주 한약재도매시장에서 자단 줄기의 심재 부분을 건조한 자단향(전북 임실)을 구입하여 사용하였다.
붉은곰팡이병을 일으키는 원인균 F. graminearum에 대한 식물추출물과 자단향 추출물의 항균활성을 확인하기 위하여 F. graminearum 야생종 Z-3639 (Bowden와 Leslie, 1999)를 병원균으로 이용하였으며, 시험 균주의 생장배지로 potato dextrose agar (PDA; Becton, Dickinson and Company, MD, USA)를 사용하였다. 병원성 검정시험에 사용할 포자는 carboxymethylcellulose 배지(CMC, carboxymethylcellulose 15 g, NH4NO3 1 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.
자단향 추출물의 밀 붉은곰팡이병에 대한 효과 및 약해 유무를 조사하기 위하여 전남대학교 밀 포장에서 실험을 수행하였다. 시험에 사용한 시료는 자단향 추출물을 분말수화제로 제형화하여 처리하였다.
lycopersici (KACC40043), 잔디 동전마름병균인 Scleotinia homoeocarpa (서울시립대), 고추 탄저병균인 Colletotrichum coccodes (한국화학연구원), 밤나무 줄기마름병균인 Cryphonectria parasitica (충북대학교) 등의 다양한 식물병원성 진균에 대하여 균사 생육 억제활성을 조사하였다. 자단향으로부터 분리한 두 물질은 DMSO로 용해시켜 사용하였다. 균사 생육 억제 활성조사에 사용할 균사체를 얻기 위하여 PDB에 식물병원 균이 배양된 agar plug를 접종하여 25oC에서 7일 동안 정치 배양한 후 멸균한 4겹 거즈에 걸러 얻어진 균사체는 50 mg 생체중/ml의 농도가 되도록 멸균수를 첨가하여 균질화하였다.
비닐은 2일 후에 제거하였고 접종 10일 뒤 이삭의 병발생여부를 관찰하였다. 처리 당 3반복으로 실험을 수행하였으며 모든 반복은 30개의 이삭을 사용하였다. 대조약제로는 difenoconazole과 propiconazole 성분이 각각 13% 함유된 알무리(Syngenta, 한국)를 사용하였으며, 시료처리와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다(Kim 등, 2016).
각 well의 배양액을 10 μl씩 취하여 포자발아 여부를 현미경(100배; Harris Swift M1000-D; Swift Optical Instruments, Schertz, TX, USA)으로 관찰하였다. 포자 발아는 발아관의 길이가 포자 단면의 너비 이상인 경우를 발아로 하였다. 한 처리구 당 3반복하여 실험하였으며 각 well 당 300개 이상의 포자를 관찰하였다.
5 g을 순차적으로 섞어 제형화하였다(Yoon 등, 2010). 포장시험에 사용한 밀 품종은 은파밀이었으며, 개화된 밀 이삭만을 선택하여 500배와 250배로 희석된 분말수화제로 약제가 이삭에서 흘러 내릴 때까지 분무 처리하였다. 약제 처리 24시간 후 F.
데이터처리
Means with the same capital letter in FHB index are not significantly different (P<0.05) according to Duncan’s multiple range test.
성능/효과
자단향 조추 출물을 이용한 생물농약 개발 가능성을 타진하기 위하여 항진 균활성이 가장 강한 n-hexane 분획층을 분말수화제(PS-WP20) 로 제조한 후 밀 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과를 포장에서 조사하였다. PS-WP20을 500배와 250배로 희석하여 포장에서 재배한 밀에 처리한 결과, 각각 47.0%와 87.2%의 방제효과를 보였으며, 대조약제로 사용한 알무리 4000배와 2000배에서는 84.2%와 92.6%의 방제효과를 보였다(Table 2). 자단향 분말수 화제의 경우 본 실험에서는 대조약제 상용농도와 통계적으로 동일한 방제효과를 보여 생물농약으로서의 가능성을 확인하였다.
한편, bioautography assay를 실시하여 EtOAc층에서의 활성물질을 분리한 결과, n-hexane 분획물에서 분리한 항균활성 물질과 동일한 a-cedrol과 widdrol이라는 사실을 발견하였다(data not shown). 결과적으로 F. graminearum의 포자발아를 억제하는 자단향 추출물의 항균활성 물질은 a-cedrol과 widdrol으로 동정되었으며 두 물질은 n-hexane층과 EtOAc층에 분산되어 존재하였다.
graminearum을 포함한 다양한 식물 병원균의 균사생육 억제 활성을 측정하였다. 균사생육 최소억 제농도를 측정한 결과, 두 물질은 시험에 사용한 7가지 식물병 원균 모두의 균사 생육을 저해하였다(Table 1). 전체적으로 α-cedrol이 widdrol보다 높은 항진균활성을 보였지만, M.
또한 두 화합물을 주요 성분으로 포함하고 있는 n-hexane 분획층으로 제조한 분말수 화제는 포장에서 밀 붉은곰팡이병에 대하여 높은 방제효과를 보인다는 사실을 발견하였다. 두 화합물 중에 a-cedrol이 더 항진균활성이 우수하였는데, 만약 자단향으로부터 원료수급이 용이하지 않을 경우 a-cedrol이 15.8% 내지 19.0% 정도를 포함 하고 있는 cedar oil을 이용할 수도 있을 것으로 판단된다. 또한본 연구에서 분리한 두 물질은 F.
graminearum의 균사는 a-cedrol과 widdrol에 대하여 각각 250 mg/l와 500 mg/l의 MIC를 보여 억제활 성이 비교적 낮게 나타냈다. 따라서 두 물질은 F. graminearum 의 균사 생육보다 포자발아에 대한 활성이 더 효과적이라는 결과를 보여주고 있다.
또한 두 물질의 전자충돌 질량스펙트럼 (Electron impact-mass spectrum)을 library search를 한 결과 (Fig. 2B, 3B), 물질 1은 α-cedrol, 물질 2는 widdrol로 동정되었다.
graminearum의 포자 발아억제활성이 우수한 두 개의 sesquitepene계 화합물, 즉 a-cedrol과 widdrol을 분리, 동정하였다. 또한 두 화합물을 주요 성분으로 포함하고 있는 n-hexane 분획층으로 제조한 분말수 화제는 포장에서 밀 붉은곰팡이병에 대하여 높은 방제효과를 보인다는 사실을 발견하였다. 두 화합물 중에 a-cedrol이 더 항진균활성이 우수하였는데, 만약 자단향으로부터 원료수급이 용이하지 않을 경우 a-cedrol이 15.
graminearum의 포자발아를 억제하는 두 개의 물질을 순수분리하였다. 분리한 두 개의 화합물은 GC-MS 분석 결과(Fig. 2A, 3A), 두 물질 모두 total ion chromatogram (TIC) 에서 단일한 피크를 보임으로서 분리한 두 물질이 순수하다는 사실을 확인하였다. 또한 두 물질의 전자충돌 질량스펙트럼 (Electron impact-mass spectrum)을 library search를 한 결과 (Fig.
5 mg/l이었다. 이 두 물질과 비교할 때 자단향 유래 두 물질(a-cedrol의 MIC, 31.25 mg/l; widdrol의 MIC, 62.5 mg/l)은 대계근 유래 polyacetylene계 물질보다 활성이 우수한 것으로 나타 났다.
자단향으로부터 분리한 a-cedrol과 widdrol의 F. graminearum 포자발아에 대한 저해활성을 조사한 결과, 두 물질 모두 농도의존적으로 포자발 아를 효과적으로 억제하였으며, a-cedrol의 MIC가 31.25 mg/l, widdrol은 62.5 mg/l로 a-cedrol이 더 강한 활성을 보였다(Fig.4). Fig.
자단향의 MeOH 추출물로부터 분획과정을 통하여 획득한 n-hexane층, EtOAc층, BuOH층, 물층에 대하여 포자발아 억제 활성을 조사한 결과, n-hexane층과 EtOAc층에서 강한 억제 활성을 나타냈으며, 각각 250 mg/l와 500 mg/l에서 MIC값을 보였으며 Fig. 1에서와 같이 n-hexane층과 EtOAc층, BuOH층이 농도의존적으로 F. graminearum의 포자발아를 억제하였다. 하지만 BuOH층은 2000 mg/l의 농도에서도 100% 억제활성을 보이지 않았으며, 물층은 활성이 없는 것을 확인되었다.
전체적으로 α-cedrol이 widdrol보다 높은 항진균활성을 보였지만, M. oryzae 에 대해서는 α-cedrol보다 widdrol이 더 높은 활성을 보였다.
특히, α-Cedrol의 경우 B. cinerea에 대하여 7.81 mg/l의 MIC를보임으로서 가장 강한 항진균활성을 보였으며 S. homoeocarpa 와 C. coccodes, E. parasitica에 대하여 31.25 mg/l의 MIC를 보였다.
한국식물추출물은행에서 분양받은 100종 한약재 추출물의 F. graminearum 포자발아 억제활성을 분석한 결과 자단향 추출물이 강한 항진균활성을 보였다(data not shown). 자단의 항진균활성에 관한 연구는, 심재부가 아닌 자단의 잎 추출물이 Candida albicans와 Aspergillus niger, Lasiodiploidia, Rhizopus 속의 균사 생육을 억제한다는 보고가 있다(Vandita 등, 2013).
한편, bioautography assay를 실시하여 EtOAc층에서의 활성물질을 분리한 결과, n-hexane 분획물에서 분리한 항균활성 물질과 동일한 a-cedrol과 widdrol이라는 사실을 발견하였다(data not shown). 결과적으로 F.
후속연구
두 물질을 포함한 자단향 추출물을 생물농약으로 개발하기 위해서 추후에 최적원제 선발, 최적제제 개발, 다양한 식물병에 대한 약효·약해시험 및 독성시험을 수행할 예정이다.
0% 정도를 포함 하고 있는 cedar oil을 이용할 수도 있을 것으로 판단된다. 또한본 연구에서 분리한 두 물질은 F. graminearum 외에도 다양한 식물병원성 진균에 우수한 활성을 보였으므로, 이들 식물병에도 적용이 가능한지에 대한 연구가 필요하다고 판단된다. 두 물질을 포함한 자단향 추출물을 생물농약으로 개발하기 위해서 추후에 최적원제 선발, 최적제제 개발, 다양한 식물병에 대한 약효·약해시험 및 독성시험을 수행할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Fusarium graminearum은 무엇인가?
Fusarium graminearum은 전세계적으로 밀, 보리, 벼 등에 붉은곰팡이병을, 옥수수에는 이삭썩음병을 일으키는 원인균으로 곡류의 품질저하와 수확량 감소 등의 경제적 손실을 입힌다고 알려져 있다(Desjardins, 2006; Goswami 등, 2004; McMullen 등, 1997). 우리나라에서도 1963년 남부지방의 맥류 붉은곰팡이병 대발생으로 인해 평균 40-60%, 심한 지역은 80-100%의 맥류수확량이 감소하여 큰 사회적 문제로 대두된 이후(Chung, 1975), 약 10년을 주기로 반복적인 피해를 입은 것으로 보고되었다.
자단향은 어떤 곰팡이들에 대한 항균활성이 알려져있는가?
또한, 자단향 에탄올 추출물이 혈당을 저하시키는 효과가 있으며, 자단향에서 분리한 benzofurans 등의 물질은 항염증 효과와 세포 독성 기능을 가진다고 보고되어 있다 (Nagaraju 등, 1991; Wu 등, 2011). 자단향은 한약재로서의 생리적 기능뿐만 아니라 Candida albicans, Aspergillus niger, Rhizopus속, Fusarium속 등의 곰팡이 균사 생육을 억제한다는 항균활성이 보고되어있으나, F. graminearum에 대한 항진균활 성과 밀 붉은곰팡이병에 대한 방제효과에 대해서는 지금까지 보고된 바가 없다(Jyothi Chaitanya 등, 2014; Vandita 등, 2013).
자단향 추출물의 항진균 활성 물질은 무엇으로 밝혀졌는가?
본 실험을 통하여 자단향으로부터 F. graminearum의 포자 발아억제활성이 우수한 두 개의 sesquitepene계 화합물, 즉 a-cedrol과 widdrol을 분리, 동정하였다. 또한 두 화합물을 주요 성분으로 포함하고 있는 n-hexane 분획층으로 제조한 분말수 화제는 포장에서 밀 붉은곰팡이병에 대하여 높은 방제효과를 보인다는 사실을 발견하였다.
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