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문제 정의
- 본 연구는 농업 생산성과 관계 있는 뿌리의 생장발육과 뿌리에 미치는 토양의 압박 스트레스의 연관 관계를 연구하기 위하여 무성생식의 모델 식물인 Kalachoe를 선택하였다. 그 이유는 여러 종류 스트레스에 반응하고 스트레스를 받을 경우 빨리 반응하여서 체세포 배를 형성함으로써 스트레스 여부를 표현형으로 알려주기 때문이다.
제안 방법
- Kalanchoe pinnata의 뿌리 압박 효과를 고농도 agar 농도를 사용하여 외부 스트레스 요인에 따른 체세포 배 형성 및 기관분화 경향의 변화를 관찰하고 이러한 현상을 조직학적으로 연구하였다.
- Agar 0.5% 배지의 배양병에서 자란 K. pinnata의 줄기를 microtechnique을 사용하여 횡단 및 종단 방향으로 절단한 뒤 줄기에서 plantlet, 줄기, 뿌리의 분화를 관찰하였다. 다량의 세포가 집적되어 뿌리 등의 조직이 발생할 부분을 관찰할 수 있었다[Fig.
- Agar 농도에 따른 실험은 14시간 30분 명처리와 9시간 30분 암 처리하여 22 ~ 24°C로 조절된 low temp incubator에서 식물을 성장시켰다.
- Agar 농도에 따른 실험은 14시간 30분 명처리와 9시간 30분 암 처리하여 22 ~ 24°C로 조절된 low temp incubator에서 식물을 성장시켰다. Incubator 안의 조명은 1,010 lm 의 광도를 지닌 식물재배용 형광등 PG램프 4개를 통해 빛을 제공했으며, 습도는 50 ~ 80%로 유지하며 접종 후 50일 동안 성장시켰다.
- MS배지에 agar 농도를 서로 달리 하여 0.5 ~ 1.5%씩 첨가하여 autoclave (121°C, 20분)한 후 멸균된 배양병에 분주하거나 또는 멸균된 plastic petri dish에 분주하여 실험에 사용하였다.
- 5 mm 이내의 조각으로 절단하여 FAA (formalin, acetic acid, ethyl alcohol)용액으로 36시간 실온에서 고정시킨 후 alcohol 상승농도 순서로 탈수하고 xylen으로 치환하였다. Xylen치환된 조직을 순수 paraffin으로 침투, 매몰시켜서 rotary microtom으로 10 ㎛ 두께로 절단하고 0.05% toluidine blue에 30분 염색을 한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 그 이유는 여러 종류 스트레스에 반응하고 스트레스를 받을 경우 빨리 반응하여서 체세포 배를 형성함으로써 스트레스 여부를 표현형으로 알려주기 때문이다. 또 뿌리 스트레스를 식물에 주면서 오랜 기간 배양 실험을 하기 위하여서 흙을 사용한 토양 압박 실험보다는 효율적이고 정량적인 토양 압박현상과 유사한 효과를 시도하기 위해서 여러 agar 농도를 사용한 기내 배양 방법을 사용하였다.
- 배양병에 접종할 때는 실험실에서 성장시킨 K. pinnata의 체세포 배를 채취한 뒤 2%의 NaOCl로 10분간 표면살균한 다음 clean bench에서 멸균수로 5회 세척한 후 체세포 배를 3개씩 접종하였으며, petri dish에 접종할 때에는 위와 같은 방법으로 체세포 배를 5개씩 접종하였다.
- Kalanchoe pinnata의 뿌리 압박 효과를 고농도 agar 농도를 사용하여 외부 스트레스 요인에 따른 체세포 배 형성 및 기관분화 경향의 변화를 관찰하고 이러한 현상을 조직학적으로 연구하였다. 스트레스 요인으로 배양배지에서 agar의 농도를 0.5%에서 1.5%까지의 범위로 조성하여 뿌리에 압박효과를 야기하였고, 이후 K. pinnata의 줄기와 잎 등을 microtechnique 방법으로 조직의 변화를 연구하였다. In vivo에서 K.
- 식물체를 1.5 mm × 1.5 mm 이내의 조각으로 절단하여 FAA (formalin, acetic acid, ethyl alcohol)용액으로 36시간 실온에서 고정시킨 후 alcohol 상승농도 순서로 탈수하고 xylen으로 치환하였다.
- 3D]. 인위적인 스트레스로 agar가 사용되어서 1.5% agar 농도를 포함한 배지에서는 외부 환경의 스트레스인 수분부족, 과도한 햇빛, 영양결핍에서 나타나는 plantlet 형성을 관찰하였다[Fig. 3D]. 이러한 비정상적인 plantlet 형성은 정단분열조직의 비정상적 형성과 관계가 있을 것이라 생각된다.
대상 데이터
- 배지 제조에 쓰인 MS (Murashige & Skoog) 배지는 Duchefa Biochemie에서 구입하였고 agar는 Becton, Dickinson and Company 사의 Bacto Agar를 사용하였다.
-
Agar 농도에 따른 식물 배양
배지는 일반적으로 식물조직배양에서 쓰이는 MS배지를 이용하였으며, 1N NaOH과 1N HCl을 사용하여 pH 5.7 ~ 5.8로 조정하였다. MS배지에 agar 농도를 서로 달리 하여 0.
- 본 실험에 사용한 Kalanchoe pinnata 는 실험실 창가에서 생장 시켜서 발생된 소식물체를 멸균 처리하여 사용하였다. 이때 실험실 창가의 생육 조건은 28±1°C, 3000 lux광도에 8H/16H 장주기 조건이었다.
- 현대적인 농업기계발달과 그에 따른 집약농업 발달은 토양 압축을 야기하고 뿌리에 압박 스트레스를 가하여 생육을 저하시킨다. 뿌리에 압박스트레스를 작용하여 식물 생장발육에 영향과 생식의 변화 양상을 연구하기 위해 Kalanchoe pinnata를 사용하였다. K.
성능/효과
- 5%의 배지에서만 잎에서 plantlet 발생현상이 나타났다. Agar 농도의 차이는 K. pinnata의 뿌리에 스트레스 요인으로 작용하여 무성생식의 양상이 뿌리에서 포기 나누기 방법에서 잎에서 소식물체 형성으로 변화하는 경향을 나타났다. 이는 뿌리 압박 효과가 스트레스로 작용하여 식물 생식 양상을 변화 시킬 수 있게 되는 것으로 사료된다.
- K. pinnata의 plantlet 개수를 agar 농도별로 비교하여 K. pinnata의 특징 중 하나인 잎의 만곡부에서 발생하는 무성생식방식의 plantlet의 형성 및 발달에 영향을 주는지에 대해 실험한 결과, agar 1.5% 농도를 제외한 나머지 농도에서는 plantlet이 발생하지 않는 현상이 나타났다[Fig. 3D]. 인위적인 스트레스로 agar가 사용되어서 1.
- 그러나 뿌리에서 받는 스트레스가 잎에 전달되어서 배 발생을 유도 할 경우는 내부기원설이 더욱 설득력 있게 설명 될 수 있다. 그리고 본 연구의 0.5% agar배지에서 포기 나누기식 무성생식으로 개체 수가 증식하는 것과, 1.5% agar배지에서 체세포 배형성에 따른 개체 수 증식 조직에서 관찰되는 유관속 형성조직에서 기원되는 체세포 배형성 과정은 내부기원설을 설명하는데 효과적이다. 그 이유는 뿌리 압박스트레스 유무에 관계없이 무성생식은 내부기원이지만 스트레스가 주어질 때는 무성생식 방식이 뿌리에서 잎으로 바뀌는데 식물내부기관에서 스트레스를 전달하는 가능성을 설명하기 때문이다.
- 길이생장을 많이 할수록 개체 개수당 길이는 길어지며 이는 곧 무게와 연결된다. 따라서, 길이를 비교한 것과 마찬가지로 agar 농도가 낮음에 따라 생체량이 증가하며 농도가 높아지면 생체량이 상대적으로 낮은 현상을 나타내었다. 저농도의 agar는 생장발육에 있어서 스트레스로 작용하지 않기 때문에 정상적인 발육을 하여서 뿌리에서 포기나누기방법의 무성생식으로 개체량이 종합적으로 증가한다.
- 또한 유관속 및 중심주가 일반적인 쌍자엽식물의 줄기가 아닌 뿌리와 유사하며, agar 0.5% 에서의 K. pinnata는 배지의 경계면 근처에서 직접 plantlet과 뿌리, shoot를 유관속으로부터 분화시키는 것을 알 수 있었다[Fig. 5]. 측근은 유관속초에서 발생하는 것을 관찰하였다[Fig.
- 기내배양 연구에서 agar의 농도가 낮을수록 개체 수의 증가 및 생체량의 증가가 빠르지만 잎 만곡부에서 plantlet의 발생은 나타나지 않는 경향을 나타냈다. 반면에 agar의 농도가 증가할수록 개체수의 증가가 낮은 경향을 나타났다. 또한 agar 1.
- Kalanchoe pinnata는 잎의 만곡부에서 형성되는 체세포 배에 의해 무성생식 하는 것으로 알려져 왔고 체세포 배 형성을 증가시키는 원인은 강한 빛, 고온 생육조건, 습도 부족, 물 공급 부족에 의한 것으로 알려져 왔다(Koltunow and Grossniklaus, 2003, Arnold et al, 2002). 본 실험 결과에 의하면 agar 고농도(1.5%)에 따른 뿌리의 발육 저하가 잎에서 체세포 배 형성의 중요한 원인이 될 수 있음을 보여준다. Agar의 농도가 높아짐에 따라 강한 빛, 고온 생육조건, 저습도, 건조한 환경과 유사하게 생육이 지연되면서 잎에서 plantlet이 증가하는 것은 뿌리의 발육상태가 나빠지는 고농도의 단단한 agar 배지가 뿌리로 번식하는 삽목, 포기나누기 방법 등의 무성생식현상을 저해하는 스트레스의 일종으로 식물이 받아들이기 때문으로 생각된다(Pedroso and Durzan, 2000).
- 2]. 서로 다른 agar 농도의 배양병에서 60일 가량 성장시킨 K. pinnata의 줄기 길이, 무게, 개수, 그리고 plantlet의 개수를 agar 농도별로 비교한 결과, agar 농도가 낮을수록 agar 농도가 높은 배지의 식물체 보다 줄기, 즉 뿌리에서 포기나누기방법의 무성생식으로 개체 수가 증가하는 경향을 나타내었다. 식물의 생체량(biomass)을 파악하기 위하여 줄기 길이를 측정한 결과, agar 농도가 낮은 배지 위의 식물은 agar 농도가 높은 배지의 식물보다 길이생장을 많이 이루었다.
- pinnata의 줄기 길이, 무게, 개수, 그리고 plantlet의 개수를 agar 농도별로 비교한 결과, agar 농도가 낮을수록 agar 농도가 높은 배지의 식물체 보다 줄기, 즉 뿌리에서 포기나누기방법의 무성생식으로 개체 수가 증가하는 경향을 나타내었다. 식물의 생체량(biomass)을 파악하기 위하여 줄기 길이를 측정한 결과, agar 농도가 낮은 배지 위의 식물은 agar 농도가 높은 배지의 식물보다 길이생장을 많이 이루었다. agar 농도가 낮을수록 식물체의 길이가 길어지는 경향을 나타냈으며 agar 농도가 높을수록 농도가 낮은 식물체와 반대로 줄기 길이가 짧아지는 경향을 나타냈다[Fig.
- 외부 스트레스에 반응하여 plantlet를 형성하는 무성생식방법을 응용하여 뿌리발생과 무성생식의 연관관계를 연구하기 위하여 agar 농도를 달리한 MS배지에서 K. pinnata를 배양한 결과, 0.5%, 0.8%, 1.0%, 1.5% agar농도에서 생육 변화가 뚜렷하게 관찰되었다. 저농도(0.
- 유일하게 plantlet이 발생한 agar 1.5% 배지에서 생장시킨 K. pinnata 잎의 만곡부에 있는 plantlet 형성 부위를 횡단 절단하여 관찰한 결과, 체세포 배 형성조직을 기점으로 유관속이 점차 바깥으로 뻗어 나가는 것을 관찰할 수 있었으며, 뻗어 나간 유관속은 바로 옆의 체세포 배 형성조직과 연결되는 것을 확인하였다[Fig. 7].
- 3C]. 즉, agar 농도가 낮을수록 뿌리에서 포기나누기방법의 무성생식으로 개체수가 빠르게 증가하는 경향이 있으나 잎 만곡부에서 무성생식 방법의 plantlet 발생은 거의 없었으며, agar 농도가 높은 배지에서는 개체수의 증가가 낮은 경향을 나타냈다.
- 3A]. 즉, agar의 농도가 낮은 배지에서는 agar농도가 높은 배지보다 생체량이 빠르게 증가하는 경향을 나타내었음을 알 수 있다.
후속연구
- 우리가 kalanchoe 식물의 영양번식에 영향을 줄 수 있는 유전자 선발 연구에서 stress에 의해서 증가될 수 있는 anthocyanin 축적 유전자와 상관관계가 있다는 것을 제시하였다(Jung et al, 2011). 앞으로 뿌리와 토양 압박에 관한 연구를 많이 수행하여 이에 효과적인 유전자 연구가 활발히 계속된다면 뿌리 압박에 관한 stress가 밝혀질 것을 기대한다.
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