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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 식품 중 분석법이 확립되어 있지 않은 알긴산프로필렌글리콜의 분석법을 개발하고자 HPLCsize-exclusion chromatography를 이용하여 알긴산프로필렌글리콜에 대하여 직접분석법을 개발하였다. 식품 중 함유량을 확인하기 위한 시료 전처리방법을 확립하였으며, 분석법에 대한 검증을 실시하여 확립된 분석법에 대한 신뢰성과 유용성을 확보하였고, 이 분석법을 적용하여 유통 중 식품 134 품목에 대하여 모니터링을 실시하였다.
- . 본 연구에서는 식품에 사용되는 알긴산프로필렌글리콜(함량 100%)을 표준품으로서 사용하여 이를 용해하고자 용매선정 실험을 실시하였다(data not shown). 물, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 질산나트륨(NaNO3), 황산나트륨(Na2SO4), 인산나트륨(Na2HPO4)에 대하여 각각 0.
가설 설정
- 1)Data are mean ± SD (n = 3).
- 2)ND, not detected and/or less than LOD.
제안 방법
- PGA 분석을 위한 HPLC 조건 중 이동상 유속을 비교하기 위하여 위에서 선정된 GF-7M HQ column에 대하여 ELSD로 분석하여 비교하였다(data not shown). 이동상의 유속을 0.
- PGA 분석을 위한 시료 전처리 방법을 확립하기 위하여 지방제거, 지방 및 단백질제거, 추출온도에 따른 실험을 진행하였다. 시료의 지방성분 제거를 위하여 PGA가 첨가된 시료 10 g을 250-mL 삼각플라스크에 넣고 증류수 90 mL를 가하여 30분 동안 초음파 추출하였다.
- PGA 분석조건 설정을 위한 column 선정을 위해 sizeexclusion column 중 종류 및 제한 분자량(exclusion limit M.W.)에 따라 GF-7M HQ (9 μm, 7.5 mm i.d. × 300 mm, exclusion limit M.W.: 10,000,000, Showa Denko K.K., Tokyo, Japan), OHpak SB-804HQ (8 μm, 8.0 mm i.d. × 300 mm, exclusion limit M.W.: 1,000,000, Showa Denko K.K., Tokyo, Japan), OHpak SB-806HQ (8 μm, 8.0 mm i.d. × 300 mm, exclusion limit M.W.: 20,000,000, Showa Denko K.K., Tokyo, Japan)에 대하여 검토하였다.
- 식품 시료 중 PGA의 추출을 위해 분쇄한 라면에 PGA를 1%(w/w) 첨가한 후 온도에 따른 추출 실험을 진행하였다(data not shown). PGA는 60oC까지는 비교적 안정하나 끓이면 급격히 점도가 저하되는 성질이 있어, 추출 온도를 20, 40, 60oC에서 진행하였으며, 150 rpm에서 3시간 동안 incubation 추출하여 원심분리한 후 HPLC 분석을 하였다. 추출온도에 따른 실험 결과 20oC에서 3시간 추출한 경우 PGA 피크와 시료의 분리도가 40 및 60oC에서 추출한 경우 보다 좋게 나타났으며, 추출온도가 높을수록 분리도가 나빠지는 것을 확인하였다.
- 또한 분리능 개선을 위해 단일 column과 2개의 column을 연결하여 분리정도를 비교실험 하였다. PGA분석을 위한 이동상을 선정하기 위해 water 및 sodium phosphate buffer를 isocratic 방법으로, water와 30% methanol을 gradient 방법으로 하여 비교하였다. 또한 이동상의 유속 설정을 위해 0.
- PGA의 검량선 작성을 위한 표준용액 제조는 시료 분말에 PGA 표준품을 3,000, 5,000, 7,000, 10,000, 15,000 mg/kg이 되도록 첨가하고 이 중 10 g을 취하여 시료 전처리 방법과 동일하게 처리 한 후 100 mL로 정용하여 이 용액을 10배 희석된 표준용액으로 사용하였다.
- PGA의 검량선 작성을 위한 표준용액제조는 PGA가 첨가되지 않은 음성 시료 분말에 PGA 표준품을 3,000, 5,000, 7,000, 10,000, 15,000 mg/kg이 되도록 첨가하고, 이 중 10 g을 정량하여 시료 전처리 방법과 동일하게 처리 한 후 100 mL로 정용하여 이 용액을 10배 희석된 표준용액으로 사용하였다. 이때 작성된 검량선 표준용액의 범위는 300, 500, 700, 1,000, 1,500 mg/kg이었다.
- 8 mL/min이었으며, injection volume 10 μL로 분석하였다. UV/VIS detector의 경우 210 nm에서 분석하였으며, LT-ELSD는 evaporation tube 온도 45oC, 3.5bar (N2 gas)의 조건에서 분석하였다.
- × 300 mm)를 사용하였으며, detector는 RI, UV/VIS, ELSD를 사용하였다. 각 column 및 detector에 대하여 표준품의 농도 312.5, 625, 1,250, 2,500 ppm으로 분석하였으며, RI와 UV/VIS detector의 경우 이동상으로 50 mM sodium phosphate buffer를 사용하였고, ELSD의 경우 HPLC grade water로 isocratic 조건과 water와 30% methanol을 사용하여 gradient 조건으로 비교하였다.
- 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)를 구하기 위해 저농도를 선택하여 검량선을 작성하고, 중간농도를 7회 분석하여 얻은 표준편차(SD, σ)를 사용하여, 3.3 × σ/S (σ: 반응의 표준편차, S: 검량선의 기울기)를 검출한계(LOD)로, 10 × σ/S를 정량한계(LOQ)로 산출하였다.
- , Tokyo, Japan)에 대하여 검토하였다. 또한 분리능 개선을 위해 단일 column과 2개의 column을 연결하여 분리정도를 비교실험 하였다. PGA분석을 위한 이동상을 선정하기 위해 water 및 sodium phosphate buffer를 isocratic 방법으로, water와 30% methanol을 gradient 방법으로 하여 비교하였다.
- 따라서 식품 중 PGA 분석의 경우 대상 식품과 유사한 조성으로 이루어진 음성(blank) 시료를 선택하여 그 시료에 표준품을 혼합하고 시료 전처리 방법과 동일하게 추출하여 검량선을 작성하였다. 또한 식품 시료에 따라 base line이 안정적으로 유지되는 경우는 표준품을 검량선 농도에 맞게 D.W.에 용해하여 검량선을 작성하여 이를 시료정량 시 사용하였다.
- PGA분석을 위한 이동상을 선정하기 위해 water 및 sodium phosphate buffer를 isocratic 방법으로, water와 30% methanol을 gradient 방법으로 하여 비교하였다. 또한 이동상의 유속 설정을 위해 0.6 및 0.8 mL/min으로 분석하여 표준품의 분리능 및 피크모양을 비교하였다.
- 본 연구에서는 식품에 사용되는 알긴산프로필렌글리콜(함량 100%)을 표준품으로서 사용하여 이를 용해하고자 용매선정 실험을 실시하였다(data not shown). 물, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 질산나트륨(NaNO3), 황산나트륨(Na2SO4), 인산나트륨(Na2HPO4)에 대하여 각각 0.05, 0.1, 0.2, 0.3 M 농도별로 제조하고 알긴산프로필렌글리콜 1%를 첨가하여 용해정도를 확인하였다. 알긴산프로필렌글리콜은 물에서 완전히 용해되었으며, 유기용매에서 농도에 관계없이 용해되지 않고 침전되었다.
- 본 연구에서 분석법 검증을 위하여 ICH 가이드라인11)에 따라 직선성, 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ), 정밀도, 정확도를 산출하였다. 표준용액을 가지고 시험방법에 따라 각 3회 반복 실험하여 검량선을 작성하여 상관계수(correlation coefficient, R2)를 확인하였다.
- 식품 시료 중 PGA의 추출을 위해 분쇄한 라면에 PGA를 1%(w/w) 첨가한 후 온도에 따른 추출 실험을 진행하였다(data not shown). PGA는 60oC까지는 비교적 안정하나 끓이면 급격히 점도가 저하되는 성질이 있어, 추출 온도를 20, 40, 60oC에서 진행하였으며, 150 rpm에서 3시간 동안 incubation 추출하여 원심분리한 후 HPLC 분석을 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 식품 중 분석법이 확립되어 있지 않은 알긴산프로필렌글리콜의 분석법을 개발하고자 HPLCsize-exclusion chromatography를 이용하여 알긴산프로필렌글리콜에 대하여 직접분석법을 개발하였다. 식품 중 함유량을 확인하기 위한 시료 전처리방법을 확립하였으며, 분석법에 대한 검증을 실시하여 확립된 분석법에 대한 신뢰성과 유용성을 확보하였고, 이 분석법을 적용하여 유통 중 식품 134 품목에 대하여 모니터링을 실시하였다.
- 식품에 첨가하는 알긴산프로필렌글리콜의 분석을 위하여 size-exclusion column을 활용한 HPLC 분석법을 확립하고자 3 종류의 column 및 detector를 비교하였다(Fig. 2). Column은 GF-7M HQ (9 μm, 7.
- 식품에 함유된 지방 및 단백질 성분의 제거가 PGA 피크의 분리능에 영향을 주는지 확인하고자 시료에 n-hexane, trichloroacetic acid (TCA) 및 trifluoroacetic acid (TFA) 처리를 하여 GF-7M HQ column에 물을 이동상으로 하여 ELSD로 분석하였다(data not shown). 시료의 지방제거를 위해 n-hexane 처리 후 분석해 본 결과 시료 및 시료에 PGA를 spike한 경우 모두 n-hexane 처리에 따른 피크의 변화가 나타나지 않았다.
- 시료의 지방성분 제거를 위하여 PGA가 첨가된 시료 10 g을 250-mL 삼각플라스크에 넣고 증류수 90 mL를 가하여 30분 동안 초음파 추출하였다. 이를 원심분리하여 100 mL로 정용한 후 분액깔대기에 넣고 n-hexane 20 mL를 넣어 혼합한 후 물층을 회수하여 이를 분석하였다. 지방 및 단백질 저거를 위하여 지방제거 실험과 동일하게 추출하고 이에 5% TCA (trichloroacetic acid) 또는 2M TFA (trifluroacetic acid)를 1:1의 비율로 처리한 후 원심분리하고 이를 분석하였다.
- 정확성을 위하여 라면시료에 알긴산프로필렌글리콜 표준품을 3가지 농도(300, 700, 1,500 mg/kg)로 첨가하여 3회 반복하여 분석하였다. 정밀성을 확인하기 위한intra-day 정밀도는 1일간 반복하여 얻은 변동계수(coefficient of variation, CV, %)로 표현하였다.
- 정확도를 확인하기 위하여 동일조건하에서 같은 검체를 하루에 3번 반복 실험하는 일내 분석(intra-day assay) 및 3일동안 같은 검체를 반복 실험하는 일간 분석(inter-day assay)을 시행하였다(Table 2). Size-exclusion column을 이용한 HPLC 분석을 통해 300, 700, 1,500 mg/kg의 농도로 3회 반복하여 분석한 결과 intra-day의 경우 86.
- 3 × σ/S (σ: 반응의 표준편차, S: 검량선의 기울기)를 검출한계(LOD)로, 10 × σ/S를 정량한계(LOQ)로 산출하였다. 정확성을 위하여 라면시료에 알긴산프로필렌글리콜 표준품을 3가지 농도(300, 700, 1,500 mg/kg)로 첨가하여 3회 반복하여 분석하였다. 정밀성을 확인하기 위한intra-day 정밀도는 1일간 반복하여 얻은 변동계수(coefficient of variation, CV, %)로 표현하였다.
- 이를 원심분리하여 100 mL로 정용한 후 분액깔대기에 넣고 n-hexane 20 mL를 넣어 혼합한 후 물층을 회수하여 이를 분석하였다. 지방 및 단백질 저거를 위하여 지방제거 실험과 동일하게 추출하고 이에 5% TCA (trichloroacetic acid) 또는 2M TFA (trifluroacetic acid)를 1:1의 비율로 처리한 후 원심분리하고 이를 분석하였다. 추출 온도에 따른 전처리 시험은 PGA가 첨가된 시료 10 g을 250-mL 삼각플라스크에 취하고 증류수 90 mL를 넣어 혼합한 후 20, 40, 60oC의incubator에서 150 rpm으로 3시간 추출하였으며, 이를 8,260 × g으로 30분간 원심분리하고 이를 분석하였다.
- 추출 온도에 따른 전처리 시험은 PGA가 첨가된 시료 10 g을 250-mL 삼각플라스크에 취하고 증류수 90 mL를 넣어 혼합한 후 20, 40, 60oC의incubator에서 150 rpm으로 3시간 추출하였으며, 이를 8,260 × g으로 30분간 원심분리하고 이를 분석하였다.
- 범위는 적절한 정밀성, 정확성 및 직선성을 충분히 제시할 수 있는 검체 중 분석대상 물질 양(또는 농도)의 하한 및 상한 값 사이의 영역을 말한다. 표준용액 조제 이후 3일간 검량선을 작성하여 검량선의 변동 추이를 확인하였다. 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)를 구하기 위해 저농도를 선택하여 검량선을 작성하고, 중간농도를 7회 분석하여 얻은 표준편차(SD, σ)를 사용하여, 3.
- 표준품 피크 이외 다른 피크가 검출되는 SB-806 HQcolumn을 활용하여 동일 column 두 개를 연결하여 분석하였을 경우 분리능이 개선되는지 여부를 확인하고자 표준품 농도에 따라 RI와 UV/VIS detector를 이용하여 비교하였다(data not shown). 동일 column 두 개를 연결하여 PGA를 분석한 결과 분리능이나 피크 모양이 단일 column으로 분석한 경우와 큰 차이를 나타내지 않았으며, column이 길어져 분석시간 역시 길어지는 문제점이 있었다.
- 확립된 HPLC-SEC 분석법을 이용하여 국내 유통 식품 134 품목을 대상으로 알긴산프로필렌글리콜 함량을 조사하였다(Table 3). 식품 중 알긴산프로필렌글리콜이 검출된 시료는 40품목이었으며, 식품유형별로 분류하면 절임식품 1품목(검체수 10품목), 과자류 5품목(검체수 15품목), 드레싱류 2품목(검체수 15품목), 과·채가공품 3품목(검체수 14품목), 치즈 8품목(검체수15품목), 토마토케찹 7품목(검체수 10품목), 면류 14품목(검체수 30품목)으로 확인되었다.
대상 데이터
- Column은 GF-7M HQ (9 μm, 7.5 mm i.d. × 300 mm), OHpak SB-804HQ (8 μm, 8.0 mm i.d. × 300 mm), OHpak SB-806HQ (8 μm, 8.0 mm i.d. × 300 mm)를 사용하였으며, detector는 RI, UV/VIS, ELSD를 사용하였다.
- Detector의 경우 GF-7M HQ로 분석할 때 RI, UV/VIS, ELSD 모두 직선성을 나타내었으나, RI와 UV/VIS detector의 경우 용매피크로 추정되는 피크가 검출되었으며, ELSD detector의 경우 피크 높이나 모양이 우수하여 PGA 분석을 위한 detector로 ELSD를 선정하였다. ELSD detector로 분석할 때 이동상으로 water와 30% methanol을 gradient로 분석하여 시료의 분리능을 개선하고자 하였으나, 표준품의 피크모양이 적합하지 않은 결과를 나타내었다.
- 국내에서 유통하는 식품을 절임식품, 발효음료류, 과자류, 드레싱류, 과채가공품, 치즈, 케찹, 주류, 면류, 밀가루류 등으로 구분하여 134품목의 시료를 구입하여 알긴산프로필렌글리콜의 함량을 확인하였다. 분쇄한 시료 10 g을 250-mL 삼각플라스크에 넣고 D.
- 본 연구에서 검토한 기기는 HPLC (LC-20A, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하였으며, detector는 RI (RID10A, Shimadzu, Kyoto, Japan), UV/VIS detector (SPD-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan), LT-ELSD (SEDEX 80, SEDERE, Olivet, France)를 사용하였다. Column 오븐 온도는 35oC,이동상의 유속은 0.
- 연구에 사용한 증점제 표준품은 propylene glycol alginate(KIMICA Corporation, Chiba, Japan)을 사용하였다. 시험에 사용된 sodium phosphate dibasic, sodium phosphate monobasic은 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, HPLC grade water는 Thermo Fisher Scientific(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 그 이외의 시약들은 모두 특급 시약을 사용하였다.
- 연구에 사용한 증점제 표준품은 propylene glycol alginate(KIMICA Corporation, Chiba, Japan)을 사용하였다. 시험에 사용된 sodium phosphate dibasic, sodium phosphate monobasic은 Sigma-aldrich (St.
데이터처리
- , Cary, NC, USA)를 이용하여 실시하였다12). 실험에 대한 평균값과 표준편차를 계산하였다.
-
통계처리
통계분석은 SAS (Statistical analysis system, SAS version 9.4, SAS institute INC., Cary, NC, USA)를 이용하여 실시하였다12). 실험에 대한 평균값과 표준편차를 계산하였다.
- 에 따라 직선성, 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ), 정밀도, 정확도를 산출하였다. 표준용액을 가지고 시험방법에 따라 각 3회 반복 실험하여 검량선을 작성하여 상관계수(correlation coefficient, R2)를 확인하였다. 범위는 적절한 정밀성, 정확성 및 직선성을 충분히 제시할 수 있는 검체 중 분석대상 물질 양(또는 농도)의 하한 및 상한 값 사이의 영역을 말한다.
성능/효과
- Detector의 경우 GF-7M HQ로 분석할 때 RI, UV/VIS, ELSD 모두 직선성을 나타내었으나, RI와 UV/VIS detector의 경우 용매피크로 추정되는 피크가 검출되었으며, ELSD detector의 경우 피크 높이나 모양이 우수하여 PGA 분석을 위한 detector로 ELSD를 선정하였다. ELSD detector로 분석할 때 이동상으로 water와 30% methanol을 gradient로 분석하여 시료의 분리능을 개선하고자 하였으나, 표준품의 피크모양이 적합하지 않은 결과를 나타내었다. 따라서 ELSD detector 분석을 위한 이동상으로 water를 단일로 사용하는 것이 적합할 것으로 판단하였다.
- Size-exclusion column을 이용한 HPLC 분석법을 통하여 PGA의 검출한계와 정량한계를 측정한 결과 검출한계(LOD)는 171.43 mg/kg을 나타내었으며, 정량한계(LOQ)는 519.50mg/kg을 나타내었다(Table 1). 해조류의 polysaccharide를 분석한 연구15)에서 alginate의 LOD와 LOQ는 각각 0.
- 정확도를 확인하기 위하여 동일조건하에서 같은 검체를 하루에 3번 반복 실험하는 일내 분석(intra-day assay) 및 3일동안 같은 검체를 반복 실험하는 일간 분석(inter-day assay)을 시행하였다(Table 2). Size-exclusion column을 이용한 HPLC 분석을 통해 300, 700, 1,500 mg/kg의 농도로 3회 반복하여 분석한 결과 intra-day의 경우 86.1~110.4%의 회수율을 나타내었으며, inter-day의 경우 98.1~105.8%의 회수율을 나타내어 일내와 일간 분석에서 우수한 결과를 나타내었다. 정밀도를 분석한 결과 intra-day의 경우 4.
- 검량선 작성에 사용한 표준용액의 범위는 300, 500, 700,1,000, 1,500 mg/kg이었으며, 검량선의 범위는 PGA의 식품 중 사용기준인 1% 이하6)에 적합할 것으로 생각되었다. PGA 표준용액으로 작성된 검량선의 상관계수(R2 )값은0.
- 표준품 피크 이외 다른 피크가 검출되는 SB-806 HQcolumn을 활용하여 동일 column 두 개를 연결하여 분석하였을 경우 분리능이 개선되는지 여부를 확인하고자 표준품 농도에 따라 RI와 UV/VIS detector를 이용하여 비교하였다(data not shown). 동일 column 두 개를 연결하여 PGA를 분석한 결과 분리능이나 피크 모양이 단일 column으로 분석한 경우와 큰 차이를 나타내지 않았으며, column이 길어져 분석시간 역시 길어지는 문제점이 있었다. 따라서 PGA 분석을 위해 단일 column을 사용하는 것이 적합할 것으로 판단하였다.
- ELSD detector로 분석할 때 이동상으로 water와 30% methanol을 gradient로 분석하여 시료의 분리능을 개선하고자 하였으나, 표준품의 피크모양이 적합하지 않은 결과를 나타내었다. 따라서 ELSD detector 분석을 위한 이동상으로 water를 단일로 사용하는 것이 적합할 것으로 판단하였다. Ci 등13)의 연구에서 alginate를 PDA와 RI의 조건에서 분석하였는데, PDA 조건의 경우 본 연구와 동일하게 210 nm에서 분석하였다.
- GF-7M HQ column의 경우 3 종류의 detector에 대하여 모두 피크모양 및 직선성을 기준으로 적합성을 나타내었다. 따라서 PGA 분석을 위한 column으로 detector에 따라 SB-806 HQ와 GF-7M HQ가 적합할 것으로 판단하였다.
- 동일 column 두 개를 연결하여 PGA를 분석한 결과 분리능이나 피크 모양이 단일 column으로 분석한 경우와 큰 차이를 나타내지 않았으며, column이 길어져 분석시간 역시 길어지는 문제점이 있었다. 따라서 PGA 분석을 위해 단일 column을 사용하는 것이 적합할 것으로 판단하였다. Size-exclusion chromatography를 통하여 유청단백질을 분리한 연구14)에서 동일한 column 3개를 연결하여 분리한 결과가 있으나, 분석시간이 70 min으로 본 연구와 유사하게 길게 나타났다.
- 따라서 PGA 분석하기 위한 HPLC 방법은 GF-7M HQ (9 μm, 7.5 mm I.D. × 300 mm) column을 사용하여 water를 0.8 mL/min의 유속으로 하는 이동상 조건에서 ELSD로 분석하는 것이 적합할 것으로 판단되었다.
- 시료의 지방제거를 위해 n-hexane 처리 후 분석해 본 결과 시료 및 시료에 PGA를 spike한 경우 모두 n-hexane 처리에 따른 피크의 변화가 나타나지 않았다. 따라서 시료에 있는 PGA와 유사한 시간에 나타나는 피크의 경우 지방성분이 아닌 것으로 판단되며, 분석을 위한 전처리로 적합하지 않는 것으로 생각되었다.
- 이는 시료내의 성분들이 추출 온도에 따라 영향을 나타내는 것으로 추측된다. 따라서 식품 중 PGA 성분을 추출하는 조건으로 20oC, 150 rpm에서 3시간 추출하는 것이 적합할 것으로 판단되었다.
- 1 M 이상의 농도에서 용해되었다. 따라서 알긴산프로필렌글리콜 용해 용매로써 물 또는 인산나트륨 buffer가 적합할 것으로 판단하였다.
- 시료의 지방 및 단백질 성분의 제거를 위해 n-hexane처리 후 TCA 또는 TFA를 처리한 결과 시료뿐만 아니라 PGA를 spike한 시료에서도 PGA 피크가 검출되지 않았다. 또한 처리 전보다 저분자 물질이 검출되는 시간대의 피크가 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 TCA나 TFA 처리에 의해 시료의 고분자 물질이 분해되는 것을 알 수 있었으며, PGA 역시 TCA나 TFA 처리에 의해 영향이 있음을 확인하였다.
- 식품 중 알긴산프로필렌글리콜이 검출된 시료는 40품목이었으며, 식품유형별로 분류하면 절임식품 1품목(검체수 10품목), 과자류 5품목(검체수 15품목), 드레싱류 2품목(검체수 15품목), 과·채가공품 3품목(검체수 14품목), 치즈 8품목(검체수15품목), 토마토케찹 7품목(검체수 10품목), 면류 14품목(검체수 30품목)으로 확인되었다. 발효음료류와 주류의 경우 각각 15품목, 10품목의 검체에서 불검출로 확인되었다.
- 본 연구에서 분석한 식품 중 알긴산프로필렌글리콜은 절임식품(불검출-0.31%), 과자류(불검출-0.27%), 드레싱류(불검출-0.39%), 과·채가공품(불검출-0.33%), 치즈(불검출0.22%), 토마토케찹(불검출-0.28%), 면류(불검출-0.24%)에서 확인되었으며, 분석대상 시료 모두 식품첨가물공전6)에서 제시한 알긴산프로필렌글리콜의 사용기준인 1% 이내로 확인되었다.
- 시료의 지방 및 단백질 성분의 제거를 위해 n-hexane처리 후 TCA 또는 TFA를 처리한 결과 시료뿐만 아니라 PGA를 spike한 시료에서도 PGA 피크가 검출되지 않았다. 또한 처리 전보다 저분자 물질이 검출되는 시간대의 피크가 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
- 식품에 함유된 지방 및 단백질 성분의 제거가 PGA 피크의 분리능에 영향을 주는지 확인하고자 시료에 n-hexane, trichloroacetic acid (TCA) 및 trifluoroacetic acid (TFA) 처리를 하여 GF-7M HQ column에 물을 이동상으로 하여 ELSD로 분석하였다(data not shown). 시료의 지방제거를 위해 n-hexane 처리 후 분석해 본 결과 시료 및 시료에 PGA를 spike한 경우 모두 n-hexane 처리에 따른 피크의 변화가 나타나지 않았다. 따라서 시료에 있는 PGA와 유사한 시간에 나타나는 피크의 경우 지방성분이 아닌 것으로 판단되며, 분석을 위한 전처리로 적합하지 않는 것으로 생각되었다.
- 식품 중 PGA 분석을 위해 확립된 전처리 방법과 HPLC 분석방법에 대하여 시료 blank와 PGA 첨가시료에 대하여 비교해본 결과 시료 blank에서 PGA와 유사한 시간의 피크가 검출되지 않았으며, PGA 첨가에 따라 시료 blank의 영향 없이 PGA 피크가 검출되는 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 식품 중 알긴산프로필렌글리콜이 검출된 시료는 40품목이었으며, 식품유형별로 분류하면 절임식품 1품목(검체수 10품목), 과자류 5품목(검체수 15품목), 드레싱류 2품목(검체수 15품목), 과·채가공품 3품목(검체수 14품목), 치즈 8품목(검체수15품목), 토마토케찹 7품목(검체수 10품목), 면류 14품목(검체수 30품목)으로 확인되었다.
- PGA 분석을 위한 HPLC 조건 중 이동상 유속을 비교하기 위하여 위에서 선정된 GF-7M HQ column에 대하여 ELSD로 분석하여 비교하였다(data not shown). 이동상의 유속을 0.6 mL/min과 0.8 mL/min에 대하여 비교한 결과, 0.6 mL/min보다 0.8 mL/min의 조건에서 피크모양이 더 적합한 것을 확인하였다. 따라서 PGA 분석하기 위한 HPLC 방법은 GF-7M HQ (9 μm, 7.
- 또한 처리 전보다 저분자 물질이 검출되는 시간대의 피크가 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 TCA나 TFA 처리에 의해 시료의 고분자 물질이 분해되는 것을 알 수 있었으며, PGA 역시 TCA나 TFA 처리에 의해 영향이 있음을 확인하였다. 또한 이들 처리는 시료 전처리 방법으로 적합하지 않은 것으로 확인하였다.
- 8%의 회수율을 나타내어 일내와 일간 분석에서 우수한 결과를 나타내었다. 정밀도를 분석한 결과 intra-day의 경우 4.1~13.5%의 CV를 나타내었으며, inter-day의 경우 4.5~10.7%의 CV를 나타내었다. Gomez-Ordonez 등15)은 alginate의 회수율 및 정밀도는 각각 101.
- PGA는 60oC까지는 비교적 안정하나 끓이면 급격히 점도가 저하되는 성질이 있어, 추출 온도를 20, 40, 60oC에서 진행하였으며, 150 rpm에서 3시간 동안 incubation 추출하여 원심분리한 후 HPLC 분석을 하였다. 추출온도에 따른 실험 결과 20oC에서 3시간 추출한 경우 PGA 피크와 시료의 분리도가 40 및 60oC에서 추출한 경우 보다 좋게 나타났으며, 추출온도가 높을수록 분리도가 나빠지는 것을 확인하였다. 이는 시료내의 성분들이 추출 온도에 따라 영향을 나타내는 것으로 추측된다.
- 알긴산프로필렌글리콜은 물에서 완전히 용해되었으며, 유기용매에서 농도에 관계없이 용해되지 않고 침전되었다. 확인한 3 가지 buffer 용액 중 인산나트륨 buffer에서 농도에 상관없이 알긴산프로필렌글리콜이 용해되는 것을 확인하였으며,질산나트륨 buffer의 경우 농도에 상관없이 알긴산프로필렌글리콜이 투명한 콜로이드 형태로 용해되어 적합하지 않았으며, 황산나트륨 buffer의 경우 0.1 M 이상의 농도에서 용해되었다. 따라서 알긴산프로필렌글리콜 용해 용매로써 물 또는 인산나트륨 buffer가 적합할 것으로 판단하였다.
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