낙동강에서 분리된 Aphanizomenon flos-aquae (Cyanophyceae) 균주의 목표 유전자를 이용한 잠재적 독소 생성능 및 계통학적 분석 Analysis of Potential Toxigenicity and Phylogeny using Target Genes in Aphanizomenon flos-aquae (Cyanophyceae) strains isolated from the Nakdong River원문보기
독소 생성 분류군의 정의는 분리균주에 의해서 동정되고, 단일배양에 의한 독소 생성 여부 및 유전적 검토가 확인된 분류군을 의미한다. 이러한 관점에서 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성능은 세계적으로 아직 논쟁의 여지가 있다. 본 연구는 낙동강에서 분리한 Aphanizomenon flos-aquae (DGUC001, DGUC003)을 대상으로 16S rRNA 염기서열을 이용하여 계통학적 위치를 확인하고, 남세균독소인 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN)의 잠재적 생성능력을 유전자 수준에서 검토하였다. 연구에 사용된 균주는 2016년 8월과 2016년 10월에 낙동강 본류구간의 하천수에서 분리되었다. 계통학적 분석에는 16S rRNA가 사용되었으며, 독소 생성 유전자는 CYN과 STX 생합성에 관여하는 cyrA, cyrJ, sxtA, sxtI 유전자가 선택되었다. 분리된 균주 DGUC001과 DGUC003은 육안으로 관찰 가능한 크기의 다발(fascicles)을 형성하였으며, 세포사(trichome)가 병렬 형태로 나열되고, 세포사의 양쪽 끝에 위치한 말단 세포(terminal cell)가 거의 투명하거나 긴 끈 형태의 세포질을 가지고 있었다. 또한, 두 개의 균주는 98.4%의 유전적 유사도를 나타내어 동일종으로 판단되었고, 유전자 은행에서 선별한 Cluster I의 Aph. flos-aquae strains과도 계통수에서 66~82%의 bootstrap value의 지지도로 단일 cluster에 포함되었다. 확보된 두 개 균주의 유전자 정보는 유전자은행 NCBI에 등록되었으며, KY327795, KY327796의 Accession no.를 부여받았다. 한편, 세포독소 CYN의 생합성에 관여하는 유전자 cyrA와 cyrJ는 두 개 균주 모두에서 확인되지 않았다. STX의 생합성을 담당하는 유전자 중 sxtA 유전자는 두 개의 균주에서 확보되었으며, 독소생합성 과정의 분자생물학적 지표 역할을 하는 sxtI 유전자는 발견되지 않았다. 따라서 낙동강 현장시료에서 분리된 두 개의 균주는 형태학적 및 계통분류학적으로 동일종인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었으며, 두 개의 균주는 CYN과 STX의 잠재적인 독소 비생성 균주로 확인되었다. 이 결과를 통하여 Aph. flos-aquae가 독소 생성 분류군으로 분류되는 것에 대한 보다 면밀한 검토가 필요할 것으로 판단되었다.
독소 생성 분류군의 정의는 분리균주에 의해서 동정되고, 단일배양에 의한 독소 생성 여부 및 유전적 검토가 확인된 분류군을 의미한다. 이러한 관점에서 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성능은 세계적으로 아직 논쟁의 여지가 있다. 본 연구는 낙동강에서 분리한 Aphanizomenon flos-aquae (DGUC001, DGUC003)을 대상으로 16S rRNA 염기서열을 이용하여 계통학적 위치를 확인하고, 남세균독소인 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN)의 잠재적 생성능력을 유전자 수준에서 검토하였다. 연구에 사용된 균주는 2016년 8월과 2016년 10월에 낙동강 본류구간의 하천수에서 분리되었다. 계통학적 분석에는 16S rRNA가 사용되었으며, 독소 생성 유전자는 CYN과 STX 생합성에 관여하는 cyrA, cyrJ, sxtA, sxtI 유전자가 선택되었다. 분리된 균주 DGUC001과 DGUC003은 육안으로 관찰 가능한 크기의 다발(fascicles)을 형성하였으며, 세포사(trichome)가 병렬 형태로 나열되고, 세포사의 양쪽 끝에 위치한 말단 세포(terminal cell)가 거의 투명하거나 긴 끈 형태의 세포질을 가지고 있었다. 또한, 두 개의 균주는 98.4%의 유전적 유사도를 나타내어 동일종으로 판단되었고, 유전자 은행에서 선별한 Cluster I의 Aph. flos-aquae strains과도 계통수에서 66~82%의 bootstrap value의 지지도로 단일 cluster에 포함되었다. 확보된 두 개 균주의 유전자 정보는 유전자은행 NCBI에 등록되었으며, KY327795, KY327796의 Accession no.를 부여받았다. 한편, 세포독소 CYN의 생합성에 관여하는 유전자 cyrA와 cyrJ는 두 개 균주 모두에서 확인되지 않았다. STX의 생합성을 담당하는 유전자 중 sxtA 유전자는 두 개의 균주에서 확보되었으며, 독소생합성 과정의 분자생물학적 지표 역할을 하는 sxtI 유전자는 발견되지 않았다. 따라서 낙동강 현장시료에서 분리된 두 개의 균주는 형태학적 및 계통분류학적으로 동일종인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었으며, 두 개의 균주는 CYN과 STX의 잠재적인 독소 비생성 균주로 확인되었다. 이 결과를 통하여 Aph. flos-aquae가 독소 생성 분류군으로 분류되는 것에 대한 보다 면밀한 검토가 필요할 것으로 판단되었다.
The identity of toxin producers remains only hypothesis unless there were identified by strain isolation and analytical confirmation of both the cyanotoxin production and the genetic identity of the monoculture. The purposes of this study were to identify a morphologic and phylogenetic classificatio...
The identity of toxin producers remains only hypothesis unless there were identified by strain isolation and analytical confirmation of both the cyanotoxin production and the genetic identity of the monoculture. The purposes of this study were to identify a morphologic and phylogenetic classification in Aphanizomenon flos-aquae strains isolated from the Nakdong River and to investigate the potential ability of the strains to produce toxins such as saxitoxin and cylindrospermopsin using target genes. The 16S rRNA and sxtA, sxtI, cyrA, cyrJ genes were analyzed on two strains (DGUC001, DGUC003) isolated from the Nakdong River. Morphological features of the strains were observed a shape of aggregated trichomes in parallel fascicles which can reach up to macroscopic size and a hyaline terminal cell without aerotope. In addition, the 16S rRNA phylogenetic analyses showed that the strains were identified as the same species with high genetic similarity of 98.4% and grouped within a monospecific andsupported cluster I of Aphanizomenon flos-aquae selected from GenBank of the NCBI. The cyrA and cyrJ genes encoding for the cylindrospermopsin-biosynthesis were not detected in the present study. The sxtA gene was in detected both the two strains, whereas the sxtI gene which had been suggested as a suitable molecular marker to detect saxitoxin-producing cyanobacteria was not found both the strains. Thus, the two strains isolated from Nakdong River were identified as the same species of Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888, the two strains were confirmed as potential non-producing strains of the saxitoxin and cylindrospermopsin.
The identity of toxin producers remains only hypothesis unless there were identified by strain isolation and analytical confirmation of both the cyanotoxin production and the genetic identity of the monoculture. The purposes of this study were to identify a morphologic and phylogenetic classification in Aphanizomenon flos-aquae strains isolated from the Nakdong River and to investigate the potential ability of the strains to produce toxins such as saxitoxin and cylindrospermopsin using target genes. The 16S rRNA and sxtA, sxtI, cyrA, cyrJ genes were analyzed on two strains (DGUC001, DGUC003) isolated from the Nakdong River. Morphological features of the strains were observed a shape of aggregated trichomes in parallel fascicles which can reach up to macroscopic size and a hyaline terminal cell without aerotope. In addition, the 16S rRNA phylogenetic analyses showed that the strains were identified as the same species with high genetic similarity of 98.4% and grouped within a monospecific andsupported cluster I of Aphanizomenon flos-aquae selected from GenBank of the NCBI. The cyrA and cyrJ genes encoding for the cylindrospermopsin-biosynthesis were not detected in the present study. The sxtA gene was in detected both the two strains, whereas the sxtI gene which had been suggested as a suitable molecular marker to detect saxitoxin-producing cyanobacteria was not found both the strains. Thus, the two strains isolated from Nakdong River were identified as the same species of Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888, the two strains were confirmed as potential non-producing strains of the saxitoxin and cylindrospermopsin.
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문제 정의
수자원 관리 측면에서 Aphanizomenon속에 속하는 분류군의 정확한 동정과 독소 생성능을 파악하는 것은 향후 이 분류군에 의한 수화현상 및 출현빈도의 증가 가능성을 고려할 때 필수적이라 할 수 있다 (Yamamoto and Nakahara, 2009). 따라서 본 연구의 목적은 낙동강의 보구간을 중심으로 그 출현빈도와 횟수가 급증하고 있는 Aphanizomenon flos-aquae를 대상으로 (Yu et al., 2014; Park et al., 2015; Ryu et al., 2016), 16S rRNA 염기서열을 이용하여 계통학적 위치를 확인하고, 남세균 독소인 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN)의 잠재적 생성능력을 유전자 수준에서 검토하고자 하였다.
이러한 관점에서 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성능은 세계적으로 아직 논쟁의 여지가 있다. 본 연구는 낙동강에서 분리한 Aphanizomenon flos-aquae (DGUC001, DGUC003)을 대상으로 16S rRNA 염기서열을 이용하여 계통학적 위치를 확인하고, 남세균 독소인 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN)의 잠재적 생성능력을 유전자 수준에서 검토하였다. 연구에 사용된 균주는 2016년 8월과 2016년 10월에 낙동강 본류구간의 하천수에서 분리되었다.
제안 방법
16S rRNA는 primer PA(Edwards et al., 1989)와 B23S (Lepère et al., 2000)을 이용하여 증폭하였으며(Table 1), PCR 조건은 초기 변성단계인 94℃에서 5분간 1회 처리한 후 DNA 변성단계인 94℃에서 30초, primer 풀림단계인 50℃에서 30초, strand 신장 단계인 70℃에서 1분간 진행하여 총 30회 반복하였으며, 최종 신장 단계는 72℃에서 3분간 처리하였다.
PCR 반응 용액의 조성은 1.0 μL의 DNA template, 3 μL의 10X TaKaRa Ex Taq buffer, 2.4 μL의 dNTP(10mM), 0.5 μL의 primer (10 pmol), 0.2 μL의 TaKaRa Ex Taq polymerase(5 Unit μL-1, TaKaRa, Ohtsu, Japan)로 구성하였으며, 전체 용량이 30μL가 되도록 하였다.
(2008)을 각각 참고하여 설계하였다 (Table 1). PCR 증폭 조건은 sxtA가 94℃에서 4분간 처리한 후, 94℃ 10초, 55℃ 20초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 1분간 처리하였고, sxtI가 94℃에서 4분간 처리한 후, 94℃ 10초, 55℃ 20초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 3분간 처리하였으며, cyrA는 95℃에서 5분간 처리한 후, 95℃ 30초, 62℃ 1분, 72℃ 1분을 40회 반복한 뒤, 72℃에서 7분간 처리하였다. cyrJ 유전자의 증폭조건은 94℃에서 3분간 처리한 후, 94℃ 10초, 57℃ 20초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 7분간 처리하였다.
PCR 증폭 조건은 sxtA가 94℃에서 4분간 처리한 후, 94℃ 10초, 55℃ 20초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 1분간 처리하였고, sxtI가 94℃에서 4분간 처리한 후, 94℃ 10초, 55℃ 20초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 3분간 처리하였으며, cyrA는 95℃에서 5분간 처리한 후, 95℃ 30초, 62℃ 1분, 72℃ 1분을 40회 반복한 뒤, 72℃에서 7분간 처리하였다. cyrJ 유전자의 증폭조건은 94℃에서 3분간 처리한 후, 94℃ 10초, 57℃ 20초, 72℃ 1분을 30회 반복한 뒤, 72℃에서 7분간 처리하였다.
, 2011)를 이용하여 Maximum likelihood(ML)와 Maximum parsimony (MP), Neighbor-joining (NJ)방법으로 계통수를 작성하였고, 염기치환 모델은 TamuraNei와 Subtree-prunning-regrafting (SPR) algorithm, Maximum composite Likelihood이 각각 사용되었다. 각 분계도의 지지 정도를 알아보기 위해 1,000회 반복하여 bootstrap을 산출하였다. Outgroup로는 Chroococcales에 속하는 Microcystis aeruginosa (Accession no.
계통학적 분석을 위하여 forward와 reverse 방향의 각 염기서열들은 Vector NTI Advance 11 (Invitrogen Corp., USA)로 조합하였다. 분류학적 위치를 확인하기 위하여, 유전자은행 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 1,000 bp 이상의 염기서열이 등록된 분류군을 선별하였다.
분리된 균주는 150 ml 배지가 담긴 250 ml Erlenmeyer flask에 담아 진탕배양기(Hanbaek, HB-201SLI)에서 다음 조건으로 배양되었다; 21℃의 온도, 80 μmol s-1 m-1의 백열등 광조건(L : D=12 h : 12 h). 배양된 균주는 광학현미경(Nikon ECLIPSE 80i)을 이용하여 정확한 동정을 실시하고 사진촬영 하였으며, 촬영된 사진은 이미지 분석 프로그램(NIS-Elements F 3.0 software)을 통해 세포의 길이와 크기를 분석하였다. 종의 형태적 분류는 Komárek and Komáková (2006)와 Komárek (2013)을 참고하였다.
본 연구에서는 독소 생성능을 파악할 수 있는 목표유전자를 sxtA, sxtI, cyrA, cyrJ 등 총 4개를 선별하였으며, 목표유전자 증폭을 위한 primer의 경우 sxtA 유전자는 Ballot et al. (2010b)을, sxtI 유전자는 Casero et al. (2014), cyrA 유전자는 Stüken & Jakobsen (2010), cyrJ 유전자는 Mihali et al. (2008)을 각각 참고하여 설계하였다 (Table 1).
, USA)로 조합하였다. 분류학적 위치를 확인하기 위하여, 유전자은행 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 1,000 bp 이상의 염기서열이 등록된 분류군을 선별하였다. 정렬된 염기서열은 MEGA 5.
증폭된 16S rRNA의 PCR 산물은 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR product는 PA, CYA359F (Nubel et al., 1997), pFr (Edwards et al., 1989), 16S1494R (Wilmotte et al.,2002)의 primer를 이용하여 sequencing reaction을 수행하였으며, 염기서열 결정을 위해서 Macrogen (Seoul, Korea)에 분석을 의뢰하였다.
현장시료로부터 Aphanizomenon 균주를 분리하기 위해, 도립 현미경(Leica DMi1, ×400) 하에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 멸균된 CB 배지(Shirai et al., 1989)가 담긴 well cell culture plate로 옮겨졌으며, 이 과정은 Aphanizomenon의 single trichome이 분리될 때까지 반복하여 수행하였다.
대상 데이터
DGUC001과 DGUC003는 육안으로 관찰 가능한 크기의 다발 (fascicles)을 형성하였으며, 세포사 (trichome)가 병렬 형태로 나열되어 최대 길이가 1.5 cm까지 관찰되었다(Fig. 2a). 단일 세포사(trichome)는 직선이거나 약간 휘어진 형태이며, 아대칭 (subsymmetric) 구조를 가지고 있었다.
배양된 균주는 대수증식기 (exponential growth phase)까지 유지되었으며, 원심분리하여 배양액과 균주를 분리하여 실험에 사용하였다 (14,000 ×g, 1 min). DNA는 LaboPassTM Tissue Mini (Cosmogenetech, Korea)를 사용하여 추출하였다.
각 분계도의 지지 정도를 알아보기 위해 1,000회 반복하여 bootstrap을 산출하였다. Outgroup로는 Chroococcales에 속하는 Microcystis aeruginosa (Accession no.: AB035549)가 사용되었다.
Cylindrospermopsin 암호화 cyr 유전자 cluster는 Aphanizomenon sp. 균주 10E6에서 분석되었으며, 총 11개의 cyr 유전자의 약 39.7 kb로 구성되어있다. cyr 유전자 cluster는 3구역에 배치되어 있는데, 첫 번째 구역은 aminidinotransferase, nonribosomal peptide/polyketide synthase, polyketide synthase를 각각 암호화하는 cyrA, cyrB, cyrE를 포함하며, 정방향으로 전사된다.
본 연구는 낙동강에서 분리한 Aphanizomenon flos-aquae (DGUC001, DGUC003)을 대상으로 16S rRNA 염기서열을 이용하여 계통학적 위치를 확인하고, 남세균 독소인 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN)의 잠재적 생성능력을 유전자 수준에서 검토하였다. 연구에 사용된 균주는 2016년 8월과 2016년 10월에 낙동강 본류구간의 하천수에서 분리되었다. 계통학적 분석에는 16S rRNA가 사용되었으며, 독소 생성 유전자는 CYN과 STX 생합성에 관여하는 cyrA, cyrJ, sxtA, sxtI 유전자가 선택되었다.
79ʺ)에서 표층수를 채수하여 이용하였으며, 채수된 시료는 균주의 분리를 위하여 실험실로 운반되었다. 현장시료 이외에 국립낙동강생물자원관 생물자원은행에서 보관 중인 Aphanizomenon flos-aquae 2개 균주(FBCC010006, FBCC010007)를 제공받았다.
현장시료는 Aphanizomenon속이 우점하여 출현한 2016년 8월 낙동강 중하류 수역의 적포교 지점 (N 35°31′40. 88ʺ, E 128°21ʹ36.16ʺ)과 2016년 10월 삼랑진교 지점 (N35°22ʹ55.61ʺ, E 128°49ʹ7.79ʺ)에서 표층수를 채수하여 이용하였으며, 채수된 시료는 균주의 분리를 위하여 실험실로 운반되었다.
이론/모형
분류학적 위치를 확인하기 위하여, 유전자은행 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 1,000 bp 이상의 염기서열이 등록된 분류군을 선별하였다. 정렬된 염기서열은 MEGA 5.2 (Tamura et al., 2011)를 이용하여 Maximum likelihood(ML)와 Maximum parsimony (MP), Neighbor-joining (NJ)방법으로 계통수를 작성하였고, 염기치환 모델은 TamuraNei와 Subtree-prunning-regrafting (SPR) algorithm, Maximum composite Likelihood이 각각 사용되었다. 각 분계도의 지지 정도를 알아보기 위해 1,000회 반복하여 bootstrap을 산출하였다.
종의 형태적 분류는 Komárek and Komáková (2006)와 Komárek (2013)을 참고하였다.
성능/효과
16S rRNA를 이용한 유전자계통분석을 통해 Aphanizo-menon속의 분류군은 크게 5개의 cluster로 구분되었으며, 이 중 cluster 1~3의 구분은 비교적 낮은 bootstrap value에 의해 지지되었다. cluster I과 III에는 형태학 및 계통학적으로 검증된 Aphanizomenon flos-aquae와 Aphanizomenon gracile이 해당되었으나 (Cirés et al.
한편, 낙동강생물자원관 생물자원은행에서 제공받은 Aphanizomenon flos-aquae (FBCC010006, FBCC010007) 균주의 16S rRNA를 정렬하여 분석한 결과, 전체 구간의 길이는 각각 1,500와 1,562 bp로 획득되었으며, 두 개의 균주는 89%의 유전적 유사도를 나타내었다. FBCC010006은 유전자은행의 BLAST 분석을 통해 Cylindrospermum속의 분류군과 95~97%의 상동성을 보였고, 계통분석에서도 90~93%의 bootstrap value로 Cylindrospermum cluster로의 분지가 지지되었다. FBCC010007은 Geitlerinema속의 분류군과 97~98%의 상동성을 보였고, 계통분석에서도 99~100%의 bootstrap value로 지지되었다(Fig.
FBCC010006은 유전자은행의 BLAST 분석을 통해 Cylindrospermum속의 분류군과 95~97%의 상동성을 보였고, 계통분석에서도 90~93%의 bootstrap value로 Cylindrospermum cluster로의 분지가 지지되었다. FBCC010007은 Geitlerinema속의 분류군과 97~98%의 상동성을 보였고, 계통분석에서도 99~100%의 bootstrap value로 지지되었다(Fig. 3).
한편, 세포독소 CYN의 생합성에 관여하는 유전자 cyrA와 cyrJ는 두 개 균주 모두에서 확인되지 않았다. STX의 생합성을 담당하는 유전자 중 sxtA 유전자는 두 개의 균주에서 확보되었으며, 독소 생합성 과정의 분자생물학적 지표 역할을 하는 sxtI 유전자는 발견되지 않았다. 따라서 낙동강 현장시료에서 분리된 두 개의 균주는 형태학적 및 계통분류학적으로 동일종인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었으며, 두 개의 균주는 CYN과 STX의 잠재적인 독소 비생성 균주로 확인되었다.
낙동강 현장시료에서 분리된 균주의 16S rRNA를 정렬하여 분석한 결과, 전체 구간의 길이는 DGUC001과 DGUC003이 각각 1,569와 1,541 bp로 획득되었으며,획득된 염기서열은 최종1,303 bp로 정렬되었다. 염기 조성의 평균은A가 26.
낙동강 현장시료에서 분리된 두 개의 균주는 98.4%의 유전적 유사도를 나타내어 계통분류학적으로 동일종으로 판단하였고, 유전자은행에서 선별한 Custer I의 Aphanizo-menon flos-aquae에 대하여 98~99%의 유전적 유사도를 나타내었다. 16S rRNA를 이용한 종 분리의 유전적 유사도 임계값에 대한 최근 연구들에 따르면, 98% 수준을 기준으로 제시하고 있다(Kim et al.
, 2014). 따라서 낙동강 현장시료에서 분리된 두 개의 균주는 계통분류학적으로 동일종인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었다. 동정된 두 개 균주의 유전자 정보는 유전자은행 NCBI(National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록되었으며, KY327795, KY327796의 Accession no.
STX의 생합성을 담당하는 유전자 중 sxtA 유전자는 두 개의 균주에서 확보되었으며, 독소 생합성 과정의 분자생물학적 지표 역할을 하는 sxtI 유전자는 발견되지 않았다. 따라서 낙동강 현장시료에서 분리된 두 개의 균주는 형태학적 및 계통분류학적으로 동일종인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었으며, 두 개의 균주는 CYN과 STX의 잠재적인 독소 비생성 균주로 확인되었다. 이 결과를 통하여 Aph.
saxitoxin 생합성 과정에서 가장 먼저 발현되는 sxtA 유전자는 Aphanizomenon spp.에서 독소 생합성 유전자로 가장 광범위하게 조사되었으며, PSP 독소 생성 균주뿐만 아니라, 모든 비독성 분류군(Aphanizomenon gracile, Aphanizomenon flos-aquae, Cuspidothrix issatschenkoi, Chrysosporum ovalisporum, Sphaerospermopsis aphanizomenoides)의 균주에서도 발견되었다. 이러한 발견으로 인하여 saxitoxin 생성 균주를 확인하기 위한 분자생물학적 지표로서 sxtA 유전자는 사용될 수 없었으나(Ballot et al.
낙동강 현장시료에서 분리된 균주의 16S rRNA를 정렬하여 분석한 결과, 전체 구간의 길이는 DGUC001과 DGUC003이 각각 1,569와 1,541 bp로 획득되었으며,획득된 염기서열은 최종1,303 bp로 정렬되었다. 염기 조성의 평균은A가 26.2%, T가 18.5%, G가 30.9%, C가 22.5%였으며, DNA의 구조 및 물리적 특성을 결정하는 G+C의 함량은 전체적으로 약 53.4%로 산출되었다. Kimura’s two parameter model을 이용한 각 분류군 간 유전적 거리(Pairwise distance)는 Cluster I의 15개체 염기변이가 외군을 포함하여 0~0.
한편, 독소 생성여부를 결정하는 분자생물학적 지표로서 사용된 sxtI 유전자는 어떠한 조건에서도 증폭되지 않았다. 이를 통하여 낙동강에서 분리된 균주들은 cylindrospermopsin과 saxitoxin의 생합성 여부를 결정하는 목표유전자(target gene)인 sxtI, cyrJ를 가지고 있지 않은 것으로 확인되었다.
한편, saxitoxin 생합성에 관여하는 유전자 중 sxtA는 DGUC001와 DGUC003에서 각각 534 bp와 524 bp로 증폭되었으며, 522 bp로 정렬되었다(Table 4). 정렬된 목표유전자(target gene)의 염기서열을 NCBI 유전자은행에서 BLAST한 결과, Aphanizomenon flos-aquae (Accession no.: FN552399) 및 Aphanizomenon gracile (Accession no.: JN837670, FN552392)의 sxtA 유전자와 100%의 상동성을 보여 sxtA 유전자가 DGUC001과 DGUC003에서 증폭되었음을 최종적으로 확인하였다. 한편, 독소 생성여부를 결정하는 분자생물학적 지표로서 사용된 sxtI 유전자는 어떠한 조건에서도 증폭되지 않았다.
, 2010b). 최근 본 연구팀은 낙동강 수계에서 출현하는 Aphanizoenon flos-aquae 분리 균주의 독소 생성성을 ELISA 방법을 통해 확인하였으며, 그 결과 다양한 환경조건에서 성장된 조체와 배양액에서 saxitoxin과 cylindrospermopsin이 생성되지 않음을 확인하였다(미발표 자료). 따라서 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성능 및 독소 분류군으로의 분류는 보다 면밀하고 추가적인 검토가 필요할 것으로 판단되었다.
한편, 낙동강생물자원관 생물자원은행에서 제공받은 Aphanizomenon flos-aquae (FBCC010006, FBCC010007) 균주의 16S rRNA를 정렬하여 분석한 결과, 전체 구간의 길이는 각각 1,500와 1,562 bp로 획득되었으며, 두 개의 균주는 89%의 유전적 유사도를 나타내었다. FBCC010006은 유전자은행의 BLAST 분석을 통해 Cylindrospermum속의 분류군과 95~97%의 상동성을 보였고, 계통분석에서도 90~93%의 bootstrap value로 Cylindrospermum cluster로의 분지가 지지되었다.
현장시료에서 분리된 균주의 자원 번호(strain number)는 DGUC001과 DGUC003으로, 국립낙동강생물자원관 생물자원은행에서 제공한 균주의 자원 번호는 FBCC010006과 FBCC010007로 각각 구분되었다(Table 2).
후속연구
이 결과를 통하여 Aph. flos-aquae가 독소 생성 분류군으로 분류되는 것에 대한 보다 면밀한 검토가 필요할 것으로 판단되었다.
최근 본 연구팀은 낙동강 수계에서 출현하는 Aphanizoenon flos-aquae 분리 균주의 독소 생성성을 ELISA 방법을 통해 확인하였으며, 그 결과 다양한 환경조건에서 성장된 조체와 배양액에서 saxitoxin과 cylindrospermopsin이 생성되지 않음을 확인하였다(미발표 자료). 따라서 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성능 및 독소 분류군으로의 분류는 보다 면밀하고 추가적인 검토가 필요할 것으로 판단되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Aphanizomenon속의 특징은 무엇인가?
Aphanizomenon속은 전 세계적으로 담수생태계에서 널리 분포하며, 과다 증식하여 유해한 수화현상 (Harmful cyanobacterial bloom)을 빈번하게 발생시킨다(McDonald and Lehman, 2013). Aphanizomenon속에 의한 수화현상은 간독소(hepatotoxin)와 신경독소(anatoxin, aphantoxin, saxitoxin), 세포독소(cylindrospermopsin)와 같은 2차 대사산물을 유발하여 인간과 동물에게 심각한 질환을 일으키고, 일부 경우에는 사망에 이르게 할 수 있다(KokoCiński, 2013; Zhang et al.
Aphanizomenon속에 의한 수화현상이 일으키는 악영향은 무엇인가?
Aphanizomenon속은 전 세계적으로 담수생태계에서 널리 분포하며, 과다 증식하여 유해한 수화현상 (Harmful cyanobacterial bloom)을 빈번하게 발생시킨다(McDonald and Lehman, 2013). Aphanizomenon속에 의한 수화현상은 간독소(hepatotoxin)와 신경독소(anatoxin, aphantoxin, saxitoxin), 세포독소(cylindrospermopsin)와 같은 2차 대사산물을 유발하여 인간과 동물에게 심각한 질환을 일으키고, 일부 경우에는 사망에 이르게 할 수 있다(KokoCiński, 2013; Zhang et al., 2015).
cyr cluster을 구성하는 유전자 중 cyrJ의 특징은 무엇인가?
7 kb가 포함되어 있다(Stüken and Jakobsen, 2010). 이 중 cyrJ와 cyrA 유전자는 CYN의 생성능을 식별하는 유전자로 사용되어 왔으며, 특히 황산기전달효소(sultotransferase)를 암호화하는 cyrJ 유전자가 독소 생성능이 있는 균주를 발견하는 가장 적합한 지표로서, 최근 연구까지 CYN 독소 생성능이 있는 균주에서만 발견되어왔다(Mihali et al., 2008; Mazmouz et al.
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