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문제 정의
- 실제 낫또를 제조하는 과정에서 단백질 펩타이드와 아미노산의 변화에 대한 연구가 보고됨과 아울러 그 발효과정에서 생성되는 효소 중 혈전증을 예방이나 치료할 수 있는 낫또키나제(nattokinase)가 발견되기도 했으며, Ehrlich 암세포를 피하주사로 이식한 마우스 모델에 낫또를 주입하였을 때 마우스의 생육에는 해를 입히지 않으면서도 암종이 작아지거나 소멸한 것이 확인되기도 했다(8-10). 따라서 본연구에서는 한-중-일 3개국의 주요 단기 콩발효식품인 한국의 청국장, 중국의 물두시와 일본의 낫또의 이화학적 특성, 항돌연변이 효과와 항암 기능성을 비교 연구하였다.
- 본 연구에서는 콩에서 유래한 단기 발효식품인 청국장, 물두시, 낫또 제품 중 대표적인 제품을 각각 하나씩 선택하여 이들의 일반적 특성과 항돌연변이 효능 및 항암 효능을 비교 연구하였다. 청국장은 아미노태 질소 및 암모니아태 질소의 함량이 높았으나, 낫또는 그 함량이 낮게 나타났다.
제안 방법
- 45°C의 top agar 2 mL씩을 각 tube에 붓고 3초간 vortex 하여 minimal glucose agar plate에 도말하고 37°C에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 숫자를 계수하였다.
- 이렇게 배양된 암세포는 96-well plate에 well당 2×104 cells/mL가 되도록 180 μL씩 분주하고 청국장, 물두시와 낫또의 추출물을 일정농도로 제조하여 20 μL 첨가하여 37 °C, 5% CO2 배양기에서 72시간 배양하였다.
- 주 2~3회 refeeding 하고 6~7일 간격으로 계대배양을 거쳤는데, flask 상에 충만해진 세포를 PBS로 세척한후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리(314×g, 3 min)로 침전시킨 암세포에 배지를 넣고 파이펫으로 현탁액(suspension)을 만들어 75 mL cell culture flask에 10 mL씩 일정 수 분할하여 주입함으로써 계대배양을 진행하면서 실험에 사용하였다.
- 아미노태 질소 함량은 formol법으로 측정하였다. 즉 시료 2 g에 증류수 100 mL를 가하여 1시간 동안 상온에서 교반한후 중성 formalin(pH 8.4) 용액 20 mL를 가한 다음, pH 8.4가 될 때까지의 0.1 N-NaOH로 적정하여 적정 mL 수를 측정하여 아미노태 질소의 함량을 측정하였다(11).
- 청국장, 물두시, 낫또의 메탄올 추출물로 Ames test를 실시하여 간접돌연변이원인 ABF 1에 대한 항돌연변이 효과를 비교하였다(Table 2). 1.
- , Omitama, Ibaraki, Japan)를 사용하였다. 청국장, 물두시와 낫또를 달리하여 만든 시료를 동결건조 시킨 후 마쇄하여 시료에 20배(w)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복한 다음 여과하여 회전식 진공농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다.
- 45°C의 top agar 2 mL씩을 각 tube에 붓고 3초간 vortex 하여 minimal glucose agar plate에 도말하고 37°C에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 숫자를 계수하였다. 한편 실험에 사용된 시료와 돌연변이 유발물질의 농도는 예비실험(dose response 및 독성 실험)을 통하여 결정하였다. 돌연변이 억제효과의 정도(inhibition rate)는 아래 식에 의해 계산하였다.
대상 데이터
- 암세포(AGS 인체 위암 세포와 HT-29 인체 결장암 세포로서 모두 한국세포주은행으로부터 분양받음)는 100 units/ mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양 하였다.
- 청국장, 물두시, 낫또의 암세포 성장 억제 효과 정도를 비교해 보고자 AGS 인체 위암세포와 HT-29 인체 결장암 세포를 이용하였다(Table 3). AGS 위암 세포에 시료를 2 mg/mL의 농도로 처리한 결과 물두시와 청국장이 12%, 낫또가 2%의 저해율을 보였다(P<0.
- 청국장, 물두시와 낫또는 각각 국가의 대표적인 상품을 선택하여 연구하였다. 한국 청국장은 순창 문옥례 청국장 (문옥례식품, 전라북도 순창군)을 사용하였고, 중국 물두시는 Tanyutou 물두시(Sichuan Tanyutou Food and Alcohol Ltd.
- 청국장, 물두시와 낫또는 각각 국가의 대표적인 상품을 선택하여 연구하였다. 한국 청국장은 순창 문옥례 청국장 (문옥례식품, 전라북도 순창군)을 사용하였고, 중국 물두시는 Tanyutou 물두시(Sichuan Tanyutou Food and Alcohol Ltd., Chengdu, Sichuan, China)를, 낫또는 Okame 낫또 (Takano Foods Co., Ltd., Omitama, Ibaraki, Japan)를 사용하였다. 청국장, 물두시와 낫또를 달리하여 만든 시료를 동결건조 시킨 후 마쇄하여 시료에 20배(w)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복한 다음 여과하여 회전식 진공농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co.
데이터처리
- Means with the different letters (a-c) in the same column are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- Means with the different letters (a-d) in the same column are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 ANOVA 를 구한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 통계 분석하였다.
이론/모형
- 아미노태 질소 함량은 formol법으로 측정하였다. 즉 시료 2 g에 증류수 100 mL를 가하여 1시간 동안 상온에서 교반한후 중성 formalin(pH 8.
- 증류수를 가하여 청국장을 5배 희석, 진탕 추출 후 여과지로 여과한 여액을 AM505-K(Asan Pharmaceutical, Hwaseong, Korea)에 의한 Indophenol법으로 측정하였다(11).
- 청국장, 물두시와 낫또의 추출물들은 증류수(또는 dimethyl sulfoxide, DMSO)에 희석하여 Preincubation test 에 사용하였다(12). S9 mix 0.
성능/효과
- 1.25 mg/plate 농도에서는 청국장과 물두시는 각각 47%와 38%로 효과가 높게 나타났으며, 낫또는 27%로 가장 낮은 항돌연변이 효과를 보였다.
- 05). 4 mg/mL 하에서는 물두시가 77%, 청국장이 75%의 높은 저해율을 보였지만, 낫또는 11%의 저해율을 보였다. HT-29 인체 결장암세포에 처리한 결과 AGS 인체 위암세포를 이용하여 실험한 결과와 비슷한 경향을 보였다.
- 05). 높은 농도(2.5 mg/plate)에서도 낮은 농도에서와 비슷한 양상의 결과를 볼 수 있었으며 청국장과 물두시가 66%와 63%의 항돌연변이 효과를 보였고, 낫또가 60%의 항돌연변이 효과를 보였다. 따라서 3가지 대두발효식품 중에서 청국장의 돌연변이 유발 저해 효과가 가장 높았으며(P<0.
- 높은 농도(2.5 mg/plate)에서 모든 시료는 50% 이상의 높은 항돌연변이 효과를 나타냈으며, 특히 청국장(64%)의 돌연변이 유발 억제효과가 가장 크게 나타내었으며 물두시의 경우 61%, 낫또의 경우 55%로 나타나 시료 간에 유의적인 차이를 보였다(P<0.05).
- 따라서 3가지 대두발효식품 중에서 청국장의 돌연변이 유발 저해 효과가 가장 높았으며(P<0.05), 물두시의 항돌연변이 효과도 높다는 것을 알 수 있었다.
- 05). 따라서 세 가지 시료의 암세포 성장 억제 효과를 비교해본 결과 청국장, 물두시, 낫또의 순으로 항암효과가 있는 것으로 나타났다. MTT assay는 식품의 in vitro 항암 효과를 측정하는 실험에서 많이 사용되어 온 방법으로 위암과 결장암 세포를 포함한 주요 암세포에서 이를 이용함으로써 식품의 암세포 억제 효과를 측정할 수 있다(23).
- 시료를 2 mg/mL의 농도로 처리한 결과 청국장이 15%로 가장 높은 저해율을 보였고, 물두시가 5%, 낫또가 3%의 저해율을 보였다(P<0.05).
- Ames test 및 HT-29 인체 대장암세포를 이용한 실험에서는 청국장이 우월한 항돌연변이 및 항암 효능을 나타냈다. 이상의 결과로 볼 때 청국장은 전반적으로 기능성이 우수한 것으로 나타났으며, 물두시는 낫또에 비해 기능성이 더 나은 것으로 나타났다. 이는 발효 기간의 차이, 제조방식, 원재료의 품질 등에 의한 것으로 여겨지며, 향후 각국의 식문화및 조리 방식 등의 차이에 기초를 둔 추가적인 연구가 필요할 것으로 여겨진다.
- 직접 돌연변이원인 MNNG를 이용하여 Ames test를 한 결과, 1.25 mg/plate 농도에서 모든 시료는 돌연변이 억제율이 50% 전후로 높은 효과를 나타내었으며 청국장과 물두시는 57%과 50%, 낫또는 46%의 항돌연변이 효과를 나타내었다(P<0.05).
- 본 연구에서는 콩에서 유래한 단기 발효식품인 청국장, 물두시, 낫또 제품 중 대표적인 제품을 각각 하나씩 선택하여 이들의 일반적 특성과 항돌연변이 효능 및 항암 효능을 비교 연구하였다. 청국장은 아미노태 질소 및 암모니아태 질소의 함량이 높았으나, 낫또는 그 함량이 낮게 나타났다. 물두시의 경우 여타 발효식품에 비해 pH가 낮고 산도가 높았다.
- 63%로 비슷한 양상을 보였다. 특히 물두시는 pH 6.29로 다른 시료에 비해 낮았으며, 산도도 1.63%로 나타나 다른 시료보다 높았다. 아미노태 질소, 암모니아태 질소 함량의 경우 청국장이 각각 1,905.
후속연구
- 이상의 결과로 볼 때 청국장은 전반적으로 기능성이 우수한 것으로 나타났으며, 물두시는 낫또에 비해 기능성이 더 나은 것으로 나타났다. 이는 발효 기간의 차이, 제조방식, 원재료의 품질 등에 의한 것으로 여겨지며, 향후 각국의 식문화및 조리 방식 등의 차이에 기초를 둔 추가적인 연구가 필요할 것으로 여겨진다.
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