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문제 정의
- , 2000). 본 연구에서는 수직 감염원 차단을 통한 안정적인 능성어 종묘생산을 위해, RGNNV 감염이력 확인을 통한 무감염 상태의 건전한 능성어 친어를 확보를 목적으로, 2012부터 2014년에 걸쳐 남해안 일대의 능성어 친어를 대상으로, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)법 및 NNV검출 nested polymerase chain reaction (PCR)법 등을 적용하여 NNV 무감염 능성어 친어를 선별하고, NNV 무감염 능성어 치어생산을 시도하였다.
- 본 실험에서는 능성어 친어를 대상으로 과거의 NNV감염이력과 현재의 NNV 보균유무를 확인하기 위하여 ELISA를 실시하였고, 이를 통해 NNV에 대한 특이적인 항체 값을 측정하였다. 본 실험의 결과 2012년 166마리 중 45마리, 2014년 31마리 중 14마리의 능성어 친어에서 NNV항체가 기준치 이상으로 검출되었다.
제안 방법
- 능성어 친어에서 채집한 난을 hanks’ balanced salt solution(HBSS, Gibco, USA)으로 1:9로 희석하여 마쇄하고, 그 마쇄액을 0.45 µm syringe filter (Pall corporation, USA)로 여과하여 시료를 제작하였으며, 해당시료는 SSN-1 주화세포에 접종하여 25℃에 배양하면서 CPE를 관찰하였다.
- T-PBS로 5번 수세하였고 ELISA 발색액(100 mM Na2HPO4,50 mM citric acid, 1 mg/ 1 mL o-phenylenediamine, 0.03% H2O2)을 각 well에 50 μL씩 분주한 후 25℃에서 30분 동안 발색하였다.
- 1차 항체는 능성어 혈청을 5% skim milk로 희석(40배)하여 1시간 반응시킨 후, 시료당 2배수의 well에 50 μL씩 분주하였고, 2차 항체는 5% skim milk로 500배 희석된 토끼 항 능성어 IgM 혈청을 50 μL씩 분주하였으며, 3차 항체는 5% skim milk로 1000배 희석된 peroxidase conjugated goat anti rabbit immunoglobulin antibody (DakoCytomation, Denmark)을 50 μL씩 분주하였다.
- 세포 배양액은 10% (V/V) fetal bovine serum (FBS), 100 IU/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycin을 첨가한 Leibovitz`sL-15 medium을 사용하였고 배양된 세포는 25℃ 배양기에서 배양하였다. 25 cm2 세포배양 플라스크(Corning, USA)에 배양된 SSN-1 cell에 NNV Yeosu08을 접종한 후, 25 ℃에 배양하면서 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. 바이러스는 7일간 배양한 후, 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 세포 잔유물을 제거하고 1.
- 난과 정자로부터 Total RNA를 추출하기 위해서 miRNeasy MiNi Kit (Qiagen, USA)를 사용하였고, 제조사의 매뉴얼에 따라 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 즉시 사용하거나, -80℃에 보관하였다.
- , 1994). PCR조건은 pre-incubation 72℃ 10분, pre-denaturation 95℃ 2분, denaturation 95℃ 40초, annealing 50℃ 40초, extension 72℃ 40초 반응을 30 cycle을 기준으로 실시하고 post-extension 72℃ 10분으로 PCR을 종료하였다. Nested RT-PCR에 사용한 primer는 forward primer로 NF2 (5`-GTTCCC TGT ACA ACG ATT CC-3`)와 reverse primer로 NR3(5`-GGA TTT GAC GGG GCT GCT CA-3`)를 이용하였다(Thiery et al.
- PCR 조건은 pre-denaturation 94℃ 2분,denaturation 94℃ 40초, annealing 50℃ 40초, extension 72℃ 40초 반응을 25 cycle실시하고 post-extension 72℃ 10분으로 과정을 종료하였다. PCR 산물 5 uL를 1% agarose gel, 100Volt 조건에서 25분간 전기영동하여 UV transilluminator (BioRad, USA)상에서 밴드를 확인하였다.
- 능성어 친어 어체내의 NNV 보균유무를 확인하기 위해, 산란기에 앞서 능성어 친어의 난을 채집하여 시료를 제작하였으며, 해당시료는 SSN-1 주화세포에 접종하여 25℃에 배양하면서 세포변성 효과(CPE)를 관찰하여 바이러스 분리를 시도하였다. 2012년 2마리의 친어에서 취한 난을 이용한 세포접종을 통한 바이러스 분리실험을 실시한 결과 1마리의 난시료에서 NNV의 특징적인 공포를 형성하는 세포변성 효과를 확인하였고(Fig.
- 능성어 친어 어체내의 NNV 보균유무를 확인하기 위해, 산란기에 앞서 능성어 친어의 난과 정자시료를 채집하여, nested RT-PCR법 적용한 NNV 검출을 실시하였다(Table 1). 2013년 3마리의 친어에서 채집한 난과, 14년 31마리(암컷 22마리, 수컷 9마리)의 친어에서 채집한 난과 정자를 대상으로 실시한 RTPCR 결과, 2013년 2개의 난 시료와 2014년 2개의 정자 시료에서 양성의 결과를 확인할 수 있었다.
- 능성어 친어의 NNV 감염이력과 Anti-NNV 특이항체 보유유무를 확인하기 위해, 2012-2014년 동안 산란기에 앞서 능성어친어의 혈액을 이용하여 ELISA실험을 실시하였다(Table 1). 2012년 총 166마리의 능성어 친어를 대상으로 ELISA를 실시한 결과 흡광도(optical density, O.
- 수컷 2마리와 암컷 6마리에서 총 4,500 mL의 수정난을 취하였고, 침전난을 제거한 2,700 mL의 부상난 중1,000 mL에서 약 1,000,000마리의 치어를 부화시켰다. 종묘생산에 앞서 종묘생산장의 사육수조와 기구의 소독이 이루어졌으며, 오염된 사육수를 통한 NNV감염을 차단하기 위하여 UV멸균 해수를 사용하였다. 아울러 초기 먹이생물로 공급되는 로티퍼와 알테미아 유생의 NNV 오염유무를 먹이공급에 앞서 RT-PCR을 실시하여 검사하였고, 음성의 결과를 확인 후 공급하였다.
- 종묘생산에 앞서 종묘생산장의 사육수조와 기구의 소독이 이루어졌으며, 오염된 사육수를 통한 NNV감염을 차단하기 위하여 UV멸균 해수를 사용하였다. 아울러 초기 먹이생물로 공급되는 로티퍼와 알테미아 유생의 NNV 오염유무를 먹이공급에 앞서 RT-PCR을 실시하여 검사하였고, 음성의 결과를 확인 후 공급하였다. 이후 정기적인 샘플링을 실시하여 건강한 능성어 치어, 폐사어, 바닥의 침전물(배설물, 먹이잔여물)에 대해서 NNV검출 RT-PCR을 하였으며, 종묘생산 기간 중 전 시료에서 NNV는 검출되지 않았다.
- 아울러 초기 먹이생물로 공급되는 로티퍼와 알테미아 유생의 NNV 오염유무를 먹이공급에 앞서 RT-PCR을 실시하여 검사하였고, 음성의 결과를 확인 후 공급하였다. 이후 정기적인 샘플링을 실시하여 건강한 능성어 치어, 폐사어, 바닥의 침전물(배설물, 먹이잔여물)에 대해서 NNV검출 RT-PCR을 하였으며, 종묘생산 기간 중 전 시료에서 NNV는 검출되지 않았다. 14년 10월경 종묘로 판매가능한 8-10 cm(14.
대상 데이터
- 2012년-2014년 여름철 산란시기에 앞서 한국 남해안 연안의 거문도 해상가두리 양식장, 여수 육상수조식 양식장, 통영 육상수조식 양식장에서 사육중인 4-6년생(7.3±1.45 kg / 73±5.6cm) 능성어 친어에서 난, 정자와 혈액을 샘플링 하였다(Fig. 1).
- 1). 능성어 친어 샘플링은 2012년 168마리, 2013년 3마리, 2014년 31마리를 아래의 방법으로 실시하였다(Table 1)
- NNV 특이 항체 검출을 위한 항원 및 바이러스 검출을 위한 표준 바이러스는 2008년 여수에 위치한 양식장에서 분리한 NNV Yeosu08 isolate (RGNNV)를 사용하였다(Kim et al., 2012). 바이러스 배양을 위한 어류 주화세포는 NNV에 감수성을 나타내는 Striped Snakehead (SSN-1) 주화세포를 사용하였다.
- , 2012). 바이러스 배양을 위한 어류 주화세포는 NNV에 감수성을 나타내는 Striped Snakehead (SSN-1) 주화세포를 사용하였다. 세포 배양액은 10% (V/V) fetal bovine serum (FBS), 100 IU/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycin을 첨가한 Leibovitz`sL-15 medium을 사용하였고 배양된 세포는 25℃ 배양기에서 배양하였다.
- 바이러스 배양을 위한 어류 주화세포는 NNV에 감수성을 나타내는 Striped Snakehead (SSN-1) 주화세포를 사용하였다. 세포 배양액은 10% (V/V) fetal bovine serum (FBS), 100 IU/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycin을 첨가한 Leibovitz`sL-15 medium을 사용하였고 배양된 세포는 25℃ 배양기에서 배양하였다. 25 cm2 세포배양 플라스크(Corning, USA)에 배양된 SSN-1 cell에 NNV Yeosu08을 접종한 후, 25 ℃에 배양하면서 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다.
- 추출한 RNA는 즉시 사용하거나, -80℃에 보관하였다. 추출한 total RNA를 이용하여 cDNA를 합성하기 위하여 M-MLV reverse transcriptase (Bioneer, Korea)를 사용하였다. 추출한 RNA 5 uL와 R3 (5`-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA-3`) reverse primer (10 pmol) 2 uL, RNasefree water 4 uL를 먼저 섞고 65℃에서 10분간 반응시켜 RNA와 primer를 denaturation 시켜주고 반응이 끝난 후 곧바로 얼음에 보관하였다.
- 2014년 경남 통영의 양식장에서 ELISA와 RT-PCR의 결과 모두에서 음성이 확인된 암·수 능성어 친어를 선별하여 종묘생산에 사용하였다.
- 14년 10월경 종묘로 판매가능한 8-10 cm(14.7±1.4 g) 크기로 성장한 능성어 치어 약 3만 마리를 생산하였다.
이론/모형
- 분리한 혈청은 실험에 사용하기까지 -20℃에 보관하였다. 항체검출 ELSIA 실험방법은 Kim et al. (2007)의 실험방법을 참고하여 다음과 같이 실시하였다. 108.
성능/효과
- 2014년 경남 통영의 양식장에서 ELISA와 RT-PCR의 결과 모두에서 음성이 확인된 암·수 능성어 친어를 선별하여 종묘생산에 사용하였다. 수컷 2마리와 암컷 6마리에서 총 4,500 mL의 수정난을 취하였고, 침전난을 제거한 2,700 mL의 부상난 중1,000 mL에서 약 1,000,000마리의 치어를 부화시켰다. 종묘생산에 앞서 종묘생산장의 사육수조와 기구의 소독이 이루어졌으며, 오염된 사육수를 통한 NNV감염을 차단하기 위하여 UV멸균 해수를 사용하였다.
- 4 g) 크기로 성장한 능성어 치어 약 3만 마리를 생산하였다. 친어선별을 통한 NNV 수직감염 예방과 종묘생산기간 중외부로부터의 NNV 수평감염 차단의 결과, 능성어 자치어 시기의 NNV로 인한 대량폐사 없이 건강한 능성어 치어를 생산할 수 있었다.
- 능성어 친어에서 취한 난과 정자를 이용하여 NNV의 검출을 시도한 결과, nested RT-PCR실험에서 총 34개의 난과 정자시료 중 4개(난 2, 정자 2)의 양성결과를 확인할 수 있었고 바이러스 분리배양을 위한 세포접종실험에서 총 22개의 난을 이용하여 NNV배양을 시도한 결과 1개의 난에서 NNV의 배양을 확인하였다. 이상의 결과 능성어 친어에서 난과 정자 모두 NNV가검출되었기에, 능성어 친어의 선별시 암컷과 수컷 모두 선별해야 함을 확인할 수 있었다(Nishizawa et al.
- 본 실험에서는 능성어 친어를 대상으로 과거의 NNV감염이력과 현재의 NNV 보균유무를 확인하기 위하여 ELISA를 실시하였고, 이를 통해 NNV에 대한 특이적인 항체 값을 측정하였다. 본 실험의 결과 2012년 166마리 중 45마리, 2014년 31마리 중 14마리의 능성어 친어에서 NNV항체가 기준치 이상으로 검출되었다. 이는 총 검사 능성어 친어 197마리 중 59마리(30%)는 과거에 NNV에 노출되어 감염 후 회복하였거나, 현재 NNV 보균상태임을 의미한다.
- 이는 총 검사 능성어 친어 197마리 중 59마리(30%)는 과거에 NNV에 노출되어 감염 후 회복하였거나, 현재 NNV 보균상태임을 의미한다. 따라서 본 연구결과의 분석을 통하여 능성어 친어의 NNV에 대한 노출경험 혹은 보균유무를 확인할 수 있었다. 따라서 능성어 친어의 결정에 있어서는 ELISA나 nested RT-PCR결과를 종합하여 과거의 NNV 노출이력이 없으며, 현재도 감염되지 않은 개체를 선정하는 것이 SPF 종묘생산에 효과적이라고 생각된다.
- 따라서 본 연구결과의 분석을 통하여 능성어 친어의 NNV에 대한 노출경험 혹은 보균유무를 확인할 수 있었다. 따라서 능성어 친어의 결정에 있어서는 ELISA나 nested RT-PCR결과를 종합하여 과거의 NNV 노출이력이 없으며, 현재도 감염되지 않은 개체를 선정하는 것이 SPF 종묘생산에 효과적이라고 생각된다. 아울러 양성 및 음성 기준 값의 보다 세밀한 기준설정을 위하여 추가적인 연구가 필요하다고 여겨진다.
- 2014년 위의 방법으로 친어를 선별하고, NNV음성 친어에서 난과 정자를 취하여 능성어 종묘생산을 실시한 결과 능성어 자치어에서 NNV가 검출되지 않았고 초기 대량폐사는 나타나지 않았다. 이상의 결과를 근거로 nested RT-PCR실험과 바이러스 분리배양실험을 통한 NNV항원의 검출, ELISA실험을 통한 NNV 특이항체의 검출의 두 방법은 상호 보완적으로 작용하여 건강한 친어의 선별에 효과적으로 사용이 가능함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 따라서 능성어 친어의 결정에 있어서는 ELISA나 nested RT-PCR결과를 종합하여 과거의 NNV 노출이력이 없으며, 현재도 감염되지 않은 개체를 선정하는 것이 SPF 종묘생산에 효과적이라고 생각된다. 아울러 양성 및 음성 기준 값의 보다 세밀한 기준설정을 위하여 추가적인 연구가 필요하다고 여겨진다.
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