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문제 정의
- 앞에서 기술한 바와 같이, 커피믹스는 설탕과 커피 크리머를 포함하므로 커피믹스로 제조한 커피의 생리활성은 커피만을 사용하는 레귤러 커피에서 알려진 생리활성과는 차이가 있을 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 커피 크리머 첨가 유무에 따른 커피의 항산화 특성 차이를 조사하였다.
가설 설정
- 1) Means in the same column with different letters are significantly different (p<0.05).
- 2) Numbers in parentheses are expressed as mg GAE/mL.
- 3) Means in the same column with different letters are significantly different (p<0.05).
- 3) Numbers in parentheses are expressed as mg CE/mL.
- 4) Numbers in parentheses are expressed as mg GAE/mL.
제안 방법
- 10 mM citric acid와 100% methanol의 혼합비율은, 분석 시작 시점에는 85:15(vol/vol), 0∼35분에는 60:40까지 변화시킨 후, 35∼40분에는 60:40으로 유지하였고, 40∼60분에는 85:15까지 변화시킨 후, 60∼70분에는 85:15로 유지하였다.
- ABTS와 potassium persulfate는 Sigma-Aldrich사 제품을 사용하였다. ABTS와 potassium persulfate를 최종농도 기준으로 각각 7.4 mM과 2.6 mM이 되게끔 용해한 후 실온의 암소에서 16시간 반응시켜 ABTS 이온을 형성시켰다. 제조된 ABTS 용액은 증류수를 첨가하여 734 nm에서 흡광도를 0.
- On-line ABTS HPLC법에서 2개의 검출 파장이 다른 검출기를 연속적으로 사용하여 320 nm에서는 시료의 페놀성 물질들을, 첫 번째 검출기를 통과한 시료와 ABTS 용액을 반응시킨 후 734 nm에서 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였다(Fig. 2). 본 연구에서는 전처리 단계에서 커피시료로부터 단백질과 거대물질을 제거한 후 분석하였다.
- 구체적으로, 시료에 증류수를 사용하여 적절한 비율로 희석한 후 희석한 시료 100μL를 사용하여 측정하였다.
- 농축된 시료와 표준품 용액을 0.45μm membrane filter로 여과하여 여액 20 μL를 Eclipse XDBC18 column(4.6 × 250 mm ID, 3.6 μm, Agilent Technologies Inc.)이 장착된 HPLC(Agilent 1200, Agilent Technologies Inc.)에 주입하였다.
- ABTS 용액 190 μL에 50배 희석한 커피시료 10 μL를 첨가한 뒤 30분간 암실에서 반응 후 734 nm에서 microplate reader(BioTek)로 측정하였다. 대조군으로는 커피시료 대신 증류수를 사용하여 앞에서 기술한 과정을 반복하여 흡광도 값을 측정하였다. ABTS 라디칼소거능은 대조군 대비 실험군 커피시료의 감소된 흡광도의 비율로 계산되었다.
- 6 mL/min 속도로 파장 734 nm로 설정된 두 번째 검출기를 통과하였다. 두 번째 검출기로부터 ABTS 라디칼 소거능 chromatogram을 얻었다. On-line HPLC 결과는 첫 번째 검출기에서 얻은 페놀성물질 chromatogram와 두 번째 검출기에서 얻은 ABTS 라디칼 소거능 chromatogram을 시간을 조정하여 함께 표시하였으며, 페놀성 물질의 농도에 비례하여 양(positive)의 방향으로 표시된 반면, 두 번째 검출기의 ABTS 라디칼 소거능은 소거능에 비례하여 음(negative) 방향으로 표시되었다.
- 선행연구에서 레귤러 커피의 항산화 활성은 커피에 함유된 카페인 함량과 농도의존적 비례관계가 있다고 보고하였다(Kim MJ et al 2013). 따라서, 인스턴트 커피(키피믹스, 자판기 커피)와 레귤러 커피에서 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, ABTS 라디칼 소거능 차이와 커피에 존재하는 카페인 함량을 분석하였다.
- 2). 본 연구에서는 전처리 단계에서 커피시료로부터 단백질과 거대물질을 제거한 후 분석하였다. 320 nm에서 측정한 커피시료 3종의 페놀성 물질은 레귤러 커피의 경우, 분석 초기에 다양한 물질들이 확인되었으며, 상대적으로 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피는 분석 중반 이후에 다양한 물질들이 확인되었다.
- 제조사에 따르면, 커피 크리머에는 식물성 크림(크리머)혹은 무지방 우유 함유 크리머를 사용하는데, 식물성 크림은 카제인나트륨이나 천연카제인 혹은 농축우유단백분말에 물엿, 식물성 경화유지, 제이인산칼륨 등을 포함한다. 본 연구에서는 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피의 커피 크리머(또는 무지방 우유 함유 크리머) 성분에 의해 ABTS 라디칼 소거능이 이들 커피에서 증가된 것으로 예상되나, 구체적인 물질규명을 시도하지 않았다. 커피의 항산화 활성에 영향을 미치는 생리활성 성분들에는 카페인, 클로로겐산 이외에도 토코페롤을 포함한 다양한 지용성 물질들과 수용성물질들이 복합적으로 작용하므로 본 연구의 결과만으로는 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피의 항산화 활성을 설명하기에는 제한점이 있다.
- 시료에 함유된 클로로겐산(CGA)와 카페인의 함량은 HPLC로 분석하였다(Fujioka K & Shibamoto T 2008).
- 용매인 water와 acetonitrile의 혼합비율은, 0∼10분에는 100:0(vol/vol), 10∼80분에는 0:100으로 변화시킨 후, 80∼100분에는 100:0까지 변화시켰다. 유속 0.4 mL/min의 속도로 칼럼을 통과한 물질들은 파장 320 nm로 설정된 첫 번째 검출기에서 페놀성 물질들이 분석되었으며, 연속적으로 첫 번째 검출기를 통과한 후 T자 모양의 관으로 0.2 mL/min의 속도로 공급되는 ABTS 라디칼이 생성된 ABTS 시약과 합류된 후, 유속 0.6 mL/min 속도로 파장 734 nm로 설정된 두 번째 검출기를 통과하였다. 두 번째 검출기로부터 ABTS 라디칼 소거능 chromatogram을 얻었다.
- 커피믹스는 1회분 용량의 내용물 전체를 종이컵으로 옮긴 후에 실제 음용수의 조건인 65℃로 온도가 조절된 뜨거운 증류수 77 mL를 첨가하여 충분히 용해시킨 후 실험에 사용하였다. 측정한 실험결과는 시료마다 용량이 다르므로 한 컵에 들어있는 함량을 표시하기 위해 serving size로 나타낸 값을 함께 제시하였다.
- 카페인과 클로로겐산 함량을 HPLC로 분석하였다(Fig. 1, Table 3). 1회분 커피에 포함된 평균 카페인 함량은 레귤러커피, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피가 각각 106.
- 커피에 함유된 가용성 고형물 함량 측정에는 당도계(N-1a, Atago, Tokyo, Japan)를 사용하였다. 구체적으로, 시료에 증류수를 사용하여 적절한 비율로 희석한 후 희석한 시료 100μL를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- )에 주입하였다. 10 mM citric acid(용매 A)와 100% methanol(용매 B)을 사용하였다. 분석시간 70분 동안 10 mM citric acid와 100% methanol은 다음과 같이 농도구배를 주어 농도를 달리하였다.
- ABTS 라디칼 소거능 활성 측정은 흡광도 측정법과 on-line HPLC법에 의한 측정 등 2가지로 구분하여 측정하였으며, 흡광도 측정법은 ABTS cation decolorization assay 방법(Re R et al 1999)에 따라 다음과 같이 측정하였다. ABTS와 potassium persulfate는 Sigma-Aldrich사 제품을 사용하였다. ABTS와 potassium persulfate를 최종농도 기준으로 각각 7.
- )에 주입하였다. HPLC용 water와 acetonitrile을 용매로 사용하였다. 분석시간 100분 동안 water와 acetonitrile은 다음과 같이 농도구배를 주어 농도를 달리하였으며, 유속은 0.
- 시료는 레귤러 커피 2종, 커피, 설탕과 커피 크리머가 혼합된 커피믹스 7종, 삼척 지역 자판기 커피(vending machine coffee) 13종을 구입하여 사용하였다. 레귤러 커피의 경우에는 2종 모두 아라비카 품종의 커피원두를 사용하였다.
- 실험에 사용한 커피 크리머 함유 커피믹스의 경우, 시장점유율 기준으로 상위 1∼3위 사의 제품을 각각 2∼3개를 사용하였다.
- 실험에 사용한 커피 크리머 함유 커피믹스의 경우, 시장점유율 기준으로 상위 1∼3위 사의 제품을 각각 2∼3개를 사용하였다. 자판기 커피 시료의 경우, 강원도 삼척 지역에서 판매되는 상업용 커피를 무작위로 선정하여 구매하였다. 레귤러 커피와 자판기 커피는 한 컵의 용량을 무게로 측정한 뒤 시료로 사용하였다.
- 회수한 상층액 시료를 농축기(Eppendorf Vacufuge plus Vacuum Concentrator, Eppendorf)로 최종부피를 1mL로 농축한 후 HPLC에 주입하였다. 클로로겐산과 카페인의 표준품은 Sigma-Aldrich사 제품을 사용하였다. 농축된 시료와 표준품 용액을 0.
데이터처리
- 실험결과는 3회 반복하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 유의성 평가를 위하여 SPSS ver 17.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 각 측정군들 간의 차이 유무를 one-way ANOVA(analysis of variation)로 분석한 후, 통계적 유의성은 Duncan’s multiple range test를 이용하여 검정하였다.
이론/모형
- ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid)라디칼 소거능 분석은 Hyun JM 등(2015)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다. ABTS 라디칼 소거능 활성 측정은 흡광도 측정법과 on-line HPLC법에 의한 측정 등 2가지로 구분하여 측정하였으며, 흡광도 측정법은 ABTS cation decolorization assay 방법(Re R et al 1999)에 따라 다음과 같이 측정하였다. ABTS와 potassium persulfate는 Sigma-Aldrich사 제품을 사용하였다.
- ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid)라디칼 소거능 분석은 Hyun JM 등(2015)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다.
- 총 폴리페놀 분석은 Park JW 등(2007)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다.
- 총 플라보노이드 분석은 Park JW 등(2007)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다. 총 페놀 함량측정과 동일한 시료 500 μL에 5% NaNO2를 15 μL 첨가한 후, 5분간 실온에서 반응시켰다.
성능/효과
- 1회분 커피에 포함된 평균 카페인 함량은 레귤러커피, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피가 각각 106.0mg, 46.8 mg과 45.5 mg으로 측정되어 레귤러 커피에서 가장 높았다(p<0.05).
- 1회분 커피에 포함된 평균 클로로겐산 함량은 레귤러커피, 커피믹스로 제조한 커피, 자판기 커피가 각각 24.2 mg, 8.9 mg과 7.6 mg으로 측정되어 레귤러 커피에서 가장 높았다(p<0.05).
- ABTS 라디칼 소거능은 레귤러 커피가 24.7%였으며, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피는 각각 49.3%와 46.5%로 나타나, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피가 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 두 번째 검출기로부터 ABTS 라디칼 소거능 chromatogram을 얻었다. On-line HPLC 결과는 첫 번째 검출기에서 얻은 페놀성물질 chromatogram와 두 번째 검출기에서 얻은 ABTS 라디칼 소거능 chromatogram을 시간을 조정하여 함께 표시하였으며, 페놀성 물질의 농도에 비례하여 양(positive)의 방향으로 표시된 반면, 두 번째 검출기의 ABTS 라디칼 소거능은 소거능에 비례하여 음(negative) 방향으로 표시되었다.
- pH는 5.3∼6.2로 측정되었으며, 인스턴트 커피가 레귤러 커피에 비교시 유의적으로 높았다.
- 가용성 고형물은 레귤러 커피, 커피믹스로 제조한 커피, 자판기 커피 순서로 각각 0.6 ºBx, 7.6 ºBx와 11.4 ºBx로 나타나, 인스턴트 커피에서 당 함량이 유의적으로 높았다(p<0.001).
- 따라서, 본 연구에서 확인된 커피믹스로 제조한 커피의 가용성 고형물 함량 7.6 ºBx는 예측한 결과와 부합된다.
- 레귤러 커피의 pH는 5.3였으며, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피의 pH는 각각 5.7와 6.2로 나타나, 설탕과 커피 크리머(또는 무지방 우유 함유 크리머)가 포함된 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피의 pH가 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 실험에 나타난 원두 커피의 평균 가용성 고 형물 함량은 0.9 ºBx로 가장 낮게 나타났으며, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피는 각각 7.6 ºBx와 11.4 ºBx로 나타났다(p<0.05).
- 05). 카페인 함량은 레귤러 커피, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피에서 각각 0.43 mg/mL, 0.60 mg/mL와 0.62 mg/mL로 나타났으며, 클로로겐산 함량은 레귤러 커피, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피에서 각각 0.10 mg/mL, 0.12 mg/mL와 0.10 mg/mL로 나타났다. On-line HPLC를 사용해 ABTS 라디칼 소거능을 측정시, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피에서는 유사한 크로마토그램 패턴을 보인 반면, 레귤러 커피와는 뚜렷한 차이를 보여 인스턴트 커피에 사용되는 커피 크리머(또는 무지방 우유함유 크리머)에 다양한 생리활성 물질들이 포함되어 있어서 항산화력을 증가시키는 원인이 되었다.
- 커피 1 mL에 포함된 평균 카페인 함량은 레귤러 커피, 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피가 각각 0.43 mg/mL, 0.60 mg/mL와 0.62 mg/mL로 측정되어 자판기 커피에서 가장 높았다(p<0.05).
- 2 mg)의 결과가 유사하였다. 커피 1 mL에 포함된 평균 클로로겐산 함량은 레귤러 커피, 커피믹스로 제조한 커피, 자판기 커피가 각각 0.10mg/mL, 0.12 mg/mL와 0.10 mg/mL로 측정되었다(Table 3). 하지만, 본 연구는 클로로겐산 세 가지 물질들 중에서 CQA만을 정량하였으므로 커피에 있는 모든 클로로겐산을 포함하지 않았다는 제한점이 있다.
- 커피에 들어있는 폴리페놀 함량은 인스턴트 커피(1.5∼1.6 GAE mg/mL)가 레귤러 커피(0.5 mg/mL)에 비교시 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 2 mg으로 나타나, 본 실험과 유사하게 측정되었다. 타 연구자들의 결과로 판단시 커피믹스로 제조한 커피나 자판기 커피와 달리 레귤러 커피는 상대적으로 많은 양의 원두에 뜨거운 물로 추출하고 희석하여 섭취하기 때문에, 희석 현상에 의해 단위부피(mL)에 함유된 카페인의 함량이 줄어든 것으로 판단된다. 레귤러 커피의 경우, 커피원두를 300∼350℃의 고온에서 5∼20분간 볶음공정 후 분쇄하여 커피분말을 얻고, 80∼95℃열수로 추출하여 제조된다(Yang SI et al 2015).
- 플라보노이드 함량과 ABTS 라디칼 소거능에서도 유사한 경향이 나타나, 인스턴트 커피가 레귤러 커피에 비교시 유의적으로 높았다(p<0.05).
후속연구
- 커피의 항산화 활성에 영향을 미치는 생리활성 성분들에는 카페인, 클로로겐산 이외에도 토코페롤을 포함한 다양한 지용성 물질들과 수용성물질들이 복합적으로 작용하므로 본 연구의 결과만으로는 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피의 항산화 활성을 설명하기에는 제한점이 있다.
- 10 mg/mL로 측정되었다(Table 3). 하지만, 본 연구는 클로로겐산 세 가지 물질들 중에서 CQA만을 정량하였으므로 커피에 있는 모든 클로로겐산을 포함하지 않았다는 제한점이 있다.
- 커피의 항산화 활성에 영향을 미치는 생리활성 성분들에는 카페인, 클로로겐산 이외에도 토코페롤을 포함한 다양한 지용성 물질들과 수용성물질들이 복합적으로 작용하므로 본 연구의 결과만으로는 커피믹스로 제조한 커피와 자판기 커피의 항산화 활성을 설명하기에는 제한점이 있다. 하지만, 한국인의 식생활에서 인스턴트 커피의 섭취빈도가 증가하고 있는 실정을 고려시 인스턴트 커피섭취시 예상되는 생리활성 성분과 항산화 활성에 대한 더 많은 후속연구가 필요하다고 생각된다.
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