[국내논문]HPLC와 NMR를 이용한 염미성 펩타이드 분석방법 검증 An Analytical Method for the Validation of a Salt-enhancing Peptide Using a Liquid Chromatography and a Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy원문보기
최근 염분의 섭취와 관련하여 건강에 대한 우려가 늘어남에 따라, 염미대체제에 대한 소비자들의 관심이 급증하고 있으며, 세계적으로 경쟁력 있는 천연 저염제품의 개발이 필요한 실정이다. 최근 연구를 통해 식물성 및 동물성 원료 배합을 통해 가수분해물을 조제하여 최적 화합물을 얻는 것에 성공하였다. 본 연구에서는 염미성 펩타이드 분말내 arginine을 함유한 염미성 펩타이드를 규명하고 정량 하고자 하였다. L-arginine 또는 arginine을 포함한 펩타이드를 표준물질로 하여 $^{13}C$-NMR로 분석한 결과 유사한 위치에 구아니딘기 탄소가 시그널(L-arginine: 156.8 ppm, Arg-Ala: 156.4 ppm, Arg-Ser: 156.4 ppm)이 나타남을 확인하였고, 이를 통해 간편하고 신속하게 arginine 함유 펩타이드 정량분석이 가능할 것으로 기대된다.
최근 염분의 섭취와 관련하여 건강에 대한 우려가 늘어남에 따라, 염미대체제에 대한 소비자들의 관심이 급증하고 있으며, 세계적으로 경쟁력 있는 천연 저염제품의 개발이 필요한 실정이다. 최근 연구를 통해 식물성 및 동물성 원료 배합을 통해 가수분해물을 조제하여 최적 화합물을 얻는 것에 성공하였다. 본 연구에서는 염미성 펩타이드 분말내 arginine을 함유한 염미성 펩타이드를 규명하고 정량 하고자 하였다. L-arginine 또는 arginine을 포함한 펩타이드를 표준물질로 하여 $^{13}C$-NMR로 분석한 결과 유사한 위치에 구아니딘기 탄소가 시그널(L-arginine: 156.8 ppm, Arg-Ala: 156.4 ppm, Arg-Ser: 156.4 ppm)이 나타남을 확인하였고, 이를 통해 간편하고 신속하게 arginine 함유 펩타이드 정량분석이 가능할 것으로 기대된다.
Salt, or sodium chloride (NaCl), is a critical ingredient in many foods. It has roles in the flavor profiles of food products, textures of foods and preservation of foods against microbes. However, it increases risks of hypertension and is closely related to the development of cardiovascular disease...
Salt, or sodium chloride (NaCl), is a critical ingredient in many foods. It has roles in the flavor profiles of food products, textures of foods and preservation of foods against microbes. However, it increases risks of hypertension and is closely related to the development of cardiovascular disease. In recent years, health concerns related to sodium intake caused an increased demand for salt-reduced products in worldwide; it became necessary to develop natural salt-alternative products that are globally competitive. In a recent study, researchers succeeded in obtaining a natural salt enhancer through the hydrolysis of vegetable- and animal-matter mixtures. This study used various methods to identify and quantify peptide-containing arginine as a salt-alternative peptide (SAP) in an optimum combination. Arginine, or dipeptide-containing arginine, was analyzed as a standard substance using an NMR spectroscopy. The NMR carbon signal of the guanidine group of the standard substance was verified in a similar location (the L-arginine (Arg) was 156.8 ppm, the Arg-Alanine was 156.4 ppm and the Arg-Serine was 156.4 ppm). The results suggested that it is possible to analyze peptide-containing arginine quantitatively through the hydrolysis of vegetable- and animal-matter mixtures.
Salt, or sodium chloride (NaCl), is a critical ingredient in many foods. It has roles in the flavor profiles of food products, textures of foods and preservation of foods against microbes. However, it increases risks of hypertension and is closely related to the development of cardiovascular disease. In recent years, health concerns related to sodium intake caused an increased demand for salt-reduced products in worldwide; it became necessary to develop natural salt-alternative products that are globally competitive. In a recent study, researchers succeeded in obtaining a natural salt enhancer through the hydrolysis of vegetable- and animal-matter mixtures. This study used various methods to identify and quantify peptide-containing arginine as a salt-alternative peptide (SAP) in an optimum combination. Arginine, or dipeptide-containing arginine, was analyzed as a standard substance using an NMR spectroscopy. The NMR carbon signal of the guanidine group of the standard substance was verified in a similar location (the L-arginine (Arg) was 156.8 ppm, the Arg-Alanine was 156.4 ppm and the Arg-Serine was 156.4 ppm). The results suggested that it is possible to analyze peptide-containing arginine quantitatively through the hydrolysis of vegetable- and animal-matter mixtures.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 동·식물성 발효 조성물에 포함된 펩타이드 및 아미노산 함량의 정량 법을 개발하고 유효성을 검증하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC), 핵자기 공명 분광법(Nuclear magnetic resonance; NMR)등 다양한 방법을 이용하여 검증하였다.
제안 방법
SAP 10 mg을 200 μl acetonitrile/H2O (5:5, v/v)로 녹여 benzyl bromide 10 mg을 추가하여 12시간 교반 하였고, 반응 종료 후 남은 benzyl bromide 제거를 위해 16시간 동결건조 하였다.
1H- 및 13C-NMR spectra는 Joel resonance (Japan)사의 JNM-ECZ 500R를 이용하여 500과 125 MHz에서 각각 측정하였으며, Chemical shift는 δ (ppm)로 나타내었다.
O (5:5, v/v)로 녹인 후, 필터를 사용하여 정제한 용액을 liquid chromatography (LC) 표준 시료로 사용하였다. 또한, 아미노산 정량을 위해 아민(-NH2)기를 중성 조건과 염기성 조건에서 benzyl chloride로 capping 한 시료를 함께 분석하였다. Capping된 시료는 다음과 같은 방법으로 준비되었다.
분석하고자 하는 아미노산은 -COOH, -NH2그룹이 포함되어 있는 친수성이 큰 물질이므로, C18-칼럼을 사용한 HPLC 분석 시 머무름 시간이 짧아 분리 및 분석이 힘들다는 단점이 있다. 이러한 점을 극복하기 위해 아미노산의 -NH2 그룹에 benzyl기로 보호하여 C18-칼럼 내 머무름 시간을 최적화 하였다.
준비된 시료의 분석을 위해 최적 HPLC 조건을 검토한 결과, Shimadzu (Japan)사의 VP-ODS (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)을 고정상으로 하여 40℃ 오븐에서 유속은 1.0 ml/ min으로 분석하였다.
시료 20 mg을 400 μl acetonitrile/ H2O (5:5, v/v)로 녹인 후 절반은 표준 시료로 사용하였고, 나머지 절반은 benzyl bromide 10 mg 와 K2CO3 10 mg을 추가하여 12시간 교반 하였다.
1% trifluoro acetic acid (TFA)가 포함된 H2O (A)와 acetonitrile (B)을 사용하였으며. 최초 100%(A)로 시작하여 40분 후 100%(B)가 되도록 gradient를 준 후 10분간 유지하는 조건을 설정하였다.
0 ml/ min으로 분석하였다. 또한 이동상으로는 0.1% TFA가 포함된 H2O (A)와 acetonitrile (B)을 사용하였으며, 최초 100%(A)로 시작하여 40분 후 100%(B)가 되도록 gradient를 준 후 10분간 유지하는 조건을 설정하였다. 적정 파장은 190 nm와 254 nm 로 설정하였으며, 이 방법으로 SAP 시료를 분석할 경우 30분 이내에 모든 성분을 확인 할 수 있었다(Fig.
시료 20 mg을 400 μl acetonitrile/ H2O (5:5, v/v)로 녹인 후 절반은 표준 시료로 사용하였고, 나머지 절반은 benzyl bromide 10 mg 와 K2CO3 10 mg을 추가하여 12시간 교반 하였다. 반응 종료 후 남은 benzyl bromide 제거를 위해 16시간 동결건조 하였으며, 위와 동일한 방법을 통해 분석하였다. 그 결과, 23~25분 사이의 머무름 시간에서 유의미한 피크 변화가 일어남을 확인할 수 있었다(Fig.
본 실험에서는 표준 물질로서 L-Arg과 arginine을 포함한 두 종의 염미성 펩타이드(Arg-Ala, Arg-Ser)를 이용하여 NMR 분석을 수행하였다. 총 3종의 표준물질을 일정량(Arg: 20.
각 시료의 1H-NMR spectrum을 얻기 위해 500 MHz 주파수에서 relaxation time은 5초, 온도는 25℃로 설정 한 후, 32회 scan하여 최종 결과를 얻었다. 또한, 13C-NMR spectrum 결과를 위해 125 MHz 주파수에서 relaxation time은 2초, 온도는 25℃, scan number는 12288.0회 조건에서 분석을 수행하였다 (Table 1).
본 실험에서는 표준 물질로서 L-Arg과 arginine을 포함한 두 종의 염미성 펩타이드(Arg-Ala, Arg-Ser)를 이용하여 NMR 분석을 수행하였다. 총 3종의 표준물질을 일정량(Arg: 20.2 mg, Arg-Ala: 5.0 mg, Arg-Ser: 20.0 mg) 취한 후, 0.7 ml의 D2O에 녹여 시료를 준비하였으며 준비된 시료는 Joel resonance (Japan)사의 JNM-ECZ500R를 이용하여 측정하였다. 각 시료의 1H-NMR spectrum을 얻기 위해 500 MHz 주파수에서 relaxation time은 5초, 온도는 25℃로 설정 한 후, 32회 scan하여 최종 결과를 얻었다.
실험에 사용된 high-performance liquid chromatography (HPLC)는 Shimadzu (Japan)사의 LC-6AD 시스템은 사용하였으며, 고정상은 Shimadzu (Japan)사의 VP-ODS (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)을 사용하였다.
6 mm × 250 mm, 5 μm)을 사용하였다. HPLC용 용매인 acetonitrile은 J. T. Baker사 제품을 사용하였고, H2O는 3차 증류수를 여과하여 사용하였다. 그 외 시약은 특급 시약을 사용하였다.
1H- 및 13C-NMR spectra는 Joel resonance (Japan)사의 JNM-ECZ 500R를 이용하여 500과 125 MHz에서 각각 측정하였으며, Chemical shift는 δ (ppm)로 나타내었다. 지표 성분 정량에 사용된 두 종류의 dipeptide (Arg-Ala, Arg-Ser)는 애니젠(Korea) 사에서 구입하였으며, L-Arg은 대정화금(Korea)사에서 구입하였다.
0 ml/min, injection volume은 10 μl으로 설정하였다. 이동상으로는 0.1% trifluoro acetic acid (TFA)가 포함된 H2O (A)와 acetonitrile (B)을 사용하였으며. 최초 100%(A)로 시작하여 40분 후 100%(B)가 되도록 gradient를 준 후 10분간 유지하는 조건을 설정하였다.
또한, 구아니딘 위치의 탄소 시그널은 다른 위치의 탄소 시그널들과 겹치지 않아 정확한 적분비와 화학적 이동 값을 얻는 것이 가능 하였다. 따라서, 구아니딘 위치의 탄소 시그널을 L-arginine을 포함한 peptide 정량을 위한 내부표준시그널로 선정하였다. 비록 충분한 양의 SAP를 확보하지 못하여 유의미한 13C-NMR 스펙트럼 결과를 얻는 것은 실패하였지만, 위 결과를 통해 arginine 함유 펩타이드 정량분석을 위해 NMR의 사용이 매우 간편하고 효율적인 수단임을 증명하였다.
이론/모형
HPLC는 다양한 물질의 분석 및 정제를 위해 사용하는 분석기기로서 식품, 제약, 화장품, 환경 등 여러 분야에서 필수적인 분석 기술로 알려져 있다. 따라서, 본 실험에서는 SAP 내 펩타이드 및 아미노산 함량을 정량 하기 위한 한 방법으로 HPLC를 이용하였다. 분석하고자 하는 아미노산은 -COOH, -NH2그룹이 포함되어 있는 친수성이 큰 물질이므로, C18-칼럼을 사용한 HPLC 분석 시 머무름 시간이 짧아 분리 및 분석이 힘들다는 단점이 있다.
성능/효과
반응 종료 후 남은 benzyl bromide 제거를 위해 16시간 동결건조 하였으며, 위와 동일한 방법을 통해 분석하였다. 그 결과, 23~25분 사이의 머무름 시간에서 유의미한 피크 변화가 일어남을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
7 ml의 D2O에 녹여 시료를 준비하였으며 준비된 시료는 Joel resonance (Japan)사의 JNM-ECZ500R를 이용하여 측정하였다. 각 시료의 1H-NMR spectrum을 얻기 위해 500 MHz 주파수에서 relaxation time은 5초, 온도는 25℃로 설정 한 후, 32회 scan하여 최종 결과를 얻었다. 또한, 13C-NMR spectrum 결과를 위해 125 MHz 주파수에서 relaxation time은 2초, 온도는 25℃, scan number는 12288.
다음으로 각 표준물질의 13C NMR spectrum을 살펴 본 결과, 모든 시료에서 156.0~156.9 ppm 사이에 하나의 탄소 피크가 나타남을 확인하였다(Fig. 4). 위 실험에서 얻어낸 결과와 각 시료들의 문헌치를 비교하여 보았을 때, 156.
4 ppm)을 나타내며, 무시할 수 있을 만큼의 오차를 가진다. 또한, 구아니딘 위치의 탄소 시그널은 다른 위치의 탄소 시그널들과 겹치지 않아 정확한 적분비와 화학적 이동 값을 얻는 것이 가능 하였다. 따라서, 구아니딘 위치의 탄소 시그널을 L-arginine을 포함한 peptide 정량을 위한 내부표준시그널로 선정하였다.
따라서, 구아니딘 위치의 탄소 시그널을 L-arginine을 포함한 peptide 정량을 위한 내부표준시그널로 선정하였다. 비록 충분한 양의 SAP를 확보하지 못하여 유의미한 13C-NMR 스펙트럼 결과를 얻는 것은 실패하였지만, 위 결과를 통해 arginine 함유 펩타이드 정량분석을 위해 NMR의 사용이 매우 간편하고 효율적인 수단임을 증명하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
식품에서 사용되는 염화칼륨의 단점은?
식품에서 나트륨을 저감화 하기 위한 방법 중 하나로, 나트륨을 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등의 금속염으로 대체하는 방법이 있다. 대표적인 예로 염화칼륨(KCl)이 있으며, 이는 다양한 식품에서 사용되고 있지만 강한 쓴맛과 금속성 이취감 등의 단점이 보고되고 있다[7]. 다른 방법으로는 mono sodium glutamate(MSG), 효모 추출물, 아미노산 등 자신은 짠맛을 거의 가지고 있지 않지만 소금의 짠맛을 끌어내는 염미증강제를 이용한 방법이 있다[3, 8].
아미노산을 활용한 짠맛 증강 소재로 어떤 것이 있는가?
다른 방법으로는 mono sodium glutamate(MSG), 효모 추출물, 아미노산 등 자신은 짠맛을 거의 가지고 있지 않지만 소금의 짠맛을 끌어내는 염미증강제를 이용한 방법이 있다[3, 8]. 이 중 아미노산을 활용한 짠맛 증강 소재로는 L-arginine (L-Arg), L-lysine (L-Lys) 등의 아미노산이 보고되어 있으며, 특히 L-Arg을 포함한 펩타이드들의 구아니딜 그룹은 Na+-channel과 상호작용하여 Na+ ion의 유입을 향상시켜 짠맛을 증강시키는 것으로 보고 되어있다[4]. 하지만 합성을 통한 아미노산 계열은 염미 부스팅 효과가 있음에도 소비자로부터 선택되지 않아 시장성이 떨어지며, MSG는 발효로 만들어 지지만 단일 원료로 화학적으로 생성된다는 이미지가 확고해 소비자들에게 외면되고 있는 추세이다[2].
나트륨을 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등의 금속염으로 대체하는 방법으로 대표적인 것은?
식품에서 나트륨을 저감화 하기 위한 방법 중 하나로, 나트륨을 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등의 금속염으로 대체하는 방법이 있다. 대표적인 예로 염화칼륨(KCl)이 있으며, 이는 다양한 식품에서 사용되고 있지만 강한 쓴맛과 금속성 이취감 등의 단점이 보고되고 있다[7]. 다른 방법으로는 mono sodium glutamate(MSG), 효모 추출물, 아미노산 등 자신은 짠맛을 거의 가지고 있지 않지만 소금의 짠맛을 끌어내는 염미증강제를 이용한 방법이 있다[3, 8].
참고문헌 (9)
Kesteloot, H. and Joossens, J. V. 1988. Relationship of dietary sodium, potassium, calcium, and magnesium with blood pressure. Belgian Interuniversity Research on Nutrition and Health. Hypertension 12, 594-599.
Kil, G. Y. and Jin, S. Y. 2015. A survey of awareness and preference for MSG according to the pursuit of well-being in diet. J. Kor. Soc. Food Cult. 30, 481-490.
Ogawa, T., Nakamura, T., Tsuji, E., Miyanaga, Y., Nakagawa, H., Hirabayashi, H. and Uchida, T. 2004. The combination effect of L-arginine and NaCl on bitterness suppression of amino acid solutions. Chem. Pharm. Bull. 52, 172-177.
Powles, J., Fahimi, S., Micha, R., Khatibzadeh, S., Shi, P., Ezzati, M., Engell, R. E., Lim, S. S., Danaei, G. and Mozaffarian, D. 2013. Global, regional and national sodium intakes in 1990 and 2010: a systematic analysis of 24 h urinary sodium excretion and dietary surveys worldwide. BMJ open 3, e003733.
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