[논문]rs2rs2titi 유전자형을 가진 노란 콩 계통 선발

최상우; 박준현; 정종일

doi:10.5352/jls.2018.28.11.1285

rs2rs2titi 유전자형을 가진 노란 콩 계통 선발
Selection of rs2rs2titi Soybean Genotype with Yellow Seed Coat 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.11 = no.223, 2018년, pp.1285 - 1289

최상우 (경상대학교 농학과) , 박준현 (경상대학교 농학과) , 정종일 (경상대학교 농학과)

초록
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콩[Glycine max (L.) Merr.]은 한반도와 남만주 및 중국일대가 원산지로 예로부터 식물성 단백질과 지방을 얻기 위하여 아시아 지역에서 많이 재배되었다. 최근에는 다양한 기능성 성분들이 발견됨에 따라 단순한 양질의 단백질 공급원의 역할을 넘어 건강 기능성 식품으로 주목받고 있지만 기능성과 가공 적성 및 품질을 저해시키는 성분들도 다수 존재한다. 본 연구는 콩 및 콩 제품의 품질과 기능성을 떨어뜨리는 성분인 Kunitz Trypsin Inhibitor(KTI) 단백질이 없으면서 난소화성 올리고당인 stachyose 함량이 낮은 rs2rs2titi 유전자형을 가진 노란 콩 계통을 선발하기 위하여 진행되었다. Jinyangkong ${\times}$ 15G1의 조합으로 얻어진 육종집단으로부터 rs2rs2titi 유전자형을 가진 4개의 계통(603-1, 603-2, 625, 694)을 선발하였다. 선발된 4개의 계통 $F_5$ 성숙 종자에서 KTI 단백질은 없었으며 초장은 64~66 cm, 백립중은 26.1~29.2 g으로 대립이었으며 종피색과 제색은 모두 노란색이었다. 선발계통의 stachyose 함량은 3.09~3.50 g/kg으로 RS2RS2 유전자형을 가진 대조품종들의 stachyose 함량 13.02~16.81 g/kg보다 매우 낮았다. 본 연구를 통하여 선발된 계통들은 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질이 없으면서 난소화성 올리고당인 stachyose의 함량이 낮은 고품질 기능성 노란 콩 품종육성을 위한 중간모본으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Soybean [Glycine max (L.) Merr.] seed is an important dietary source of protein, oil, carbohydrates, isoflavones, and other nutrients for humans and animals. But, antinutritional factors in the raw mature soybean are exist. Kunitz trypsin inhibitor (KTI) protein and stachyose are main antinutritional factors in soybean seed. The genetic removal of the antinutritional factors will improve the nutritional value of soybean seed. The objective of this research was to breed a new yellow soybean strains (rs2rs2titi genotype) with the traits of lacking of KTI protein and low content of stachyose. Breeding population was developed from the cross of "Jinyangkong" and 15G1 parents. Presence or absence of KTI protein was detected based on Western Blot technique. Content of stachyose in mature seed was detected by HPLC. Total four new strains (603-1, 603-2, 625, and 694) with KTI protein free and low content of stachyose were selected. Four strains (603-1, 603-2, 625, and 694) have yellow seed coat and hilum. Plant height of 603-1 strain was 65 cm and 100-seed weight was 29.2 g. Plant height of 603-2 strain was 66 cm and 100-seed weight was 26.2 g. Plant height of 625 strain was 64 cm and 100-seed weight was 27.1 g. Content of stachyose for four new strains was 3.0~3.50 g/kg. Four strains selected in this research will be used to improve new yellow soybean cultivar with KTI protein free, and low content of stachyose.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Scheme for selection of lacking of Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) protein and low content of stachyose (rs2rs2titi genotype).
표 Table 1. Flower color, seed coat color, hilum color, and genotype for Rs2 (rs2) and Ti (ti) alleles of two parents used in this experiment
그림 Fig. 2. Segregation of Kunitz trypsin inhibitor (KTI) protein in the parents and F₂ seeds. Arrow is the KTI protein band. P1: Jinyangkong, P2: 15G1. +, -: presence and absence of KTI protein, respectively.
그림 Fig. 3. Identification of Kunitz Trypsin Inhibitor(KTI) protein free for four F₅ seed strains selected in this experiment. P1: Jinyangkong, P2: 15G1. +, -: presence and absence KTI protein, respectively.
표 Table 2. Planting date, harvesting date, plant height, seed weight, seed coat color and hilum color for four new strains
표 Table 3. Content of stachyose for five cultivars and four new strains selected in this experiment

AI 본문요약
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문제 정의

KTI 단백질은 Molecular linkage map A2 (chromosome 8번)에 위치하는 Ti 유전자에 의해 조절되는데 recessive allele (ti)일 경우 KTI 단백질이 유전적으로 결핍되어진 형태이며[14], KTI 단백질이 결핍되어진 유전자원으로는 PI157440, PI196168 등이 있다. 따라서 본 연구는 성숙 콩 종실에서 품질, 기능성 및 가공 적성을 저하시키는 KTI 단백질이 없으면서 난소화성 올리고당인 Stachyose 함량이 낮은 rs2rs2titi 노란 콩 유전자형을 선발하여 품종화 및 중간모본으로 활용하기 위하여 진행되었다.

제안 방법

1 ml에 단백질 및 기타유기 colloid 등을 침전시키기 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상층액을 0.2 µl membrane 필터에 필터하고 난 후 냉장고에 저장하면서 HPLC를 통해 분석하였다.
3. Identification of Kunitz Trypsin Inhibitor(KTI) protein free for four F₅ seed strains selected in this experiment. P1: Jinyangkong, P2: 15G1.
5 ml/min, 온도는 30℃로 유지시켰다. Reflective index detector (RID) 검출기를 사용했으며 stachyose의 각 standard를 10, 8, 6, 4, 2, 0 mg/ml로 calibration 후 각각의 sample 당 stachyose 의 함량 분석을 실시하였다. Rs2Rs2 유전자형을 가진 장려품종들의 stachyose 함량 비교를 위해 태광콩, 대양콩, 풍산나물콩, 진품콩2호, 미소를 이용하였다.
각각의 F₂ 종자를 이용하여 KTI 단백질이 없는 종자를 선발하여 포장에서 F₂ 개체로 전개시켰다. 각각의 F₂ 개체를 수확한 후 random으로 종자를 골라 stachyose의 성분 함량을 측정하였다. 저함량 계통을 선발하여 포장에서 F₃ 계통으로 전개시켜 초형, 성숙기, 종자상태등 농업적 형질을 점검하여 양호한 계통을 선발하여 포장에서 F₄ 계통으로 유지시켜 농업적 형질을 점검하였다.
KTI 단백질의 유무는 SDS-PAGE 및 Western blot 방법을 이용하였다. 각각의 F₂ 종자로부터 배를 제외한 성숙 자엽을 절취하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질 시료의 농도를 정량한 후 12% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 하였다.
얻어진 F₁ 종자를 F₁ 식물체로 양성하면서 잡종성을 확인 한 후 성숙기에 F₂ 종자를 얻었다. 각각의 F₂ 종자를 이용하여 KTI 단백질이 없는 종자를 선발하여 포장에서 F₂ 개체로 전개시켰다. 각각의 F₂ 개체를 수확한 후 random으로 종자를 골라 stachyose의 성분 함량을 측정하였다.
1% Tween 20에 5분씩 3번 씻고, 2차 antibody와 1시간 동안 반응시켰다. 그런 후 다시 TTBS buffer에 5분씩 3번 씻은 후 ECL kit를 사용하여 X-ray film에서 KTI 단백질 존재여부를 확인하였다.
이는 raffinose와 stachyose의 함량이 차이 나는 계통에 대한 포장 실험결과 수량 등 대부분의 농업적 형질에서 차이가 없었다는 이전의 연구 결과와 일치하였다[6]. 선발된 4개의 계통(603-1, 603-2, 625, 694)에 대한 F₅ random 종자를 이용하여 단백질 추출 후 Western Blot으로 KTI 단백질의 유무를 확인한 결과는 Fig.3과 같다.
개체를 수확 한 후 random으로 종자를 골라 stachyose의 함량을 HPLC 방법으로 측정하였다. 선발된 종자들의 종피를 제거한 후 미세하게 분말로 갈아서 각 시료 당 수분을 동일하게 제거한 후 500mg을 취하여 acetone 10 ml를 가하여 약 2시간 동안 열을 가하면서 지방을 제거하였다. 필터를 통해 acetone을 제거하고 남은 powder에 증류수 10 ml을 가하여 60℃ 온탕기에 2시간 동안 둔 후 추출물 1 ml을 취하였다.
성숙 종자에서 KTI 단백질이 없는 F₂ 개체를 수확 한 후 random으로 종자를 골라 stachyose의 함량을 HPLC 방법으로 측정하였다. 선발된 종자들의 종피를 제거한 후 미세하게 분말로 갈아서 각 시료 당 수분을 동일하게 제거한 후 500mg을 취하여 acetone 10 ml를 가하여 약 2시간 동안 열을 가하면서 지방을 제거하였다.
계통을 2017년 5월에 26일 포장에 파종하여 농업적 형질을 평가하였다. 수확기, 경장, 100립중, 종피색 및 제색을 관찰하였다. 조사된 양적형질 및 stachyose 함량에 대한 data는 SAS 프로그램을 이용하여 분산분석과 덩컨의 다중검증을 실시하였다
온실에 두 모본을 파종하여 “Jinyangkong x 15G1의 조합으로 교배를 통하여 F1 종자를 얻었다.
각각의 F₂ 개체를 수확한 후 random으로 종자를 골라 stachyose의 성분 함량을 측정하였다. 저함량 계통을 선발하여 포장에서 F₃ 계통으로 전개시켜 초형, 성숙기, 종자상태등 농업적 형질을 점검하여 양호한 계통을 선발하여 포장에서 F₄ 계통으로 유지시켜 농업적 형질을 점검하였다. 교배부터 선발까지의 단계는 Fig.
각각의 F₂ 종자로부터 배를 제외한 성숙 자엽을 절취하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질 시료의 농도를 정량한 후 12% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 하였다. Gel에서 분리된 단백질을 PVDF membrane에 옮긴 후 2시간 동안 blocking buffer (20 mM Tris (pH 7.
콩의 품질, 가공 적성 및 기능성을 저하시키는 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질이 없으면서 stachyose의 함량이 낮은 rs2rs2titi 유전자형을 가진 계통을 선발하기 위하여 2개의 모본을 이용하여 육종집단을 만들었다. 이용된 2개의 모본에 대한 형질은 Table 1과 같다.

대상 데이터

2). KTI 단백질이 부재한 종자를 계통으로 전개하면서 stachyose의 함량이 낮은 rs2rs2titi 유전자형을 가진 4개의 계통을 선발하였다. 선발된 F₄ plant 계통에 대한 포장으로부터 얻어진 농업적 형질은 Table 2와 같다.
Reflective index detector (RID) 검출기를 사용했으며 stachyose의 각 standard를 10, 8, 6, 4, 2, 0 mg/ml로 calibration 후 각각의 sample 당 stachyose 의 함량 분석을 실시하였다. Rs2Rs2 유전자형을 가진 장려품종들의 stachyose 함량 비교를 위해 태광콩, 대양콩, 풍산나물콩, 진품콩2호, 미소를 이용하였다.
성숙 종자에서 KTI 단백질이 없으며 stachyose의 함량이 낮은 rs2rs2titi 유전자형을 가진 F₄ 계통을 2017년 5월에 26일 포장에 파종하여 농업적 형질을 평가하였다. 수확기, 경장, 100립중, 종피색 및 제색을 관찰하였다.
콩의 품질 및 기능성을 저하시키는 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질이 없으며 stachyose의 함량이 낮은 rs2rs2titi 유전자형을 선발하기 위하여 얻어진 F₂ 개개의 종자를 이용하여 KTI 단백질이 부재한 종자를 선발하였다(Fig. 2). KTI 단백질이 부재한 종자를 계통으로 전개하면서 stachyose의 함량이 낮은 rs2rs2titi 유전자형을 가진 4개의 계통을 선발하였다.

데이터처리

1Means with the same letters are not significantly different at 5% significant level by Duncan’s multiple range test.
수확기, 경장, 100립중, 종피색 및 제색을 관찰하였다. 조사된 양적형질 및 stachyose 함량에 대한 data는 SAS 프로그램을 이용하여 분산분석과 덩컨의 다중검증을 실시하였다

이론/모형

KTI 단백질의 유무는 SDS-PAGE 및 Western blot 방법을 이용하였다. 각각의 F₂ 종자로부터 배를 제외한 성숙 자엽을 절취하여 단백질을 추출하였다.

성능/효과

P1은 Jinyangkong 모본으로 성숙 콩 종실에서 KTI 단백질이 있는 TiTi 유전자형이며 P2는 15G1 모본으로 KTI 단백질이 없는 titi 유전자형(Table 1)이고, 선발된 4개의 계통은 모두 P2 모본과 같이 KTI 단백질이 없는 titi 유전자형이었다. KTI 단백질의 부재는 single 유전자에 의해 지배되므로 F₂ seed에서 KTI 단백질이 없는 titi 유전자형 종자가 선발되어 고정된 상태임을 나타내었다[14].
대조품종으로 이용된 RS2RS2 유전자형을 가진 품종들의 stachyose 함량은 13.02~16.81 g/kg으로 선발계통의 3.09~3.50 g/kg보다 매우 높았다. 2개의 선발계통(603-1, 603-2)에 대한 stachyose의 함량은 3.
09 g/kg로 나타났다. 이로써 선발계통의 stachyose 함량은 장려품종보다 매우 낮았으며 유전적으로 고정된 rs2rs2 유전자형임을 나타내었다. 따라서, 본 연구를 통하여 육성된 4개의 계통은 콩 종실에서 품질, 기능성 및 가공 적성을 저하시키는 KTI 단백질이 없으면서 난소화성 올리고당인 Stachyose 함량이 낮은 rs2rs2titi 노란 콩 육종을 위한 중간모본으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

후속연구

이로써 선발계통의 stachyose 함량은 장려품종보다 매우 낮았으며 유전적으로 고정된 rs2rs2 유전자형임을 나타내었다. 따라서, 본 연구를 통하여 육성된 4개의 계통은 콩 종실에서 품질, 기능성 및 가공 적성을 저하시키는 KTI 단백질이 없으면서 난소화성 올리고당인 Stachyose 함량이 낮은 rs2rs2titi 노란 콩 육종을 위한 중간모본으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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