[논문]TRIzol을 이용한 노로바이러스 RNA 추출의 pH 의존성

전덕영

doi:10.13103/jfhs.2018.33.1.71

TRIzol을 이용한 노로바이러스 RNA 추출의 pH 의존성
pH-Dependence of RNA Extraction for Norovirus by TRIzol Method 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.33 no.1, 2018년, pp.71 - 76

전덕영 (전남대학교 식품영양과학부)

초록
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노로바이러스는 전 세계적으로 산발적인 발병 관련 비세균성 위장염의 주요 원인 물질이다. 노로바이러스 검출을 위해 역전사 실시간 PCR (RT qPCR)이 그 민감도와 특이성으로 인해 주요 수단으로 빠르게 자리 잡았다. 그러나 RT qPCR 분석을 위해서는 정확한 바이러스 RNA 추출방법이 필수적이다. TRIzol 시약은 생물학적 물질로부터 RNA의 추출에 이용되고 따라서 노로바이러스 RNA 추출에도 널리 사용된다. 이 연구에서는 인체 노로바이러스 유전체 그룹 I (GI) 및 유전자 그룹 II (GII)와 생쥐 노로바이러스(GV) 중에서 GII로부터의 TRIzol 을 이용한 바이러스 RNA의 추출률이 바이러스 시료 용액의 pH에 의존했다는 내용이 다루어졌다. 실시간 PCR의 Ct값으로 비교한 RNA 추출 수율은 산성 영역보다 알칼리성 pH에서 높았다. 이 연구 결과로 부터 TRIzol을 이용하여 GII RNA를 추출하여 노로바이러스를 정량적으로 분석할 때 pH조건이 대단히 중요하다는 것을 알 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Norovirus is a leading cause of sporadic pathogenic non-bacterial gastroenteritis worldwide. For the detection of norovirus, reverse transcription real-time PCR (RT qPCR) has quickly become a major tool due to its sensitivity and specificity. However, accurate viral RNA extraction methods are essential for RT qPCR analysis. TRIzol reagents are used to extract RNA from biological materials and are therefore widely used for norovirus RNA extraction. In this study, the yield of viral RNA extraction using TRIzol from genogroup II (GII) among the human norovirus genogroup I (GI) and GII, and murine norovirus (GV) depended on the pH of the virus sample solution. The yield of RNA extraction was higher at the alkaline pH than in the acidic region compared with the Ct (threshold cycle) value of the real-time PCR. From the results of this study, it was found that the pH condition is very important for the quantitative analysis of norovirus by extracting GII RNA using TRIzol.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

노로바이러스의 유전자군인 GI, GII, 그리고 GV중에서 GII만이 pH증가에 따라 RNA의 추출이 크게 증가하는 것을 이들의 캡시드 단백질의 물리화학적 특성으로부터 찾고자 하였다. 이들 세 바이러스 스트레인의 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 분석하여 그 특성을 Table 2에 나타냈다.
본 연구에서는 TRIzol을 사용하여 노로바이러스 RNA를 추출할 때 유전자군의 종류에 따라 RNA추출률이 바이러스 용액의 pH에 대하여 영향을 받는 것을 확인하였다. 즉, 노로바이러스 GI, GII, GV중에서 GII군만 그 RNA 추출률이 pH에 크게 의존함을 알수 있었기에 이를 보고하고자 한다.

가설 설정

4)The aliphatic index of a protein is defined as the relative volume occupied by aliphatic side chains (alanine, valine, isoleucine, and leu-cine). It may be regarded as a positive factor for the increase of thermostability of globular proteins.

제안 방법

RT qPCR은 시료 바이러스 RNA 추출물, 유전자 특이적 프라이머(Table 1)23,24), 그리고 OneStep RT-PCR 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 혼합하여 SmartCycler® 시스템(Cepheid, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.
TRIzol 방법을 사용하여 노로바이러스-GI, GII, 및 GV의 RNA를 추출한 후 그 양을 qPCR로 측정하였으며 그결과를 Fig. 1에 나타내었다. RNA 추출용 노로바이러스 시료로부터 그 pH만을 서로 달리한 후에 RNA를 추출하였으므로 이 결과는 pH가 RNA의 추출에 미치는 영향을 나타낸다.
바이러스 RNA 추출을 위해서 시료를 물 또는 서로 다른 pH의 50 mM 완충액(50 mM 시트르산(pH 3, 4, 5, 6), 인산염(pH 7, 8) 및 글리신-NaOH (pH 9, 10))으로 20배 희석 하였다. 희석된 샘플 0.
총 반응액의 부피는 25 µL로써 2.5 µL의 RNA 주형, 1.0 µL의 효소, 5.0 µL의 5x Tris 완충액, 0.25 µL의 RNAsin RNase 억제제(N211A; Promega, Madison, WI, USA), 400 nM dNTP 믹스, 200 nM 각 프라이머 세트, 150 nM 프로브 JJV1P (GI 용) 및 150 nM 프로브 RING2P (GII 용) 및 200 nM 프로브 G54808 (GV 용)를 함유하였다.

대상 데이터

2)에 20%가 되게 현탁된 것이었다. 생쥐 노로바이러스 GV는 생쥐의 대식 세포주 RAW 264.7에서 바이러스의 감염에 의해 얻어진 것을 사용하였다²²⁾. 모든 바이러스 현탁액은 사용하기 전까지 −80^°C에서 보관하였다.
pH 3 에서는 Ct값이 30이었으나 pH 8~10의 범위에서는 27까지 단축되어 RNA양이 최대량이 되었다. 이 실험에서 사용된 RNA는 인간노로바이러스(HuNov)인 GI.1과 GII.2, 그리고 생쥐 노로바이러스인 GV였으며, 물 또는 서로 다른 pH의 50 mM 완충액으로 희석된 상태였다. 바이러스 RNA는 일반적으로 PBS나 글리신-NaOH 완충액과 같은 알칼리 완충액을 사용하여 조직 또는 식품 샘플에서 분리된다.
알칼리성 완충액은 바이러스의 추출을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이 실험에서는 GI 또는 GII 추출을 위해 대변 샘플이 사용되었고 GV 추출을 위해서는 배양된 세포가 사용되었다. Fig.
인간 노로바이러스 GI, GII 및 생쥐 노로바이러스 GV에 대한 서열은 Genbank에서 입수하였다. accession 번호는 GI의 경우 CAK22261, GII의 경우 ABD73936, GV의경우 ABI95835였다.

데이터처리

캡시드 단백질의 1차구조는 EXPASY PROTPARAM을 이용하여 분석되었고 계통 발생 나무 (phylogenetic tree)는 프로그램 Mega4 (http://www.expasy. org/tools/protparam.html, http://www.megasoftware.net/)를 사용하여 얻었다.

성능/효과

1)S, P1, and P2-domain of capsid proteins are segments of peptide 1~224, 225~278 and 406~520, and 279~405, respectively. The num-bering is based on norovirus GI.
3) A protein whose instability index is lower than 40 is predicted as stable, a value above 40 predicts that the protein may be unstable.
GRAVY 값 또한 GII가 GI과 GV와는 다른 특성을 갖고 있었다. 따라서 이러한 캡시드 단백질이 노로바이러스의 껍질을 구성할 때 그 내부와 외부를 차지하는 S-도매인과 P2-도매인의 물리화학적인 성질에 있어서 GI과 GV가 서로 유사하며 이는 GII와 차이가 있음을 보여주었다. 이러한 특성의 차이가 pH에 따른 RNA의 추출률의 차이에 관련될 수 있을 것이다.
본 연구에서는 TRIzol을 사용하여 노로바이러스 RNA를 추출할 때 유전자군의 종류에 따라 RNA추출률이 바이러스 용액의 pH에 대하여 영향을 받는 것을 확인하였다. 즉, 노로바이러스 GI, GII, GV중에서 GII군만 그 RNA 추출률이 pH에 크게 의존함을 알수 있었기에 이를 보고하고자 한다.
S-도매인은 핵산이 인접하고 있는 캡시드 내부 구조이다. 즉, RNA와 가장 가까운 단백질 1차구조에 있어서 GI과 GV는 상대적으로 유사하며 GII는 계통 발생학적으로 먼거리에 있음을 알수 있었다. Table 2 및 Fig.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	노로바이러스란?	노로바이러스는 단일 가닥(+)의 RNA로서, 전세계적으로 급성 장염을 주증상으로 하는 식중독 발생에 있어서 가장 중요한 원인물질중 하나이다1). 노로바이러스의 종류는 현재 7개의 유전자군(G, genogroup)으로 나뉘며 이중에서 사람에게 발병하는 인체 노로바이러스(HuNov)는 GI, GII, GIV형이다2).
	TRIzol을 이용한 노로바이러스의 GII RNA 추출 시, 추출 수율이 높은 pH는?	이 연구에서는 인체 노로바이러스 유전체 그룹 I (GI) 및 유전자 그룹 II (GII)와 생쥐 노로바이러스(GV) 중에서 GII로부터의 TRIzol 을 이용한 바이러스 RNA의 추출률이 바이러스 시료 용액의 pH에 의존했다는 내용이 다루어졌다. 실시간 PCR의 Ct값으로 비교한 RNA 추출 수율은 산성 영역보다 알칼리성 pH에서 높았다. 이 연구 결과로 부터 TRIzol을 이용하여 GII RNA를 추출하여 노로바이러스를 정량적으로 분석할 때 pH조건이 대단히 중요하다는 것을 알 수 있었다.
	사람에게 발병하는 인체 노로바이러스의 종류는?	노로바이러스는 단일 가닥(+)의 RNA로서, 전세계적으로 급성 장염을 주증상으로 하는 식중독 발생에 있어서 가장 중요한 원인물질중 하나이다1). 노로바이러스의 종류는 현재 7개의 유전자군(G, genogroup)으로 나뉘며 이중에서 사람에게 발병하는 인체 노로바이러스(HuNov)는 GI, GII, GIV형이다2). 특히 노로바이러스 GII는 이 유전자군에 속한 유전자형(genotype)이 22개로 알려져 다른 군에 비하여 가장 많고 노로바이러스 중 전세계적으로 가장 많은 식중독 발병률을 나타내고 있다2).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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