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문제 정의
- 하지만 모든 연구에서 공통적으로 지방전구세포에서 지방세포로 분화되는 정도의 억제효과에 대해서 연구가 이루어져 있으며, 분화가 완료된 지방세포의 지방분해 효과에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 지방축적 억제와 지방분해 효과를 동시에 갖는 약재를 탐색하고, 그 효과를 피부도포 투여방법에 의해 비만 개선 효과를 검증하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 미숙과 복분자와 녹차씨 추출물을 포함한 다양한 한약 추출물의 항비만 효과를 3T3-L1 cell line을 이용하여 지방축적 억제와 지방분해 효과를 동시에 갖는 한약재를 스크리닝하여 효과가 우수한 한약재를 선별하고, 선별된 한약재를 고지방식이로 유도된 비만 동물모델을 이용하여 추출물을 피부에 직접 도포함으로서 비만 개선 효과의 기능성 검증을 수행하고자 하였다. 또한 피부흡수도 및 피부자극에 미치는 영향을 확인하여, 기능성과 안전성에 대한 전반적인 과학적인 검증을 수행하고자 하였다.
- 본 연구에서는 선행연구에서 발굴한 항비만 소재인 녹차씨, 미숙과 복분자 및 매실을 비롯하여 다양한 천연물을 대상으로 항비만효과를 스크리닝하고 선별된 약재들의 혼합 복합물을 비만이 유도된 실험동물의 피부에 도포처리를 통한 항비만 효과 활성 연구를 진행하였다. 본 연구에서 선별한 천연물들 중 녹차씨 40% 주정추출물은 지방전구세포의 분화를 억제함으로서 비만이 억제됨을 보고하였었고12), 미숙과 복분자 5% 주정추출물 또한 지방전구세포의 분화를 억제하고13) 비만동물모델에서 항비만 효과가 있음을14) 보고하였었다.
- 본 연구에서는 이러한 세포 수준에서의 연구를 통해 지방세포분화 억제효과와 지방분해 촉진효과가 있는 추출물을 조합하여 두 가지 효과가 동시에 있는 복합물을 제조하여 실험동물에서도 효과가 나타나는지를 증명하기 위해 고지방식이 유도 비만 마우스모델을 이용하여 추출물을 혼합하여 피부도포 방법으로 투여하고 체중증가량, 식이섭취량, 지방무게 및 혈중 바이오마커에 미치는 영향을 조사하였다.
- 본 연구에서는 항비만에 도움이 되는 천연 소재들을 in vitro상에서 선별하고 그 효과를 확인하였으며, 최적 배합조건을 확립하여 in vivo 상에서 그 효과를 검토하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 추출물들의 anti-adipogenesis 및 lipolysis에 효과가 있는 것을 확인하였으며, 이러한 추출물과 피부흡수에 도움이 되는 천연 추출 오일을 다양한 비율로 배합하여 고지방식이로 유도한 비만실험동물에 지속적으로 피부도포를 통하여, 체중, 조직무게, 혈액 내 TG, TCHO 등의 변화에 미치는 영향을 관찰하여 항비만 효과검증과 최적 배합조건을 검증하였다.
- 또한 체지방이 과도하게 축적되면 지방세포의 수와 크기가 증가하며, 인슐린 저항성, 당뇨병, 고혈압 등 각종 질환의 발병률을 증가시키며31) 지방조직은 체내 지질대사에서 중요한 역할을 한다32). 본 연구에서는 혼합물의 피부도포를 통한 체중 감소 효과가 지방세포의 감소에 영향을 주어 나타난 결과임을 확인하기 위하여 간과 부고환지방의 무게를 측정하였다. 그 결과 간 무게는 정상군인 NFD (2.
- 05) 감소하여, Test 1 조성이 항비만 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 이러한 실험결과를 바탕으로 혼합물에 포함된 오일의 유무에 따라 항비만 효과의 차이가 피부흡수에 따른 영향일 것이라는 판단 하에 피부 흡수에 미치는 영향을 확인하였다.
- )는 미숙과 상태의 추출물에서 항비만13,14) 및 항콜레스테롤15) 효과가 우수함을 보고하였다. 이에 본 연구에서는 미숙과 복분자와 녹차씨 추출물을 포함한 다양한 한약 추출물의 항비만 효과를 3T3-L1 cell line을 이용하여 지방축적 억제와 지방분해 효과를 동시에 갖는 한약재를 스크리닝하여 효과가 우수한 한약재를 선별하고, 선별된 한약재를 고지방식이로 유도된 비만 동물모델을 이용하여 추출물을 피부에 직접 도포함으로서 비만 개선 효과의 기능성 검증을 수행하고자 하였다. 또한 피부흡수도 및 피부자극에 미치는 영향을 확인하여, 기능성과 안전성에 대한 전반적인 과학적인 검증을 수행하고자 하였다.
제안 방법
- 2일후 배지를 교환하고 4일째에 세포가 post-confluent하게 되면 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA)가 첨가된 DMEM 배양액에 0.5 mM3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma, USA), 1 μM dexamethasone (Sigma, USA), 10 μg/㎖ insulin (Sigma, USA)이 처리하여 분화를 유도하였다.
- 본 연구에서는 항비만에 도움이 되는 천연 소재들을 in vitro상에서 선별하고 그 효과를 확인하였으며, 최적 배합조건을 확립하여 in vivo 상에서 그 효과를 검토하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 추출물들의 anti-adipogenesis 및 lipolysis에 효과가 있는 것을 확인하였으며, 이러한 추출물과 피부흡수에 도움이 되는 천연 추출 오일을 다양한 비율로 배합하여 고지방식이로 유도한 비만실험동물에 지속적으로 피부도포를 통하여, 체중, 조직무게, 혈액 내 TG, TCHO 등의 변화에 미치는 영향을 관찰하여 항비만 효과검증과 최적 배합조건을 검증하였다. 또한, 피부에 도포를 통한 피부 흡수의 극대화 확립을 위한 오일 성분 유무에 따른 피부흡수도 검증 및 피부자극에 대한 안정성을 확인하였다.
- 500 ㎕ 시료를 2.5 × 2.5 cm2 넓이의 gauze에 적용하여 24h 동안 부착한 후 제거하여 1일 1회씩 72 h동안 몸무게, 사망률, 피부색 및 홍반, 가피, 부종형성 정도를 관찰하였다.
- 즉 일반사료 급여대조군 (Normal fat diet, NFD), 고지방사료 급여대조군 (High fat diet, HFD), 복합조성물 처리군 (HFD+Test1-5)으로 구분하였다. 84일째부터 고지방사료를 섭취하여 비만이 유도된 실험동물을 무작위로 5개 군으로 분리하고 매일 1회씩 복부에 250 ㎕ 시험물질을 도포하여 실험을 실시하였다. 총 실험기간은 142일이며, 사료와 음수는 임의 (ad libitum)로 제공하였으며, 체중과 식이섭취량은 일주일에 2회씩 측정하였다.
- 22 μm syringe filter를 이용하여 여과하였다. EVOM2 (World Precision Instruments, USA)를 이용하여 전기 저항도를 측정하여 피부 투과도 차이를 확인하였다.
- Test1과 Test 3을 500 ㎕씩 취하여 1.77 cm2 면적의 피부 표면에 syringe를 이용하여 골고루 도포한 후, 1, 2, 4, 7, 10, 24 h에 receptor phase를 취하여, 0.22 μm syringe filter를 이용하여 여과하였다.
- 분화유도 2일 후, 10 μg/㎖의 insulin 10% FBS가 포함된 DMEM으로 교환하였고, 분화유도 4일째부터는 10% FBS가 포함된 DMEM으로 배양액을 교환하여 8일간 지방세포 분화를 유도하였다. 각 추출물 시료가 지방 분화를 억제하는 anti-adipogenesis 효과를 확인하기 위해 분화시작일과 2, 4, 6일째 되던 날에 시료를 각각 농도별로 처리하였고, 지방세포의 지방분해효과를 확인하기 위한 lipolysis 효과 확인을 위해 지방분화가 완료된 후 시료를 각각 농도별로 처리하였다. 양성대조군으로 Orlistat (Sigma, USA)를 각각 농도별로 처리 시료와 같은 조건으로 처리하였다.
- 피부흡수가 증가되어 효과가 증가되는 장점이 있지만 반대로 피부에 대한 자극도 증가될 우려 또한 높아진다. 따라서 마지막으로 본 연구에서는 오일 성분을 함유시켜 피부흡수가 증진된 항비만효과가 있는 Test 1 혼합물을 대상으로 피부에 대한 자극 시험을 실시하였다. 토끼의 피부에 Test 1 혼합물을 도포 후 홍반, 가피 및 부종형성 정도를 관칠하여 피부자극반응을 평가 한 결과 1차 피부자극지수 (PII)는 0.
- 따라서 본 실험에서는 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 농도 범위인 10~30 μg/㎖ 범위에서 지방세포로 분화억제 (anti-adipogenesis) 효과 및 분화된 지방세포의 지방분해(lipolysis) 효과 검증 실험을 진행하였다.
- 모든 실험동물은 온도 (22 ± 2℃), 상대습도 (50 ±5%), 환기횟수 (10~15 회/시간), 조명주기 (lights on from 8:00 AM~8:00 PM), 조도 (150~300 Lux)의 환경으로 설정된 동물사육실에서 사육하였다.
- 본 연구에 사용할 각 추출물이 3T3-L1 지방전구세포에 미치는 세포독성 영향을 알아보기 위해 3T3-L1세포에 10~100 μg/㎖ 농도를 각각 처리하고 MTT 시험을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
- 항비만 연구에 많이 이용되는 분화전 상태의 3T3-L1 지방전구세포는 분화과정을 거쳐 둥근 모양 구조의 지방세포로 성숙된다. 본 연구에서 사용한 Oil Red O 염색시약은 중성지질, 콜레스테롤만을 염색하고 세포 내 축적된 지방구의 중성지방을 염색하여 세포의 붉은색 정도를 통해 분화 정도를 확인할 수 있어26), 이를 이용하여3T3-L1 세포 분화과정에서 각추출물이 지방구 생성에 미치는 영향을 확인하였다. 본 연구에서 3T3-L1 세포를 통해 각 조건별로 추출한 추출물을 첨가하여 지방축적의 정도를 확인한 결과 농도별로(10, 20, 30 μg/㎖) 처리 하였을 때 모든 추출물에서 유의적으로 지방구 형성을 억제하는 것을 볼 수 있었다.
- 분화유도 2일 후, 10 μg/㎖의 insulin 10% FBS가 포함된 DMEM으로 교환하였고, 분화유도 4일째부터는 10% FBS가 포함된 DMEM으로 배양액을 교환하여 8일간 지방세포 분화를 유도하였다.
- 실험기간 동안, 시험물질을 피부에 도포한 모든 동물에서 일반증상을 관찰한 결과 사망 또는 이상증상은 나타나지 않았으며, 체중 또한 일정하게 증가하는 것을 관찰하였다(Table 6). 시험물질과 대조물질을 도포한 후 24, 48, 72시간째에 투여부위를 관찰하여 홍반, 가피 및 부종형성 정도를 관찰하여 피부자극반응을 평가 하였다. Draize의 평가방법에 따른 판정 결과 1차 피부자극지수 (PII)는 0.
- 시험물질로 Test 1 (T)을, 대조물질은 멸균증류수 (C)를 이용하였다. 실험동물 당 도포구획과 대조구획을 각각 찰과 부위 (우측)와 비찰과 부위 (좌측)로 구분하였으며, 찰과부위는 표피만 손상되고 진피는 손상되지 않는 정도의 찰과상을 입혔다. 500 ㎕ 시료를 2.
- 각 추출물 시료가 지방 분화를 억제하는 anti-adipogenesis 효과를 확인하기 위해 분화시작일과 2, 4, 6일째 되던 날에 시료를 각각 농도별로 처리하였고, 지방세포의 지방분해효과를 확인하기 위한 lipolysis 효과 확인을 위해 지방분화가 완료된 후 시료를 각각 농도별로 처리하였다. 양성대조군으로 Orlistat (Sigma, USA)를 각각 농도별로 처리 시료와 같은 조건으로 처리하였다.
- 연구용 돼지피부 조직 (메디키네틱스, Korea)의 각질층 부분이 위로 향하도록 하여 피부투과도 평가 시스템 장비에 고정한 후 12㎖의 50% 에탄올을 receptor chamber에 넣고 온도를 32 ± 1℃로 유지하였으며, 24 h동안 일정하게 교반하였다 (600 rpm).
- 증류수로 3회 세척 후 각 well에 Oil Red O working solution을 1 ㎖씩 넣고 실온에서 30분 동안 염색한 후 증류수로 3회 반복하여 씻어내었다. 염색이 된 지방구는 사진으로 기록하였고, 100% isopropanol을 가하여 세포 내에 축적된 lipid를 용출하여 96 well plate에 옮긴 후 500 nm에서 흡광도를 측정하여 lipid accumulation 정도를 평가하였다.
- 실험동물은 군당 5마리씩 총 7개 군으로 구분하였다. 즉 일반사료 급여대조군 (Normal fat diet, NFD), 고지방사료 급여대조군 (High fat diet, HFD), 복합조성물 처리군 (HFD+Test1-5)으로 구분하였다. 84일째부터 고지방사료를 섭취하여 비만이 유도된 실험동물을 무작위로 5개 군으로 분리하고 매일 1회씩 복부에 250 ㎕ 시험물질을 도포하여 실험을 실시하였다.
- 지방식이 섭취를 통해 비만이 유도되어 체중이 유의적으로 증가 (p<0.01)된 후 추출 복합물을 58일간 복부 피부에 매일 도포 후 체중증가량과 식이효율을 측정하였고 그 결과는 Fig. 4와 같다.
- 84일째부터 고지방사료를 섭취하여 비만이 유도된 실험동물을 무작위로 5개 군으로 분리하고 매일 1회씩 복부에 250 ㎕ 시험물질을 도포하여 실험을 실시하였다. 총 실험기간은 142일이며, 사료와 음수는 임의 (ad libitum)로 제공하였으며, 체중과 식이섭취량은 일주일에 2회씩 측정하였다. 동물실험과 관련된 모든 과정은 ㈜비엔텍 동물실험윤리위원회의 원칙을 준수 (승인번호 201700102)하고 윤리적인 측면을 고려하여 수행하였다.
- 촬영 후 안와정맥채혈을 통해 공복혈액을 채취하고 혈액은 3000 × g (4℃)에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리 후 분석 전까지 -80℃에서 보관하였으며 채혈 직후 개복하여 부고환지방, 복분지방, 갈색지방 및 간을 적출하여 0.9% NaCl 용액으로 혈액 및 기타 물질을 제거하고 수분을 제거한 후 각 장기의 중량을 측정하였다.
- 투여가 끝난 실험동물은 희생 전 12시간 동안 절식 시킨 후 마취하여 사진 촬영하여 Son 등16)의 방법을 참고로 각 군별 체형변화를 면적을 구하여 비교하였다. 촬영 후 안와정맥채혈을 통해 공복혈액을 채취하고 혈액은 3000 × g (4℃)에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리 후 분석 전까지 -80℃에서 보관하였으며 채혈 직후 개복하여 부고환지방, 복분지방, 갈색지방 및 간을 적출하여 0.
- 피부도포를 통한 추출혼합물의 항비만 효과를 조사하기 위하여 고지방식이를 섭취한 HR-1 비만동물모델에 58일간 피부도포 후 체중증가량 및 식이섭취량을 확인하였다. 그 결과 피부도포 직후에는 체중변화가 그룹 간 유의성은 없었으나 실험 종료 시 최종 체중 변화량은 정상군인 NFD군 (2.
- 9% NaCl 용액으로 혈액 및 기타 물질을 제거하고 수분을 제거한 후 각 장기의 중량을 측정하였다. 혈중지질 성분의 주요 지표가 되는 대사산물로 중성지방 (triglyceride, TG), 총 콜레스테롤(total cholesterol, TCHO) 함량을 자동혈액분석기 (DRI-CHEMNX500i, FUGIFILM, Japan)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 3T3-L1 지방전구세포는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에서 구입하였고, 세포 배양액으로는 Dubcecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, USA)에 10% Bovine serum (BS, Gibco, USA)과 1% penicillin-streptomycin (P/S, Gibco, USA)을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.
- Oil Red O stock solution은 0.35 g Oil Red O 시약 (Sigma, USA)을 100 ㎖의 isopropanol에 녹여 filter 후 실험에 사용하였다. 분화시작일로부터 8일째 되던 날 배지를 제거 후 phosphate-buffered saline (PBS)으로 씻어낸 후 10% formaldehyde로 1시간 동안 고정하였다.
- 전남 화순군에서 재배되고 편백나무(Chamaecyparis obtusa, 扁柏) 잎과 인진쑥 (Artemisia capillaris, 茵蔯蒿)은 ㈜화순불미나리에서, 녹차씨는 전남 순천시에서 재배되고 있는 재래종 녹차씨를 ㈜명인신광수차로부터 공급받아 사용하였다. 사용한 모든 약재는 2016년 재배한 것만 구입하였다. 총 14종의 한약재를 Table 1과 같은 조건으로 추출 및 동결 건조하여 15가지의 시료를 제조하여 사용하였다.
- 5 cm2 넓이의 도포구획 2개소와 대조구획 2개소로 구분 및 표시하였다. 시험물질로 Test 1 (T)을, 대조물질은 멸균증류수 (C)를 이용하였다. 실험동물 당 도포구획과 대조구획을 각각 찰과 부위 (우측)와 비찰과 부위 (좌측)로 구분하였으며, 찰과부위는 표피만 손상되고 진피는 손상되지 않는 정도의 찰과상을 입혔다.
- 일반식이는 Research Diets사 (10% kcal from fat, D12450B Research diets, USA), 고지방 식이는 Research Diets사 (60% kcal from fat, D12492 Research Diets, USA)에서 구입하였고, 그 조성은 Table 3과 같다. 실험동물은 군당 5마리씩 총 7개 군으로 구분하였다. 즉 일반사료 급여대조군 (Normal fat diet, NFD), 고지방사료 급여대조군 (High fat diet, HFD), 복합조성물 처리군 (HFD+Test1-5)으로 구분하였다.
- 실험동물은 체중 25~27 g의 5주령 수컷 albino hairless mouse (Skh, HR-1)를 ㈜샘타코바이오코리아 (Osan, Korea)에서 구입하여 6일 동안 순화 후 이상이 없는 개체를 선별하여 실험을 진행하였다. 모든 실험동물은 온도 (22 ± 2℃), 상대습도 (50 ±5%), 환기횟수 (10~15 회/시간), 조명주기 (lights on from 8:00 AM~8:00 PM), 조도 (150~300 Lux)의 환경으로 설정된 동물사육실에서 사육하였다.
- 실험에 사용한 진피 (Citrus unshiu M. peel, 陳皮, 국내산), 맥문동 (Liriope platyphylla, 麥門冬, 국내산), 지황 (Rehmanniaglutinosa, 地黃, 국내산), 비타민나무(Hippophae rhamnoides,沙棘, 국내산)열매, 미숙과 매실 (unripe Prunus mume, 烏梅, 국내산), 홍경천 (Rhodiola rosea, 紅景天, 중국산), 미숙과 복분자(unripe Rubus occidentalis, 覆盆子, 국내산), 둥굴레(Polygonatum odoratum, 黃精, 국내산), 상백피 (Mori cortex, 桑白皮, 중국산), 마테 (Ilex paraguayensis, 중국산) 및 로즈마리(Rosmarinus officinalis, 迷迭香, 국내산)는 서울 경동한약재시장에서 구입하였다. 전남 화순군에서 재배되고 편백나무(Chamaecyparis obtusa, 扁柏) 잎과 인진쑥 (Artemisia capillaris, 茵蔯蒿)은 ㈜화순불미나리에서, 녹차씨는 전남 순천시에서 재배되고 있는 재래종 녹차씨를 ㈜명인신광수차로부터 공급받아 사용하였다.
- 모든 실험동물은 온도 (22 ± 2℃), 상대습도 (50 ±5%), 환기횟수 (10~15 회/시간), 조명주기 (lights on from 8:00 AM~8:00 PM), 조도 (150~300 Lux)의 환경으로 설정된 동물사육실에서 사육하였다. 일반식이는 Research Diets사 (10% kcal from fat, D12450B Research diets, USA), 고지방 식이는 Research Diets사 (60% kcal from fat, D12492 Research Diets, USA)에서 구입하였고, 그 조성은 Table 3과 같다. 실험동물은 군당 5마리씩 총 7개 군으로 구분하였다.
- peel, 陳皮, 국내산), 맥문동 (Liriope platyphylla, 麥門冬, 국내산), 지황 (Rehmanniaglutinosa, 地黃, 국내산), 비타민나무(Hippophae rhamnoides,沙棘, 국내산)열매, 미숙과 매실 (unripe Prunus mume, 烏梅, 국내산), 홍경천 (Rhodiola rosea, 紅景天, 중국산), 미숙과 복분자(unripe Rubus occidentalis, 覆盆子, 국내산), 둥굴레(Polygonatum odoratum, 黃精, 국내산), 상백피 (Mori cortex, 桑白皮, 중국산), 마테 (Ilex paraguayensis, 중국산) 및 로즈마리(Rosmarinus officinalis, 迷迭香, 국내산)는 서울 경동한약재시장에서 구입하였다. 전남 화순군에서 재배되고 편백나무(Chamaecyparis obtusa, 扁柏) 잎과 인진쑥 (Artemisia capillaris, 茵蔯蒿)은 ㈜화순불미나리에서, 녹차씨는 전남 순천시에서 재배되고 있는 재래종 녹차씨를 ㈜명인신광수차로부터 공급받아 사용하였다. 사용한 모든 약재는 2016년 재배한 것만 구입하였다.
- 즉, 실험동물은 3 개월령의 수컷 Yac:NZW (KBL) rabbit (천안연암대학, Korea) 6마리를 이용하였으며, 동물 도포약 24 h전에 등 부위를 15 × 15 cm2의 크기로 제모한 후, 도포직전에 각각 2.5 × 2.5 cm2 넓이의 도포구획 2개소와 대조구획 2개소로 구분 및 표시하였다.
- 사용한 모든 약재는 2016년 재배한 것만 구입하였다. 총 14종의 한약재를 Table 1과 같은 조건으로 추출 및 동결 건조하여 15가지의 시료를 제조하여 사용하였다. 복합 한방추출물을 농도별로 혼합하고, 피부 도포용 제형 제조를 위하여 Table 2의 조건으로 비율별로 제조하여 in vivo 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복실험에 대한 평균값 (mean)과 평균의 표준오차 (standard deviation, S. D.) 또는 표준평균오차(standard error of measurement, S.E.M.)로 나타내었으며, 각 그룹간의 유의성 검증은 Graphpad PRISM 5 (Graph pad software, USA)를 이용하여 Student T-test 및 ANOVA법으로 검증하여 p값이 0.05 (p<0.05)미만인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 피부자극시험은 식품의약품안전처 고시 제2016-98호에 따라 시행하였다. 즉, 실험동물은 3 개월령의 수컷 Yac:NZW (KBL) rabbit (천안연암대학, Korea) 6마리를 이용하였으며, 동물 도포약 24 h전에 등 부위를 15 × 15 cm2의 크기로 제모한 후, 도포직전에 각각 2.
성능/효과
- 3(C)), HFD (5.50±0.19 cm2)에 비해 Test 1 도포군 (4.76±0.53 cm2)에서 유의적인 (p<0.05) 항비만 효과를 확인하였고, Test 1 도포군을 제외한 모든 도포군 에서는 HFD와 유의적 차이를 보이지 않았다.
- 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 지방세포로 분화를 유도한 후, 각 추출물을 농도별로 처리하여 지방분해효과를 확인한 결과(Fig. 1), 미숙과 복분자>둥글레>마테>녹차씨>진피>상백피>지황>맥문동>미숙과 매실>비타민나무 열매>홍경천의 순으로 효과를 확인하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 과정과 동시에 추출물을 처리하여 지방분화를 억제하는 효과를 확인한 결과 (Fig. 2), 마테>미숙과 매실>맥문동>미숙과 복분자>지황>둥글레>녹차씨> 홍경천>상백피>진피>비타민나무 열매의 순으로 그 효과를 확인하였다.
- 4(B)),Test 1군의 body weight gain (2.89±1.15 g)은 NFD군의 수준(2.89±0.88 g)으로 HFD군 (6.32±2.08 g)과 유의적인 차이(p<0.05)가 보이는 것을 확인하였다.
- 시험물질과 대조물질을 도포한 후 24, 48, 72시간째에 투여부위를 관찰하여 홍반, 가피 및 부종형성 정도를 관찰하여 피부자극반응을 평가 하였다. Draize의 평가방법에 따른 판정 결과 1차 피부자극지수 (PII)는 0.0으로 산출되어 비자극성을 확인하였다(Table 7, Fig. 6).
- HFD군의 부고환 지방 (epididymal fat)의 절대중량 (1.79±014 g) 및 상대중량 (3.81±0.23%)은 NFD군에 비해 유의적으로 (p<0.001) 증가하였으며, Test 1 처리군 (1.23±0.35 g)과 Test 2 처리군(1.31±0.27 g)에서 부고환지방의 무게가 유의하게 감소하였다(p<0.05).
- HFD군의 부고환 지방(epididymal fat)의 경우에도 절대중량 (1.79±014 g) 및 상대중량(3.81±0.23%)이 NFD군에 비해 유의적으로 (p<0.001) 증가하였으며, 간 무게와 같은 경향으로 Test 1 처리군 (1.23±0.35 g)과 Test 2 처리군 (1.31±0.27 g)에서 부고환지방의 무게가 유의하게 감소하였다 (p<0.05).
- TCHO 함량은 고지방 사료를 섭취한 HFD군 (147.25±11.39 mg/dl)에서 유의적인 증가 (p<0.01)가 관찰되었으며, 피부에 도포한 시험군 중 Test 1군에서만 그 수치(103.75±8.55 mg/dl)가 유의적으로 감소 (p<0.01)하는 것을 확인되었다.
- TG 함량의 변화는 NFD 군 (72.75±6.37 mg/dl)에 비해 HFD군 (123.5±13.19 mg/dl)에서 TG 함량이 유의적으로 증가 (p<0.01)하는 것을 확인 하였으며, Test 1 군에서만 HFD 군에 비하여 TG 함량 (86.00±14.10 mg/dl)이 유의한 수준으로 감소(p<0.05)하는 것을 확인하였다.
- 간 무게는 정상군인 NFD (2.42±0.11 g)보다 고지방식이군인 HFD (3.73±0.15 g)에서 유의한 증가 (p<0.01)를 보였으며 Test 1 처리군 (2.48±0.20 g)과 Test 2 처리군(3.04±0.43 g)에서 유의하게 감소하였다(p0.05).
- 고지방 식이를 통해 비만이 유도된 실험동물에 58일 동안 제조한 5종 (Test 1~Test 5)의 크림을 매일 실험동물의 복부에 도포하여 몸통부분의 너비 차이를 비교하여 항비만 효과를 확인한 결과(Fig. 3), 일반사료 투여군 (NFD) 대비 고지방사료 투여군 (HFD)의 몸통 너비가 122 %로 고지방 사료에 의해 유의적인 증가 (p<0.01)를 확인할 수 있었으며, 5종의 크림에 의한 체형 변화를 확인한 결과, Test 1 처리군에서 몸통 너비의 감소 (NFD 대비 107%)를 확인할 수 있었다.
- 고지방식이 섭취기간동안 모든 HFD 섭취군은 NFD 섭취 마우스에 비해 유의성 (p<0.01)있는 몸무게 증가를 보였으며, 피부 도포 Test 1군의 몸무게 증가 경향이 HFD 섭취군에 비해 유의적으로 감소 (p<0.05)하는 것을 확인하였다(Fig.
- 그 결과 간 무게는 정상군인 NFD (2.42±0.11 g)보다 고지방식이군인 HFD (3.73±0.15 g)에서 유의한 증가를 보였으며(p<0.01) Test 1 처리군 (2.48±0.20 g)과 Test 2 처리군(3.04±0.43 g)에서 유의하게 감소하였고 (p<0.05), 나머지 처리군에서는 유의적 차이가 관찰되지 않았다.
- 그 결과 피부도포 직후에는 체중변화가 그룹 간 유의성은 없었으나 실험 종료 시 최종 체중 변화량은 정상군인 NFD군 (2.89±0.88 g)보다 고지방식이군인 HFD군 (6.32±2.08 g)에서 유의적으로 증가하였고, HFD군에 비하여 Test 1군의 체중변화량은 2.89±1.15 g으로 유의성 있게 감소하였다 (p<0.05).
- 도포한 Test 1군과 Test 3군 모두 도포 후 1시간부터 유의적 차이를 보이면서 피부에 흡수되기 시작하였으나, 오일 성분이 포함되어 있는 Test 1군은 오일 성분이 포함되어 있지 않은 Test 3군에 비해 유의적으로 피부흡수가 24시간 동안 지속적으로 증가 (p<0.001)되는 것을 확인할 수 있다.
- 또한 30 μg/㎖ 농도로 처리한 마테 (52.86±1.72%), 미숙과 매실 (55.92±1.56%), 맥문동 (58.53±2.51%), 미숙과 복분자(58.98±3.05%)와 지황 (62.29±1.77%) 추출물은 대조군으로 사용한 orlistat 20 μM 농도의 효과 (62.79±2.32%)보다 지방분화 억제 효과가 높음을 확인하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 추출물들의 anti-adipogenesis 및 lipolysis에 효과가 있는 것을 확인하였으며, 이러한 추출물과 피부흡수에 도움이 되는 천연 추출 오일을 다양한 비율로 배합하여 고지방식이로 유도한 비만실험동물에 지속적으로 피부도포를 통하여, 체중, 조직무게, 혈액 내 TG, TCHO 등의 변화에 미치는 영향을 관찰하여 항비만 효과검증과 최적 배합조건을 검증하였다. 또한, 피부에 도포를 통한 피부 흡수의 극대화 확립을 위한 오일 성분 유무에 따른 피부흡수도 검증 및 피부자극에 대한 안정성을 확인하였다. 이러한 결과는 향후 항비만 의약품, 다이어트 및 슬리밍 화장품 원료 및 제품 개발을 위한 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 3T3-L1 세포를 통해 각 조건별로 추출한 추출물을 첨가하여 지방축적의 정도를 확인한 결과 농도별로(10, 20, 30 μg/㎖) 처리 하였을 때 모든 추출물에서 유의적으로 지방구 형성을 억제하는 것을 볼 수 있었다.
- 6에 나타내었다. 실험기간 동안, 시험물질을 피부에 도포한 모든 동물에서 일반증상을 관찰한 결과 사망 또는 이상증상은 나타나지 않았으며, 체중 또한 일정하게 증가하는 것을 관찰하였다(Table 6). 시험물질과 대조물질을 도포한 후 24, 48, 72시간째에 투여부위를 관찰하여 홍반, 가피 및 부종형성 정도를 관찰하여 피부자극반응을 평가 하였다.
- 이상의 결과로 보아 Test 1 혼합물의 피부도포를 통한 체중감소는 식이 섭취량에 관계없이 체내 지질대사에 작용 또는 지방 흡수를 저해하여 체중감소를 유도한 것으로 사료되며, 오일 성분만 제외한 Test 3군과 오일 성분만 처리한 Test 5군 모두 항비만 효과가 관찰되지는 않았다. 이러한 결과는 Test 1 혼합물에 포함되어 있는 오일 성분인 비타민나무 종자유, 편백나무 인진쑥 혼합 추출오일 및 로즈마리 추출 오일에 의해 항비만 효과가 있는 추출 혼합물의 피부흡수가 증가된 결과임을 짐작할 수 있게 하였다.
- 또한 hormone-sensitive lipase (HSL)와 adipose TG lipase (ATGL)는 지방분해를 위한 지질 대사 효소로 세포내부에 축적된 triacylglycerol (TAG)과 diacylglycerol (DAG)을 non-esterified fatty acid (NEFA)와 glycerol로 전환하는 작용을 한다28). 이러한 서로 다른 기전 때문에 본 연구에서 지방생성억제 효과가 우수한 추출물과 지방분해촉진이 우수한 추출물이 공통적으로 작용하지 않는 것으로 사료된다. 그러나 우리의 사전 연구결과에 따르면 미숙과 복분자 추출물의 경우에는 PPAR , C/EBP 뿐만 아니라 sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c), acetyl-CoA carboxylase (ACC)와 fatty acid synthase (FAS) 모두 감소시켜 지방생성억제 및 지방분해촉진 효과가 동시에 있음을 보고 하였으며14), 본 연구결과에서도 유사한 결과를 관찰 할 수 있었다.
- 식이 섭취량의 경우 모든 투여군에서 유의적인 차이는 없었다 (data not shown). 이상의 결과로 보아 Test 1 혼합물의 피부도포를 통한 체중감소는 식이 섭취량에 관계없이 체내 지질대사에 작용 또는 지방 흡수를 저해하여 체중감소를 유도한 것으로 사료되며, 오일 성분만 제외한 Test 3군과 오일 성분만 처리한 Test 5군 모두 항비만 효과가 관찰되지는 않았다. 이러한 결과는 Test 1 혼합물에 포함되어 있는 오일 성분인 비타민나무 종자유, 편백나무 인진쑥 혼합 추출오일 및 로즈마리 추출 오일에 의해 항비만 효과가 있는 추출 혼합물의 피부흡수가 증가된 결과임을 짐작할 수 있게 하였다.
- 중성지방 함량의 변화 또한 NFD군 (72.75±6.37 mg/dl)에 비해 HFD군 (123.5±13.19 mg/dl)에서 TG 함량이 유의적으로 증가 (p<0.01)하는 것을 확인 하었으며,Test 1 군에서만 HFD 군에 비하여 TG 함량 (86.00±14.10mg/dl)이 유의한 수준으로 감소 (p<0.05)하는 것을 확인하였으며, 혈중 총 콜레스테롤 (TCHO) 함량 또한 Test 1군에서만 그 수치(103.75±8.55 mg/dl)가 유의적으로 감소 (p<0.01)하는 것을 확인되었다.
- 지방분해 효과를 검증하기 위해 분화가 완료된 지방세포에 농도별로 (10, 20, 30 μg/㎖)처리 하였을 때 모든 추출물에서 유의적으로 형성된 지방을 분해 촉진하는 것을 볼 수 있었다.
- 따라서 마지막으로 본 연구에서는 오일 성분을 함유시켜 피부흡수가 증진된 항비만효과가 있는 Test 1 혼합물을 대상으로 피부에 대한 자극 시험을 실시하였다. 토끼의 피부에 Test 1 혼합물을 도포 후 홍반, 가피 및 부종형성 정도를 관칠하여 피부자극반응을 평가 한 결과 1차 피부자극지수 (PII)는 0.0으로 산출되어 비자극성을 확인하여, 피부흡수도는 증가하였지만 피부에 자극이 없는 안전한 조성임을 확인할 수 있었다.
- 특히 30 μg/㎖ 농도로 처리한 미숙과 복분자(59.08±1.98%)와 둥글레 (61.90±2.65%) 추출물은 대조군으로 사용한 orlistat 20 μM 농도의 효과 (61.39±7.95%)보다 지방분해 효과가 유사하거나 높음을 확인하였다.
- 특히 30 μg/㎖농도로 처리하였을 때 모든 추출물에서 유의적 (p<0.001)으로 지방구 형성을 억제하였고, 의약품으로 사용되고 있는 양성대조군인 orlistat보다 중성지방의 축적에 대한 억제효과가 미숙과 복분자(59.08±1.98%)와 둥글레 (61.90±2.65%) 추출물에서 큰 것으로 보아 비만 예방에 효과적일 것으로 기대된다.
- 특히 Test 1군은 TG의 함량뿐만 아니라 TCHO의 함량 또한NFD 수준으로 유의적으로 (p<0.05) 감소하여, Test 1 조성이 항비만 효과가 가장 우수함을 확인하였다.
- 특히 농도 30 μg/㎖를 처리하였을 때 모든 추출물에서 유의적(p<0.001)으로 지방 분해를 촉진하였고, 양성대조군인 orlistat 보다 지방의 분해에 대한 촉진효과가 마테(52.86±1.72%), 매실 (55.92±1.56%), 맥문동 (58.53±2.51%), 미숙과 복분자(58.98±3.05%)와 지황 (62.29±1.77%) 추출물에서 큰 것으로 보아 비만 개선에 효과적일 것으로 기대된다.
- 피부에 도포한 Test 1군과 Test 3군 모두 도포 후 1시간부터 유의적 차이를 보이면서 피부에 흡수되기 시작하였으나, 오일 성분이 포함되어 있는 Test 1군이 오일성분이 포함되어 있지 않은 Test 3군에 비해 유의적으로 피부흡수가 24시간 동안 지속적으로 증가 (p<0.001)되는 것을 확인할 수 있다.
- 혈청의 총 콜레스테롤 농도는 정상식이군 (100.0±3.34mg/dl)에 비해 고지방식이군 (147.0±11.39 mg/dl)에서 유의하게 증가되었다 (p<0.01).
후속연구
- 05). 그러나 단순한 지방의 무게만으로는 기전규명이 어려우므로 앞으로 다양한 바이오마커를 이용하여 좀 더 자세한 기전 연구를 시험물질이 포함되지 않은 음성대조군을 포함하여 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 그러나 우리의 사전 연구결과에 따르면 미숙과 복분자 추출물의 경우에는 PPAR , C/EBP 뿐만 아니라 sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c), acetyl-CoA carboxylase (ACC)와 fatty acid synthase (FAS) 모두 감소시켜 지방생성억제 및 지방분해촉진 효과가 동시에 있음을 보고 하였으며14), 본 연구결과에서도 유사한 결과를 관찰 할 수 있었다. 나머지 추출물에 대해서는 향후 이러한 세부 기전 연구를 통해 각 추출물들의 항 비만 효과에 대한 세부 작용기전에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 판단되며, 특히 지방분해 효과에 대하여 glycerol release 효과를 포함한 세부 기전 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 또한 제형, 물리화학적 성질, 피부의 상태 (연령, 부위 및 병변여부), 온·습도 등 환경요소, 화학물질의 접촉 면적이나 시간 등 다양한 조건들도 피부흡수에 큰 영향을 줄 수 있기 때문에 이에 대한 시험물질의 검증연구도 필요하다10,11).
- 또한, 피부에 도포를 통한 피부 흡수의 극대화 확립을 위한 오일 성분 유무에 따른 피부흡수도 검증 및 피부자극에 대한 안정성을 확인하였다. 이러한 결과는 향후 항비만 의약품, 다이어트 및 슬리밍 화장품 원료 및 제품 개발을 위한 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 피부 도포용 제형은 셀룰라이트를 개선하기 위해 과도하게 축적된 지방분해와 변성된 진피층 세포의 개선 및 체액의 축적 억제를 주요 효능으로 하고 있다5). 이를 위하여 인체의 셀룰라이트 생성기전에 근거하여 지방세포에서 지방 분해, 진피를 구성하고 있는 결합조직의 강화 및 보호 효과, 혈액순환 증진 및 부종 감소 효능을 가진 원료를 복합적으로 처방한다면 그 효과를 극대화할 수 있을 것이다6).
- 이상의 결과로 보아 본 연구를 통한 in vitro 및 in vivo 연구를 통해 비타민나무 종자유, 편백나무와 인진쑥 혼합 추출 오일 및 로즈마리 오일 혼합물은 기능성 화장품 및 피부도포용 의약품의 피부흡수 증진용 원료로의 개발 가능성 뿐만 아니라 다양한 천연물의 복합물 조성을 통해 피부도포를 통한 안전한 항비만 치료 및 예방 소재로서의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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