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문제 정의
- 본 연구에서는 차전초 (Plantaginis asiaticae Folium)의추출조건에 따른 3T3-L1 세포 지방 축적에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험을 진행한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- . 본실험에서 차전초가 가지는 여러 가지 효능 중, 항비만 효과의 가능성을 확인하였다. 항비만 효능을 가지는 기능성 소재로써 가장 효과적인 추출 조건을 확인하기 위해 각 추출물에 대한세포 독성검사를 마친 후, 추출 용매별, 추출 시간별, 추출 온도별로 지방생성 및 지방세포분화 억제에 미치는 영향을 관찰하였다.
가설 설정
- 3~9.4분대, (b) acteoside는 9.6분대에서peak가 검출되었다.
제안 방법
- 배양기 (MCO-15AC, SANYO, Japan)에서 8일간 배양시킨 후, 배양액을 분화유도 배양액 (10% FBS, 5 ㎍/㎖ insulin, 2uM DEX, 111 ㎍/㎖ IBMX)으로 바꾸고 2일간 배양한다. 2일 후, 분화유도 배양액 (10% FBS, 5 ㎍/㎖ insulin)이 포함된 DMEM 배지로 교환해 주어 2일간 배양시킨 뒤, 마지막으로 insulin을 첨가하지 않은 10% FBS가 포함된 DMEM배지로 배양하였다. 차전초 추출물의 각각의 농도는 (0.
- 3T3-L1 세포에서 지방 축적에 차전초 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 Oil red O 염색을 수행하였다. 세포분화 중에서 차전초 추출물을 각각의 농도 (0.
- 2)로 4℃에서 세포를 2시간 고정시킨 후, 증류수로 세척하여 지방구를 Oil red O 염색시약으로 염색하였다. 40% Isopropyl alcohol로 3회 세척을 하고 현미경(CK2, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 염색된 지방세포의 지방함량 측정을 위해 건조시킨 후, 100% isopropyl alcohol로 지방을 추출하여 510㎚ 파장에서 분광광도계 (Sunrise, TECAN, Grodig, Austria)로 흡광도를 측정한 다음, 처리군의 지방함량을 측정하였다.
- 4 ㎎/㎖)로 이틀에 한번씩 배지를 교환하며 처리 하였다. 8일 후 세포배양액 제거 후 DPBS로 3회 세척하고 cacodylate buffer (pH7.2)로 4℃에서 세포를 2시간 고정시킨 후, 증류수로 세척하여 지방구를 Oil red O 염색시약으로 염색하였다. 40% Isopropyl alcohol로 3회 세척을 하고 현미경(CK2, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 4 ㎎/㎖로 3T3-L1 전지방세포에 처리하였다. 농도뿐만 아니라 서로 다른 용매로 추출한 차전초 추출물의 세포독성 효과를 확인하기 위하여 물(W), 50% 에탄올 (50%E), 95% 에탄올 (95%E)의 용매로 추출한 차전초 시료를 3T3-L1 전지방세포에 처리하였다. 본실험에서 양성대조군으로 35µM의 농도의 fenofibrate (FF)를3T3-L1 전지방세포에 처리하였다.
- 따라서 본 연구에서는 추출 용매, 추출 시간, 추출 온도의 추출 조건을 다르게 한 차전초 추출물을 3T3-L1 세포에 처리하여 지방축적 억제 효과를 확인하였고, 차전초 지표 성분의 후보군을 설정하였다.
- 9%의 수득률을 얻었다. 또한 추출 시간에 따른 효능을 관찰하기 위해 6시간과 72시간으로 추출 시간을 달리하여 차전초를 추출하였다. 마지막으로 추출 온도별 효능을 관찰하기 위해서 70℃, 80℃, 95℃로 온도를 다르게 하여 차전초의 효능을 관찰하였다.
- 또한 추출 시간에 따른 효능을 관찰하기 위해 6시간과 72시간으로 추출 시간을 달리하여 차전초를 추출하였다. 마지막으로 추출 온도별 효능을 관찰하기 위해서 70℃, 80℃, 95℃로 온도를 다르게 하여 차전초의 효능을 관찰하였다.
- . 본 실험에서 차전초로부터 유효 및 지표 성분의 후보군을 분석하였고, 그 결과plantamajoside와 acteoside를 확인하였다. Plantamajoside와 acteoside는 여러 생물학적 반응에 관여하는 것으로 알려져있다.
- 본실험에서 양성대조군으로 35µM의 농도의 fenofibrate (FF)를3T3-L1 전지방세포에 처리하였다.
- 3T3-L1 세포에서 지방 축적에 차전초 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 Oil red O 염색을 수행하였다. 세포분화 중에서 차전초 추출물을 각각의 농도 (0.1, 0.2, 0.4 ㎎/㎖)로 이틀에 한번씩 배지를 교환하며 처리 하였다. 8일 후 세포배양액 제거 후 DPBS로 3회 세척하고 cacodylate buffer (pH7.
- 4 ㎎/㎖)별로 처리하여 MTT분석법을 이용하였다. 세포에 차전초 추출물을 처리하고 24시간 배양 후, MTT 용액 60㎕를 넣어서 암실에서 2시간 반응시킨 뒤, DMSO를 200㎕를 가하였다. 흡광도는 ELISA reader (Sunrise, TECAN, Grodig, Austria)에, 570㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 모두 3개의 well의 평균값을 이용하여 평가하였다.
- 40% Isopropyl alcohol로 3회 세척을 하고 현미경(CK2, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 염색된 지방세포의 지방함량 측정을 위해 건조시킨 후, 100% isopropyl alcohol로 지방을 추출하여 510㎚ 파장에서 분광광도계 (Sunrise, TECAN, Grodig, Austria)로 흡광도를 측정한 다음, 처리군의 지방함량을 측정하였다.
- 추출 용매별, 추출 시간별 실험 결과를 통해 차전초를 6시간물로 추출한 차전초 추출물이 지방축적억제 효과가 가장 좋게 나타났다. 차전초 물 추출물에서 추출 온도의 차이가 3T3-L1세포의 지방축적에 미치는 영향을 관찰하였다. 추출 온도는70℃, 80℃, 95℃로 서로 다르게 하였고, 그 결과 세 가지 추출온도별 차전초 물 추출물을 처리한 대부분 군에서 대조군에 대하여 지방 축적의 정도가 낮게 나타났다.
- 2일 후, 분화유도 배양액 (10% FBS, 5 ㎍/㎖ insulin)이 포함된 DMEM 배지로 교환해 주어 2일간 배양시킨 뒤, 마지막으로 insulin을 첨가하지 않은 10% FBS가 포함된 DMEM배지로 배양하였다. 차전초 추출물의 각각의 농도는 (0.1, 0.2,0.4 ㎎/㎖) 배지 교체시기마다 함께 처리하였다.
- 차전초 추출물의 함유성분 중 지표성분 후보군의 설정을 위해 초고속 액체크로마토그래피 (UPLC)를 이용하여 흡광도280㎚의 검출파장으로 함유성분을 분석하였다. 그 결과 차전초의 지표성분의 후보로 plantamajoside와 acteoside를 확인하였다.
- 차전초 추출물이 세포의 독성에 영향을 미치는지 확인하기 위해서 각각의 시료 농도 0.1, 0.2, 0.4 ㎎/㎖로 3T3-L1 전지방세포에 처리하였다. 농도뿐만 아니라 서로 다른 용매로 추출한 차전초 추출물의 세포독성 효과를 확인하기 위하여 물(W), 50% 에탄올 (50%E), 95% 에탄올 (95%E)의 용매로 추출한 차전초 시료를 3T3-L1 전지방세포에 처리하였다.
- 차전초의 주요성분인 plantamajoside 및 acteoside의 분석을 위해 각 시료를 4.0㎎씩 측량하여 HPLC용 acetonitril 1.0㎖에 녹이고 이것을 stock solution으로 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5,1.0, 2.0 및 4.0 ㎎/㎖의 농도로 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 분석용 column은 ACQUITY UPLC BEH C18 (2.
- 추출 시간에 따른 차전초 추출물이 3T3-L1 세포 지방축적에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 물 (W), 50% 에탄올 (50%E),95% 에탄올 (95%E)의 각 용매를 이용하여 6시간 동안 추출한 차전초 추출물의 시료를 3T3-L1 세포 각 군마다 처리하였고, 95% 에탄올 (95%E)의 용매를 이용하여 72시간 동안 추출한 차전초 추출물의 시료를 3T3-L1 세포에 처리하여 결과를 확인하였다. 추출 시간을 다르게 한 결과, 6시간 추출한 차전초 추출물을 처리한 대부분의 군에서 72시간 추출한 차전초 추출물을 처리한 군보다 3T3-L1 세포에 축적된 지방 함량이 더 적었다.
- 추출 용매에 따른 차전초 추출물이 3T3-L1 세포의 지방축적에 미치는 효과를 확인하기 위해, 물 (W), 50% 에탄올(50%E), 95% 에탄올 (95%E)의 용매로 차전초를 추출한 시료를 각각의 농도 0.1, 0.2, 0.4 ㎎/㎖로 각 군에 처리한 후, 세포 내 지방 함량의 정도를 확인하였다. 50% 에탄올 (50%E)추출물의 시료군 0.
- 본실험에서 차전초가 가지는 여러 가지 효능 중, 항비만 효과의 가능성을 확인하였다. 항비만 효능을 가지는 기능성 소재로써 가장 효과적인 추출 조건을 확인하기 위해 각 추출물에 대한세포 독성검사를 마친 후, 추출 용매별, 추출 시간별, 추출 온도별로 지방생성 및 지방세포분화 억제에 미치는 영향을 관찰하였다. 추출 용매별 지방억제 효능은 물이 가장 뛰어났으며, 95% 에탄올 추출물의 지방억제 정도는 이전 논문과 비슷한 결과를 나타내고 있다19).
대상 데이터
- 3T3-L1 세포 배양을 위해 사용된 배지는 bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS) 및 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)을 사용하고 Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 제품을 구입하였다, 3T3-L1 세포분화를 유도하기 위한 penicillin/streptomycin (P/S), insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylanthine (IBMX), cacodylate는 Sigma Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
- 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, CL-173TM)에서 구입하여 본 실험에 사용하였으며, 세포는 1%의 P/S가 포함된 10%의 BCS을 DMEM 배지에 37℃, 5% CO2배양기 (MCO-15AC, SANYO, Japan)에서 8일간 배양시킨 후, 배양액을 분화유도 배양액 (10% FBS, 5 ㎍/㎖ insulin, 2uM DEX, 111 ㎍/㎖ IBMX)으로 바꾸고 2일간 배양한다. 2일 후, 분화유도 배양액 (10% FBS, 5 ㎍/㎖ insulin)이 포함된 DMEM 배지로 교환해 주어 2일간 배양시킨 뒤, 마지막으로 insulin을 첨가하지 않은 10% FBS가 포함된 DMEM배지로 배양하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 또한 dimethyl sulfoxide (DMSO), CaCl2는 덕산약품 (안산, 경기도, 한국) 제품을 사용하였으며, formaldehyde, isopropyl alcohol은 Junsei chemical (Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 차전초 (Plantaginis asiaticae Folium)의 산지는 영천산으로 농업회사법인㈜ 이비채 (영천, 대한민국)에서 제공받은 것을 대구한의대 본초학교실에서 감별 받아 사용하였다. 추출 용매별로 차전초의 효능을 확인하기 위해 600g의 차전초에 물 (H2O), 50%에탄올 (50% Ethanol), 95%에탄올 (95% Ethanol)의 용매를 각각 5L씩 가하여 추출하였고 8.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 세포 독성 측정을 위한 3-[4,5-dimethyl thiazolyl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) 및 지방구 염색에 사용된 시약인 Oil red O 용액은 Sigma Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 또한 dimethyl sulfoxide (DMSO), CaCl2는 덕산약품 (안산, 경기도, 한국) 제품을 사용하였으며, formaldehyde, isopropyl alcohol은 Junsei chemical (Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 각 군당 평균의 통계적 유의성은 Duncan's multi plerange test를 사용하여 검증하였고 유의수준은 0.05 이하로정하였다.
- 본 결과의 통계처리는 IBM SPSS Statistics 22 (Statistical package for the social sciences, SPSS Inc., Chicago)를 사용하여 산출하였고 Student's t-test로써 군간 차이를 분석하였다.
- 세포에 차전초 추출물을 처리하고 24시간 배양 후, MTT 용액 60㎕를 넣어서 암실에서 2시간 반응시킨 뒤, DMSO를 200㎕를 가하였다. 흡광도는 ELISA reader (Sunrise, TECAN, Grodig, Austria)에, 570㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 모두 3개의 well의 평균값을 이용하여 평가하였다.
이론/모형
- 차전초 추출물이 3T3-L1 세포생존에 미치는 영향을 알아보기 위하여 96well plate에서 차전초 추출물을 각 농도 (0.1,0.2, 0.4 ㎎/㎖)별로 처리하여 MTT분석법을 이용하였다. 세포에 차전초 추출물을 처리하고 24시간 배양 후, MTT 용액 60㎕를 넣어서 암실에서 2시간 반응시킨 뒤, DMSO를 200㎕를 가하였다.
성능/효과
- 1. 용매별 차전초 추출물은 0.1, 0.2, 0.4 ㎎/㎖의 처리농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다.
- 2. 추출 용매별 차전초 추출물의 Oil red O 염색 결과, 물추출물에서 가장 큰 지방축적 억제 효과를 보였으며, 특히 0.2 ㎎/㎖ 처리농도에서 가장 뛰어난 효과를 보였다.
- 3. 추출 시간별 차전초 추출물의 Oil red O 염색 결과, 6시간 추출한 추출물에서 지방축적 억제에 대한 좋은 효과를 보였다.
- 4. 추출 온도별 차전초 추출물의 Oil red O 염색 결과, 차전초 물 추출물의 70℃ 온도조건에서 가장 큰 지방축적억제 효과를 보였으며, 특히 0.2 mg/mL 처리농도에서 가장 뛰어난 효과를 보였다.
- 5. UPLC 분석을 이용한 차전초의 지표성분 후보군으로는 plantamajoside와 acteoside를 확인할 수 있었다.
- 차전초 추출물의 함유성분 중 지표성분 후보군의 설정을 위해 초고속 액체크로마토그래피 (UPLC)를 이용하여 흡광도280㎚의 검출파장으로 함유성분을 분석하였다. 그 결과 차전초의 지표성분의 후보로 plantamajoside와 acteoside를 확인하였다. Fig.
- 본실험에서 양성대조군으로 35µM의 농도의 fenofibrate (FF)를3T3-L1 전지방세포에 처리하였다. 그 결과, 차전초의 물 추출물 (W)과 95% 에탄올 (95%E) 추출물에서는 시료의 농도에 의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것으로 나타났다. 또한 95% 에탄올 (95%E) 추출물 0.
- 추출 시간별 지방억제 효과는 6시간의 추출시간이 72시간의 추출시간보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 두 가지 결과를 종합하여 볼 때, 차전초를 6시간 물 추출하는 것이 지방축적 억제에 가장 큰 효과를 나타내고 있다. 차전초 물 추출물에 대한 온도별 효과를 관찰했을 때, 70℃물 추출물에서 지방세포의 지방축적이 가장 적게 나타나면서, 이는 항비만에 가장 효과적일 것으로 사료된다.
- 따라서, 본 연구에서 시도한 차전초의 여러 추출방법 중 70℃에서 물을 용매로 사용한 추출액이 다른 방법의 추출액보다 지방세포 내에서 지방 함량의 더 큰 감소를 가져옴으로써, 지방세포 분화 및 지방합성의 억제와 관련된 항비만에 더 효과적인 작용을 할 것으로 추측된다. 또한 차전초의 UPLC 성분분석결과 plantamajoside와 acteoside의 두 성분이 확인됨으로써 이 성분들이 지표 물질로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 4 ㎎/㎖의 농도를 제외한 나머지 군에서 지방 축적의 정도가 대조군에 대해 감소한 것으로 관찰되었다. 용매 중에서는 차전초의 물 추출물 (W)이 지방축적의 정도가 가장 낮게 나타났으며 물 추출물 (W)에서 농도에 따른 세포내 지방함량은 대조군에 대하여 58%, 63%, 25%가감소한 것으로 나타났고, 세농도 중, 0.2 ㎎/㎖의 농도에서 가장 지방억제효능이 효과적으로 나타났다.
- 추출 용매별 지방억제 효능은 물이 가장 뛰어났으며, 95% 에탄올 추출물의 지방억제 정도는 이전 논문과 비슷한 결과를 나타내고 있다19). 추출 시간별 지방억제 효과는 6시간의 추출시간이 72시간의 추출시간보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 두 가지 결과를 종합하여 볼 때, 차전초를 6시간 물 추출하는 것이 지방축적 억제에 가장 큰 효과를 나타내고 있다.
- 추출 시간에 따른 차전초 추출물이 3T3-L1 세포 지방축적에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 물 (W), 50% 에탄올 (50%E),95% 에탄올 (95%E)의 각 용매를 이용하여 6시간 동안 추출한 차전초 추출물의 시료를 3T3-L1 세포 각 군마다 처리하였고, 95% 에탄올 (95%E)의 용매를 이용하여 72시간 동안 추출한 차전초 추출물의 시료를 3T3-L1 세포에 처리하여 결과를 확인하였다. 추출 시간을 다르게 한 결과, 6시간 추출한 차전초 추출물을 처리한 대부분의 군에서 72시간 추출한 차전초 추출물을 처리한 군보다 3T3-L1 세포에 축적된 지방 함량이 더 적었다.
- 추출 온도는70℃, 80℃, 95℃로 서로 다르게 하였고, 그 결과 세 가지 추출온도별 차전초 물 추출물을 처리한 대부분 군에서 대조군에 대하여 지방 축적의 정도가 낮게 나타났다. 추출 온도 70℃에서추출한 차전초 물 추출물이 가장 좋은 지방억제 효과를 보였으며, 시료의 농도는 0.2 ㎎/㎖에서 지방 축적 억제 정도가가장 뛰어났다.
- 추출 용매별, 추출 시간별 실험 결과를 통해 차전초를 6시간물로 추출한 차전초 추출물이 지방축적억제 효과가 가장 좋게 나타났다. 차전초 물 추출물에서 추출 온도의 차이가 3T3-L1세포의 지방축적에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 본 실험에 사용된 차전초 (Plantaginis asiaticae Folium)의 산지는 영천산으로 농업회사법인㈜ 이비채 (영천, 대한민국)에서 제공받은 것을 대구한의대 본초학교실에서 감별 받아 사용하였다. 추출 용매별로 차전초의 효능을 확인하기 위해 600g의 차전초에 물 (H2O), 50%에탄올 (50% Ethanol), 95%에탄올 (95% Ethanol)의 용매를 각각 5L씩 가하여 추출하였고 8.83~16.9%의 수득률을 얻었다. 또한 추출 시간에 따른 효능을 관찰하기 위해 6시간과 72시간으로 추출 시간을 달리하여 차전초를 추출하였다.
- 차전초 물 추출물에 대한 온도별 효과를 관찰했을 때, 70℃물 추출물에서 지방세포의 지방축적이 가장 적게 나타나면서, 이는 항비만에 가장 효과적일 것으로 사료된다. 추출물의 처리농도 0.1, 0.2, 0.4 ㎎/㎖ 중에서 차전초 시료의 처리 농도0.2 ㎎/㎖가 모든 추출조건에서 효과적인 지방축적억제의 결과를 나타내었고 이는 가장 항비만에 효과적인 농도로 사료된다.
후속연구
- 그리하여 본 실험을 통하여 plantamajoside와 acteoside가 항비만에 영향을 주는 물질이 될 것이라 예상한다. 그러나 항비만 효능과 관련될 것이라 추측되는 이들 성분에 대한 연구는 후속 연구를 통해서 밝혀져야 할 것이다.
- Acteoside도 항염증과 항산화 작용에 관여하고lipase 작용을 억제하여 지질 흡수에 영향을 주어 항비만에 도움을 준다24~26). 그리하여 본 실험을 통하여 plantamajoside와 acteoside가 항비만에 영향을 주는 물질이 될 것이라 예상한다. 그러나 항비만 효능과 관련될 것이라 추측되는 이들 성분에 대한 연구는 후속 연구를 통해서 밝혀져야 할 것이다.
- 따라서, 본 연구에서 시도한 차전초의 여러 추출방법 중 70℃에서 물을 용매로 사용한 추출액이 다른 방법의 추출액보다 지방세포 내에서 지방 함량의 더 큰 감소를 가져옴으로써, 지방세포 분화 및 지방합성의 억제와 관련된 항비만에 더 효과적인 작용을 할 것으로 추측된다. 또한 차전초의 UPLC 성분분석결과 plantamajoside와 acteoside의 두 성분이 확인됨으로써 이 성분들이 지표 물질로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
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