[논문]Botrytis cinerea에 의한 오크라 잿빛곰팡이병

최장남; 최인영; 이귀재; 이정노; 조성완; 신현동

doi:10.5423/rpd.2018.24.4.302

Botrytis cinerea에 의한 오크라 잿빛곰팡이병
Occurrence of Gray Mold Caused by Botrytis cinerea on Okra in Korea 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.24 no.4, 2018년, pp.302 - 307

최장남 (전북대학교 농생물학과) , 최인영 (전라북도농업기술원) , 이귀재 (전북대학교환경생명자원대학) , 이정노 (한국폴리텍대학바이오캠퍼스) , 조성완 (건양대학교 제약생명학과) , 신현동 (고려대학교환경생태공학부)

초록
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2014년부터 2016년까지 전라북도농업기술원(익산) 시험연구포장에 식재한 오크라에서 잿빛곰팡이병이 5%정도 발생하였다. 초기 감염은 열매의 기저부에서 갈색 또는 회색의 점무늬로부터 시작하여 꼬투리와 줄기 쪽으로 확대되었고, 수침상으로 분생포자와 함께 많은 균사가 형성되다. 감자한천배지에서 균사 생육은 직경이 65-80 mm/7일이었으며, 중앙부와 가장자리에서 진한 쥐색으로 양모상이었다. 2주간 배양된 병원균은 배지 위에 작고 검은색의 균핵을 형성하였으며, 크기는 $1.0-3.5{\times}0.5-3.0mm$이었다. 병원균의 분생포자는 무색 또는 회색의 단세포이며, 구형 또는 타원형으로 크기는 $6.2-15.4{\times}5.0-10.4{\mu}m$이었다. 또한 수지상으로 분지한 분생포자경위에 포도 송이와 같이 분생포자가 집단적으로 형성되었다. 분생포자경은 갈색 또는 투명한 색의 수지상으로 크기는 $85-450{\times}10.0-40.0{\mu}m$이었다. 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 Botrytis cinerea Pers.에 의한 오크라 잿빛곰팡이병으로 명명하고자 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

From 2014 to 2016, approximately 5% of okra fruit were observed displaying gray mold symptoms at the research field of Jeollabuk-do Agricultural Research and Extension Services, Korea. The symptoms observed were water-soaked, brown or gray spots, and abundant mycelial with conidia appearing on the infected fruit. Initial infection commenced from the base of fruit and gradually moved to the pod, where it finally resulted in collapse. Colonies on potato dextrose agar were gray to grayish brown, felted and cottony expanding 65-80 mm after one week. The fungus formed several black sclerotia ranging $1.0-3.5{\times}0.5-3.0mm$ on the Petri dish after two weeks. The conidia were one-celled, ellipsoidal or ovoid, colorless or pale brown, and $6.2-15.4{\times}5.0-10.4{\mu}m$. Conidiophores arose solitary or in groups, straight or flexuous, septate, with an inflated basal cell brown to light brown, and measured $85-450{\times}10.0-40.0{\mu}m$. On the basis of the morphological characteristics and phylogenetic analyses of internal transcribed spacer rDNA, the fungus was identified as Botrytis cinerea Pers. Pathogenicity of a representative isolate was proved by artificial inoculation, fulfilling Koch's postulates. To our knowledge, this is the first report on the occurrence of B. cinerea on okra in Korea.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Typical symptoms of gray mold disease on naturally infected okra caused by Botrytis cinerea. (A) The fruit was infected, devastating the whole plant. (B) One-week-old colony of B. cinerea growing on a PDA (Potato Dextrose Agar). (C) Black sclerotia developed on PDA of two-week-old colony. (D) Conidia and conidiophores. (E) Conidia.
표 Table 1. Comparison of mycological characteristics of the present isolate obtained from okra (Abelmoschus esculentus) and Botrytis cinerea as previously described
그림 Fig. 2. Phylogenetic tree obtained through the neighbor-joining method using the MEGA 6.06 program based on the internal transcribed spacer ribosomal DNA (rDNA) sequence of our isolates of Botrytis cinerea, and that of other Botrytis spp. retrieved from GenBank. The numbers above the nodes are the bootstrap values obtained from 1,000 replicates. The isolates obtained in this study are shown in boldface.

AI 본문요약
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문제 정의

발병된 오크라에서 병원균을 순수 분리한 후 단일균주를 획득하였으며, 병원균의 형태적 특징 및 DNA 염기서열 분석을 기초로 Botrytis cinerea로 동정하였고, 오크라 열매에 인공접종하여 병원성을 검정하였다. 따라서 본 연구는 오크라 잿빛곰팡이병의 발병 및 병징, 병원성 검정, 균학적 특징 및 염기서열 분석 등에 대하여 보고한다.
따라서 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 Botrytis cinerea Pers.에 의한 오크라 잿빛곰팡이병으로 명명하고자 한다. 전 세계적으로 잿빛곰팡이병을 일으키는 B.

가설 설정

cinerea growing on a PDA (Potato Dextrose Agar). (C) Black sclerotia developed on PDA of two-week-old colony. (D) Conidia and conidiophores.

제안 방법

5% agarose gel에서 분리한 후 PCR purification kit (Core-one^TM, Core-bio, Korea)를 사용하였다. ABI 3130 auto sequencer를 이용하여 ITS1과 ITS4의 염기서열을 분석하였으며, ITS rDNA sequence data는 GenBank database (National Centre for Biotechnology Information [NCBI], US National Institute of Health Bethesda, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)에서 확인하였다. Phylogenetic analysis은 MEGA 6.
감자한천배지에서 일주일 동안 배양한 병원균주의 균총을 메스로 긁어 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. Ribosomal DNA (rDNA)의 internal transcribed spacer (ITS) 영역을 분석하기 위해 ITS1/ITS4 primer를 사용하여 PCR로 증폭했으며(White 등, 1990), 증폭된 산물은 정제를 위해 1.5% agarose gel에서 분리한 후 PCR purification kit (Core-one^TM, Core-bio, Korea)를 사용하였다. ABI 3130 auto sequencer를 이용하여 ITS1과 ITS4의 염기서열을 분석하였으며, ITS rDNA sequence data는 GenBank database (National Centre for Biotechnology Information [NCBI], US National Institute of Health Bethesda, http://blast.
또한 형태적 특징을 기초로 한 병원균의 동정을 보완하기 위하여 염기서열 분석을 하였다. 감자한천배지에서 일주일 동안 배양한 병원균주의 균총을 메스로 긁어 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. Ribosomal DNA (rDNA)의 internal transcribed spacer (ITS) 영역을 분석하기 위해 ITS1/ITS4 primer를 사용하여 PCR로 증폭했으며(White 등, 1990), 증폭된 산물은 정제를 위해 1.
그 다음, 멸균수로 2-3회 세척하여 멸균된 여과지에서 물기를 제거한 다음 감자한천배지(PDA) (Difco, MD, USA)에 옮겼으며, 22±1o C 항온기 내에서 2-3일간 배양하였고, 2균주(JARES71과 JBARES72)를 확보하였다.
또한 형태적 특징을 기초로 한 병원균의 동정을 보완하기 위하여 염기서열 분석을 하였다. 감자한천배지에서 일주일 동안 배양한 병원균주의 균총을 메스로 긁어 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다.
2014년부터 2016년까지 전라북도농업기술원(익산) 시험연구 포장에 식재한 오크라에서 잿빛곰팡이병이 발생하였다. 발병된 오크라에서 병원균을 순수 분리한 후 단일균주를 획득하였으며, 병원균의 형태적 특징 및 DNA 염기서열 분석을 기초로 Botrytis cinerea로 동정하였고, 오크라 열매에 인공접종하여 병원성을 검정하였다. 따라서 본 연구는 오크라 잿빛곰팡이병의 발병 및 병징, 병원성 검정, 균학적 특징 및 염기서열 분석 등에 대하여 보고한다.
병원균 분리는 오크라 재배 포장에서 병든 식물체를 채집하여 실험실에서 건전 부위와 병원균에 감염된 이병 부위의 경계 조직을 5×5 mm 크기로 잘라 1% NaOCl 용액에서 1분 동안 표면 살균하였다.
병원균의 균학적 특징 및 rDNA의 ITS 염기서열 분석. 병원균의 형태적 특징은 감자한천배지에서 7일 동안 배양된 병원균(JARES71, JBARES72)과 열매에 감염된 병원균의 분생포자경 과 분생포자를 대상으로 확인하였으며, Stereo 현미경(SteREO Discovery V8, Zeiss)과 DIC (differential interference contrast) 모듈이 장착된 광학현미경(AXIO, Zeiss)에서 400-1,000배로 관찰하였다. 분생포자경, 분생포자의 형태와 크기(n=50) 등은 AxioVision LE Module Interactive Measurement (Zeiss) 프로그램을 이용하여 측정하였다.
오크라 잿빛곰팡이병에 대한 병원성 검정은 포트에서 30일 간 생육된 5개 유묘 식물체에 형성된 열매를 대상으로 실시하였다. 접종원은 JARES71균주를 감자한천배지에서 2주간 배양한 후 멸균수를 넣고 메스(scalpel)로 포자를 수거한 현탁액(2.
3×10⁵ conidia/ml) 를 사용하였다. 접종방법은 5개 유묘에 형성된 10개 열매에 포자현탁액을 충분히 분무하였으며, 대조구는 멸균수를 동일한 개체에 분무하였다. 접종된 모든 식물체는 95% 이상의 높은 상대습도를 유지하기 위하여 식물체 주변에 증류수를 충분히 분무한 후 비닐봉지로 밀봉하여 25±1^oC에서 유지하였다.

대상 데이터

2014년부터 2016년까지 전라북도농업기술원(익산) 시험연구 포장에 식재한 오크라에서 잿빛곰팡이병이 5%정도 발생하였다. 초기 감염은 열매의 기저부에서 갈색 또는 회색의 점무늬로 부터 시작하여 꼬투리와 줄기 쪽으로 확대되었고, 수침상으로 분생포자와 함께 많은 균사가 형성되다.
2014년부터 2016년까지 전라북도농업기술원(익산) 시험연구 포장에 식재한 오크라에서 잿빛곰팡이병이 발생하였다. 발병된 오크라에서 병원균을 순수 분리한 후 단일균주를 획득하였으며, 병원균의 형태적 특징 및 DNA 염기서열 분석을 기초로 Botrytis cinerea로 동정하였고, 오크라 열매에 인공접종하여 병원성을 검정하였다.
접종원은 JARES71균주를 감자한천배지에서 2주간 배양한 후 멸균수를 넣고 메스(scalpel)로 포자를 수거한 현탁액(2.3×105 conidia/ml) 를 사용하였다.

데이터처리

cgi)에서 확인하였다. Phylogenetic analysis은 MEGA 6.06 program을 이용하여 neighbor-joining 방법으로 작성하였으며, sequence distance는 Tamura-Nei parameter model 로 계산하였고, bootstrap analysis은 1,000반복으로 수행하였다(Tamura 등, 2013).
병원균의 형태적 특징은 감자한천배지에서 7일 동안 배양된 병원균(JARES71, JBARES72)과 열매에 감염된 병원균의 분생포자경 과 분생포자를 대상으로 확인하였으며, Stereo 현미경(SteREO Discovery V8, Zeiss)과 DIC (differential interference contrast) 모듈이 장착된 광학현미경(AXIO, Zeiss)에서 400-1,000배로 관찰하였다. 분생포자경, 분생포자의 형태와 크기(n=50) 등은 AxioVision LE Module Interactive Measurement (Zeiss) 프로그램을 이용하여 측정하였다. 분리된 병원균은 감자한천배지에서 22±1^oC, 7일간 배양하였을 때 직경이 65-80 mm 생육을 보였으며, 균총은 중앙부와 가장자리에서 더욱 진한 쥐색으로 양모상이며, 원형으로 배양되었다(Fig.

성능/효과

NCBI에서 Blastn search한 결과 B. cinerea로 등록된 GenBank accession number KY817370, MH458888, KX229751, KR055052, KU570456, KP165493, KX443701 등과 >99% 일치하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	오크라의 성분과 식용도는 어떻게 되는가?	아프리카 동북부가 원산지이며, 전 세계의 열대와 아열대지방인 인도, 동남아시아, 아프리카, 중남미에서 널리 재배되고 있다. 오크라에는 단백질과 비타민, 미네랄이 풍부하며, 과일 안의 점질물은 배변에 도움이 되는 것으로 알려져 있어 샐러드 또는 튀김으로 먹거나 스프 등에 넣어 먹는다(Salameh, 2014). 오크라는 아시아와 아프리카의 개발도상국에서 99% 이상 독점적으로 재배되고 있으며, 전 세계의 연평균 생산량은 5.
	오크라 잿빛곰팡이병을 왜 우리나라에서 이제 명명하는가?	오크라에 기록된 병해는 전 세계적으로 230여개의 병원균이 기록되어 있지만 Botyrtis cinerea에 의한 잿빛곰팡이병은 불가리아와 중국에만 기록되어 있다(Farr와 Rossman, 2018). 우리나라에는 Podosphaera xanthii에 의한 흰가루병(Choi 등, 2018)과 Choanephora cucurbitarum에 의한 Choanephora rot (Park 등, 2015)만 보고되어 있어 기주 미기록 종이다(The Korean Society of Plant Pathology, 2009). 따라서 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 Botrytis cinerea Pers.
	오크라는 무엇이며 무엇으로도 불리는가?	오크라[Abelmoschus esculentus (L.) Moench]는 아욱과(Malvaceae)에 속하는 아열대성 채소로 여자 손가락 모양과 비슷하다 하여 ‘레이디핑거’라고도 불린다. 아프리카 동북부가 원산지이며, 전 세계의 열대와 아열대지방인 인도, 동남아시아, 아프리카, 중남미에서 널리 재배되고 있다.

참고문헌 (15)

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Choi, I. Y., Kim, J. H., Uhm, M. J., Cho, S. E. and Shin, H. D., 2018. First report of powdery mildew caused by Podosphaera xanthii on okra in Korea. Plant Dis. 102: 1663.

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FAOSTAT. 2014. FAOSTAT URL http://faostat.fao.org/ [8 February2017].
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Park, J. H., Cho, S. E., Choi, I. Y. and Shin, H. D. 2015. First report of Choanephora rot of okra caused by Choanephora cucurbitarum in Korea. J. Phytopathol. 163: 503-506.

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Salameh, N. 2014. Genetic diversity of okra (Abelmoschus esculentus L.) landraces from different agro-ecological regions revealed by AFLP analysis. Am-Euras. J. Agric. Environ. Sci. 14: 155-160.
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ten Have, A., Espino, J. J., Dekkers, E., Van Sluyter, S. C., Brito, N., Kay, J. et al. 2010. The Botrytis cinerea aspartic proteinase family. Fungal Genet. Biol. 47: 53-65.

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The Korean Society of Plant Pathology. 2009. List of plant disease in Korea. 5th ed. The Korean Society of Plant Pathology, Suwon, Korea. 853 pp. (In Korean)
White, T. J., Bruns, T. D., Lee, S. B. and Taylor, J. W. 1990. Amplification and direct sequencing of fungi ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR - Protocols and Applications - A Laboratory Manual, eds. by M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninski and T. J. White, pp. 315-322. Academic Press, San Diego, CA, USA.
Zhao, Q., Chai, A. L., Shi, Y. X., Xie, X. W. and Li, B. J. 2016. First report of grey mould disease on Abelmoschus esculentus caused by Botrytis cinerea in China. J. Phytopathol. 164: 354-357.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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