[논문]우리나라 양식 자주복, Takifugu rubripes (Temminck & Schlegel, 1850)에서 발생한 Vibrio atlanticus의 첫 감염 사례 보고

이남실; 조미영; 정승희; 원경미

doi:10.7847/jfp.2018.31.2.087

우리나라 양식 자주복, Takifugu rubripes (Temminck & Schlegel, 1850)에서 발생한 Vibrio atlanticus의 첫 감염 사례 보고
The first case report on Vibrio atlanticus infection in cultured tiger puffer, Takifugu rubripes 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.31 no.2, 2018년, pp.87 - 92

이남실 (국립수산과학원 병리연구과) , 조미영 (국립수산과학원 병리연구과) , 정승희 (국립수산과학원 병리연구과) , 원경미 (국립수산과학원 병리연구과)

초록
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본 연구는 육상 순환 양식장, 약 $20^{\circ}C$의 수온에서 양식 중이던 자주복에서 체표에 백탁과 궤양을 보이는 개체가 다수 발생하여 그 원인을 밝히고자 하였다. TCBS 선택배지에서 순수 배양된 균체를 확인하고 계대 배양하여 16S rRNA와 rpoA 유전자의 염기서열 분석을 실시하였으며, 그 결과는 Vibrio atlanticus와 99.77%의 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 생화학적 특징을 이미 보고된 같은 균종과 비교한 결과, Voges-Proskauer test와 Gelatin 가수분해능에 대한 결과에서 차이를 나타내는 것으로 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

A case of disease was occurred in tiger puffer, Takifugu rubripes, reared in circulated system (water temperature was about $20^{\circ}C$) on land in Korea. Diseased fish showed a unique external sign, the cloudy skin ulcer in various sizes. We investigated the cause of disease, and isolated one pure cultured bacterium, TP01. This had 99.7% homology with Vibrio atlanticus by sequence analysis of the 16S rRNA and rpoA genes. TP01 showed some differences with other reported V. atlanticus strains in the biochemical characteristics as like Voges-Proskauer test and gelatin hydrolysis.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Skin ulcer at up side(Left) and down side(Right) of diseased tiger puffer.
표 Table 1. Oligonucleotide primers used in PCR amplification
그림 Fig. 2. Neighbour-joining tree showing the phylogenetic position based on housekeeping gene rpoA and the 16S rRNA gene. Bar, 0.02 substitutions per nucleotide position, Numbers at nodes show percentage bootstrap values.
표 Table 2. The results of biochemical test of TP01 strain

AI 본문요약
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문제 정의

최근 자주복의 육상양식장에서 사육 중이던 체장 17∼18cm의 어체에서 다양한 크기의 흰 구름 모양의 궤양 부위가 등쪽에서 관찰되기 시작하여 심해지면 몸 전체에 궤양부위가 증가하고 등쪽에 궤양이 심한부위는 근육이 드러나는 질병이 나타났다. 폐사율은 비교적 낮지만 사료섭이율이 저하되고 상품가치가 떨어지는 등 피해가 발생하므로 그 원인을 알아보고자 다양한 미생물학적 분석을 실시하였다.

제안 방법

검사용 시료는 감염어를 무균적으로 해부하여 적출한 신장, 비장 및 뇌를 사용하였다. PCR을 위한 DNA는 시판되는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Germany)를 사용하여 매뉴얼에 따라 분리하였으며, RNA는 매뉴얼에 따라 TRIZOL^Ⓡ Reagent (Invitrogen, USA)로 분리한 후, Super Script^TMⅡ Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. RSIV의 PCR 분석에는 분리된 DNA를 template로 사용하였으며, 그 외 VHSV, VNNV, HRV 및 MBV의 PCR 분석에는 분리된 RNA에서 합성한 cDNA를 사용하였다.
5% NaCl이 첨가된 TSA 배지에서 투명한 크림색의 colony를, TCBS 배지에서 노란색 colony를 형성하여 Vibrio sp.로 추정되었으며, 이 균주를 TP01로 정하고 이후의 분석을 실시하였다.
5% NaCl을 첨가한 TSA배지에서 20℃, 24시간 배양된 균주를 사용하였다. 먼저 상법에 따라 Gram stain 염색성과 형태를 관찰하고 세균의 운동성을 판정하였다. Oxidase test는 cytochrome oxidase 시험지법, catalase test는 3% H₂O₂를 이용한 slide 반응법으로 실시하였다.
분리균의 종 동정을 위해 16S rRNA 및 rpoA 유전자에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. 분리균의 genomic DNA 추출과 PCR 분석은 상기와 동일하게 High pure template preparation kit (Roche, Germany)와 ExTaq^Ⓡ (Takara, Japan)을 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 27F (5´-CTGAGCCAGGATCAAACTCT-3´)와1429R (5´-CGTTACCTTGTTACGACTT-3´) primer sets를 이용하여 1,505bp의 산물을 얻었으며, rpoA 유전자는 rpoA-01-F (5´-ATGCAGGGTTCTGTDAG-3´)와 rpoA-03-R (5´-GHGGCCARTTTTCGARRCGC-3´) primer sets (Thompson et al.
2) 16S rRNA 및 rpoA 유전자에 대한 염기서열 분석

분리균의 종 동정을 위해 16S rRNA 및 rpoA 유전자에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. 분리균의 genomic DNA 추출과 PCR 분석은 상기와 동일하게 High pure template preparation kit (Roche, Germany)와 ExTaq^Ⓡ (Takara, Japan)을 사용하였다.
시험어를 무균적으로 해부하여 신장, 비장, 간 등의 내부 장기 및 체표 환부를 NaCl 1.5% 첨가 TSA 배지, BHIA 배지, TCBS 배지, SS 배지 등에 접종하여 20℃, 24∼48시간 배양하여 균의 성상을 확인하였으며 이를 계대배양하여 이후의 실험에 사용하였다.
염기서열의 분석에는 Genetyx Ver. 8.0 (SDC Software Development, Japan)을 사용하였으며, NCBI에서 제공되는 BLAST program 정보를 이용하여 상동성을 비교하였다.
, 2005)를 이용하여 951bp의 산물을 얻었다. 증폭된 PCR 산물은 전기영동으로 band를 확인한 후, Gel SV kit (GeneAll, Korea)로 정제하고 Topo TA cloning^Ⓡ (Invitrogen, USA)을 이용하여 cloning 하여 염기서열을 확인하였다.
PCR 분석은 ExTaq^Ⓡ (TaKaRa, Japan)을 이용하여 매뉴얼에 따랐으며, 사용된 primer set 및 PCR 조건은 Table 1에 나타내었다. 증폭된 산물은 전기영동으로 확인하였으며, 모든 PCR 분석은 양성대조 및 음성대조를 함께 비교하였다.
질병 증상을 보이는 복어의 아가미, 체표 및 각 내부 장기를 일부 잘라내어 슬라이드글라스에 생검하여 조직의 상태 및 기생충 감염 여부를 육안 및 현미경적으로 확인하였다.
해산어에서 주로 검출되는 바이러스의 감염 유무를 확인하기 위하여 참돔이리도바이러스 (redseabream iridovirus, RSIV), 바이러스성출혈성패혈증바이러스 (viral hemorrhagic septicaemia virus, VHSV)를 포함하여 바이러스성신경괴사증바이러스 (viral nervous necrosis virus, VNNV), 히라메랩도바이러스 (hirame rhabdovirus, HRV) 및 해산 버나바이러스 (marine birnavirus, MBV)에 대한 polymerase chain reaction (PCR) 분석을 시행하였다.

대상 데이터

2016년 4월, 경상남도 통영 소재의 자주복 육상양식장에서 체장 17-18 cm의 개체에서 피부, 특히 등쪽에 다양한 크기의 궤양부를 형성하는 병적 증상을 보인 개체가 증가하여 실험실로 수송하였다. 당시, 양식장의 수온은 20℃정도로 유지되었으며 1일 25회 순환의 조건으로 사육수를 환수하는 조건 이외에 다른 사육조건에 변화가 발생하지는 않았고, 실험에 사용한 검체는 10마리였다.
검사용 시료는 감염어를 무균적으로 해부하여 적출한 신장, 비장 및 뇌를 사용하였다. PCR을 위한 DNA는 시판되는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Germany)를 사용하여 매뉴얼에 따라 분리하였으며, RNA는 매뉴얼에 따라 TRIZOL^Ⓡ Reagent (Invitrogen, USA)로 분리한 후, Super Script^TMⅡ Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
2016년 4월, 경상남도 통영 소재의 자주복 육상양식장에서 체장 17-18 cm의 개체에서 피부, 특히 등쪽에 다양한 크기의 궤양부를 형성하는 병적 증상을 보인 개체가 증가하여 실험실로 수송하였다. 당시, 양식장의 수온은 20℃정도로 유지되었으며 1일 25회 순환의 조건으로 사육수를 환수하는 조건 이외에 다른 사육조건에 변화가 발생하지는 않았고, 실험에 사용한 검체는 10마리였다.
2008). 본 연구에서의 질병발생 예는구백증과 같은 백색궤양이 주증상이지만 구백증과는 달리 주둥이에는 뚜렷한 증상이 없지만 등쪽 백색 궤양부 형성을 주 증상으로 하였다. 외부기생충이나 바이러스의 감염은 없었으며, 세균분석 결과 V.

이론/모형

먼저 상법에 따라 Gram stain 염색성과 형태를 관찰하고 세균의 운동성을 판정하였다. Oxidase test는 cytochrome oxidase 시험지법, catalase test는 3% H₂O₂를 이용한 slide 반응법으로 실시하였다. 그 외의 다양한 생화학적 시험은 Mafaddin (2000)의 방법을 따랐으며 API 20E kit (BioMerieux, France)를 함께 사용하여 Vibrio anguillarum KCTC2711을 표준균주로 함께 비교 분석하였다.
RSIV의 PCR 분석에는 분리된 DNA를 template로 사용하였으며, 그 외 VHSV, VNNV, HRV 및 MBV의 PCR 분석에는 분리된 RNA에서 합성한 cDNA를 사용하였다. PCR 분석은 ExTaq^Ⓡ (TaKaRa, Japan)을 이용하여 매뉴얼에 따랐으며, 사용된 primer set 및 PCR 조건은 Table 1에 나타내었다. 증폭된 산물은 전기영동으로 확인하였으며, 모든 PCR 분석은 양성대조 및 음성대조를 함께 비교하였다.
Oxidase test는 cytochrome oxidase 시험지법, catalase test는 3% H₂O₂를 이용한 slide 반응법으로 실시하였다. 그 외의 다양한 생화학적 시험은 Mafaddin (2000)의 방법을 따랐으며 API 20E kit (BioMerieux, France)를 함께 사용하여 Vibrio anguillarum KCTC2711을 표준균주로 함께 비교 분석하였다.

성능/효과

TP01의 16S rRNA 유전자 1,505 bp와 rpoA 유전자 951 bp의 염기서열을 분석한 결과, V. atlanticus Cmj 13.4 (FN582257)균주와 99.77%의 상동성을 나타내었다. Vibrio sp.
Glucose, mannitol 그리고 sucrose를 이용하여 산을 생성하였으며, glatin은 가수분해 되는 것으로 나타났다. Voges-Proskauer test에서 음성을, O/129에 대한 감수성은 양성으로 나타나 V. splendidus 혹은 V. cyclitrophicus와 유사한 생화학적 특징을 가지는 것으로 확인되었다(Table 2).
)에서 처음 분리되었으며 Ana 등(2011)이 다른 Vibrio균들과 비교한 내용을 보고하고 있다. 본 내용에서는 분리된 5균주의 생화학 test에 대한 결과를 보여주고 있는데, 이들의 생화학적 특징을 V. atlanticus TP01균주와 비교하였을 때, Voges-Proskauer test 와 Gelatin 가수 분해능에 대한 결과에서 차이를 나타내어 생화학 test 결과만으로 비교했을 때는 V. splendidus 혹은 V. cyclitrophicus와 유사한 결과를 보인 검사항목이 다수였다. Ana 등(2011)의 보고에서도 바지락에서 분리된 V.
본 연구에서의 질병발생 예는구백증과 같은 백색궤양이 주증상이지만 구백증과는 달리 주둥이에는 뚜렷한 증상이 없지만 등쪽 백색 궤양부 형성을 주 증상으로 하였다. 외부기생충이나 바이러스의 감염은 없었으며, 세균분석 결과 V. atlanticus가 순수하게 분리되었다.
해산어에서 주로 검출되는 바이러스 5종(RSIV, VHSV, VNNV, HRV 및 MBV)에 대한 PCR 분석을 실시한 결과, 모두 음성으로 확인되었다 (data not shown).

후속연구

atlanticus가 질병의 원인으로 분리, 보고된 예는 아직 없다. 원인조사에서 기생충이나 바이러스와 같은 다른 미생물학적 원인이 발견되지 않았고, 세균학적 검사에서 V. atlanticus가 순수하게 분리되어 본 궤양병의 주요 원인으로 판단하였으나, V. atlanticus는 앞에서도 언급한 것처럼 바지락에서 분리된 세균으로 아직은 잘 알려지지 않은 균종으로 병원성에 대한 증명이 필요할 것으로 보이며, 사료영양적인 영향이 복합적으로 작용했을 경우도 배제할 수 없으므로 다양한 접근으로 원인분석이 이루어져야 할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	자주복이란?	자주복, Takifugu rubripes(Temminck and Schle- gel)는 복어목(Order Tetraodontiformes), 참복과(Family Tetradontidae)에 속하는 품종으로(Abe. 1949), 우리나라를 비롯해 중국과 일본에서 주로 양식되고 있다. 자주복 양식은 일본에서 종묘의 인공생산이 성공한 이래로 지속·발전하고 있으며(Hujita et al, 1966), 중국에서는 최근 기대치가 높은 양식품종으로 각광받고 있다(Lin et al.
	양식 자주복에서 발생하는 질병에는 어떠한 것들이 있는가?	양식 자주복에서 주로 발생하는 질병으로는 양성시기의 구백증이 가장 잘 알려져 있으며, 그 외에도 황지병과 같은 영양성 질병, 트리코디나 등 외부 기생충 감염증이 있다. 자주복의 양식에서 나타나는 질병의 다수가 원인불명으로 보고되는 경우가 많은데 이런 경우는 사료영양과 관련성이 있을 것으로 추축되고 있다(NIFS, 2006; Nakanishi& Matsuura, 2016).
	우리나라에서 복어 양식이 줄어드는 이유는?	우리나라에서도 복어 양식이 시작되던 시기, 고급적인 이미지와 수익성으로 인해 그 가치를 인정받아 축양과 가두리 양식의 형태로 성행되었다(Han, 1999; NIFS, 2006). 그러나 양식이 까다롭고 중국에서 수입이 가능해 지면서 산업적 가치가 점점 줄어들고 있다. 또한 최근에는 경남, 제주지역에서 한정되어 양식되고 있으며 최근 2016년과 2017년도의 연간 생산량은 모두 21톤으로 타 양식어류와 비교하면 매우 낮은 수준이다(MOF, 2018).

참고문헌 (22)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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