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문제 정의
- 또한 산화적인 스트레스에 동반된 ROS 생성은 호중구와 대식세포를 염증부위로 이주시켜 염증 유발인자들의 생성을 추가적으로 촉진시킨다24,25. 따라서 LPS가 자극된 RAW 264.7 세포에서 청뇌명신환의 산화적 스트레스를 억제할 수 있는지의 여부를 ROD 생성 억제 효능으로 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 LPS가 처리된 RAW 264.
- 청뇌명신환(淸腦明神丸)은 인삼(人蔘), 당귀(當歸), 산약(山藥), 용안육(龍眼肉)과 녹용(鹿茸) 등의 한약재를 주재료로 하여 기억력 증진 및 치매 예방을 목적으로 만들어진 환이다. 본 실험에서는 LPS 자극에 의해 유도된 RAW 264.7 대식세포 모델에서 청뇌명신환이염증반응과 산화적인 스트레스를 억제할 수 있는지의여부를 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면, 청뇌명신환은 LPS 자극에 의해 증가된 iNOS 및 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰고, 이들로 유도된 염증 매개인자인 NO와 PGE2의 생성 또한 유의적으로 억제하였다.
- 본 연구에서는 LPS 자극에 의해 증가된 RAW 264.7 대식세포 모델에서 염증성 매개인자들의 생성 및 그들 조절 유전자들의 발현 변화를 측정하여 청뇌명신환의 항염증 효능을 조사하였다. 그람음성 세균의 세포벽 구성성분인 LPS는 대식세포에서 TLR4 수용체를 자극하여 염증성 매개인자와 염증성 사이토카인들의 생성시키는 것으로 알려져 있다14,15,16,17.
제안 방법
- 또한 NE-PER nuclear and cytosolic extraction reagents (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 핵과 세포질에서 단백질을 분리하였다. Bio-Rad 단백질 정량시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 그 사용방법에 따라 정량하여 단백질 농도를 결정하였고, 동량의 Laemilni sample buffer (Bio-Rad)와 혼합하여 sodium dodecyl sulphate(SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 이를 다시 polyvinylidene difluoride membrane(Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 전이시키고, 5% skim milk를 1시간 처리하여 비 특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다.
- 7 세포에서 염증성 지표인 NO 및 PGE2 함량을 측정하기 위하여 청뇌명신환을 농도별로 1시간 처리하였고, LPS (100 ng/ml)를 처리하여 24시간 배양한 후 세포 배양액을 수집하였다. LPS 자극에 의한 NO 생성에 미치는 청뇌명신환의 영향을 조사하기 위해서 세포 배양액과 동량의 Griess reagent (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 반응시켰으며, 540 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도 값을 측정한 후, sodium nitrite (NaNO2) 표준곡선을 이용하여 나타내었다. LPS 자극에 의한 PGE2 생성에 미치는 청뇌명신환의영향은 commercial ELISA kit (Cayman Chemical Co.
- )를 반응시켰으며, 540 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도 값을 측정한 후, sodium nitrite (NaNO2) 표준곡선을 이용하여 나타내었다. LPS 자극에 의한 PGE2 생성에 미치는 청뇌명신환의영향은 commercial ELISA kit (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, Michigan, USA)를 이용하여 측정하였으며, 제조사의 protocol에 따라 실험을 진행하였다.
- LPS만 처리했을 때 ROS 생성이 확연히 증가하였으며 추출물을 전처리하였을 때 ROS scavenger인 NAC 전처리 군과 유사하게 ROS 생성이 억제되는 것을 flowcytometer와 형광현미경을 이용하여 확인하였다(Fig. 5). 따라서 청뇌명신환이 항염증 효능 뿐 만 아니라 산화적인 스트레스를 억제하는 능력도 있음을 알 수 있었다.
- 또한 동일한 조건에서 mounting medium을 이용하여 chamber slide에 봉입한 후 형광현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 ROS 생성변화 여부를 관찰하였다. LPS에 의한 ROS 과다 생성이 산화적 스트레스와 연관성이 있는지 확인하기 위하여 청뇌명신환과 동일한 조건에서 N-acetylcysteine(NAC, Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 처리하여 그 효과를 비교하였다.
- RAW 264.7 세포에서 염증성 지표인 NO 및 PGE2 함량을 측정하기 위하여 청뇌명신환을 농도별로 1시간 처리하였고, LPS (100 ng/ml)를 처리하여 24시간 배양한 후 세포 배양액을 수집하였다. LPS 자극에 의한 NO 생성에 미치는 청뇌명신환의 영향을 조사하기 위해서 세포 배양액과 동량의 Griess reagent (Sigma-Aldrich Chemical Co.
- RAW 264.7 세포에서 청뇌명신환이 mRNA 수준에서 항염증 관련 유전자들의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 이를 위하여 청뇌명신환을 농도별로 1시간 처리 한 후, LPS (100 ng/ml)를 처리하여 24시간동안 배양하였고, TRIzol reagent(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다.
- iNOS primer(forward, 5‘-CGT GTT TAC CAT GAG GCT GA-3'and reverse, 5'-GCT TCA GGT TCC TGA TCCAA-3'), COX-2 primer (forward, 5'-CAA AGG CCT CCA TTG ACC AGA-3' and reverse, 5'-TGG ACG AGG TTT TTC CAC CAG-3')와 One-step RT-PCRPreMix kit (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi, Korea)를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 증폭된 DNA 산물은 ethidium bromide (EtBR, Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 1.5% agarose gel(Affymetrix, Inc., Cleveland, Phio, USA)에 전기 영동하여 UV 하에서 관찰하였다.
- 그후 10 μM의 DCF-DA 용액(Molecular Probes Inc., Leiden, Netherlands)을 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 20분 염색하였으며, flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose,CA, USA)를 이용하여 ROS 생성 변화 여부를 측정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 마우스 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 pro-inflammatory mediator의 발현을 확인하였고, 더 나아가서 염증과 관련된 신호전달경로인 nuclear factor-kappaB (NF-kB) 신호계와 강력한 항산화 활성 신호계로 잘 알려진 nuclear factor erythroid 2-related factor (Nrf)-2 activation/heme oxygenase (HO)-1 신호계에 미치는 청뇌명신환의 영향을 추가로 조사하였다.
- 5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet-P40(NP-40), 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride(PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 1시간 이상 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 상층액을 수거하였다. 또한 NE-PER nuclear and cytosolic extraction reagents (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 핵과 세포질에서 단백질을 분리하였다. Bio-Rad 단백질 정량시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 그 사용방법에 따라 정량하여 단백질 농도를 결정하였고, 동량의 Laemilni sample buffer (Bio-Rad)와 혼합하여 sodium dodecyl sulphate(SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다.
- 각 세포에 대한 세포 독성은 대조군 값을 기준으로 백분율로 계산하여 나타내었다. 또한 RAW 264.7 세포의 형태학적인 변형은 위상차 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
- , Leiden, Netherlands)을 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 20분 염색하였으며, flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose,CA, USA)를 이용하여 ROS 생성 변화 여부를 측정하였다. 또한 동일한 조건에서 mounting medium을 이용하여 chamber slide에 봉입한 후 형광현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 ROS 생성변화 여부를 관찰하였다. LPS에 의한 ROS 과다 생성이 산화적 스트레스와 연관성이 있는지 확인하기 위하여 청뇌명신환과 동일한 조건에서 N-acetylcysteine(NAC, Sigma-Aldrich Chemical Co.
- 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 본 실험에서는 2 mg/ml 농도까지 실험 조건으로 선정하여 추후 실험을 진행하였다(Fig. 1A). 또한 광학현미경을 이용해 청뇌명신환 처리에 따른 형태적 변화에 대해 확인해 본 결과, 청뇌명신환만 처리하였을 때 독성이 없는 조건에서 큰 변화를 확인하기가 어려웠지만, LPS를 처리하였을 때 증가하였던 대식세포의 활성이 농도 의존적으로 감소되는 결과를 확인하였다(Fig.
- 적정 1차 항체를 4℃에서 over night 반응시킨 다음 PBS-T (PBS with Tween 20)로 세척하였으며, 1차 항체에 맞는 2차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) solution(Thermo scientific, Meridian Rd., Rockford, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 실험에 사용된 1차 항체는 iNOS, COX-2, NF-κB p65, IκBα, Nrf2, HO-1, Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), actin과 lamin B이며, Santa Cruz Biotechnology, Inc.
- 배양이 끝난 다음 배지를 제거하고, dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co.))로 생성된 formazan을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.
- 본 연구에서는 청뇌명신환(淸腦明神丸, Cheongnoimyungshin-hwan, CNMSH)을 이용하여 항염증 실험을 진행하였다. 청뇌명신환은 인삼, 당귀, 산약, 용안육, 육계, 원지, 사향, 침향과 용뇌(중국)를 세말하고, 여기에 녹용과 부자를 5시간 정도 끊인 교(膠)와 꿀을 첨가한 후, 이를 4 g씩 오자대 크기로 75개 환을 만들어 금박으로 입힌 것으로 각 구성성분의 중량은 Table 1.
- Bio-Rad 단백질 정량시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 그 사용방법에 따라 정량하여 단백질 농도를 결정하였고, 동량의 Laemilni sample buffer (Bio-Rad)와 혼합하여 sodium dodecyl sulphate(SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 이를 다시 polyvinylidene difluoride membrane(Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 전이시키고, 5% skim milk를 1시간 처리하여 비 특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 적정 1차 항체를 4℃에서 over night 반응시킨 다음 PBS-T (PBS with Tween 20)로 세척하였으며, 1차 항체에 맞는 2차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 반응시켰다.
- 7 세포에서 청뇌명신환이 mRNA 수준에서 항염증 관련 유전자들의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 이를 위하여 청뇌명신환을 농도별로 1시간 처리 한 후, LPS (100 ng/ml)를 처리하여 24시간동안 배양하였고, TRIzol reagent(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. iNOS primer(forward, 5‘-CGT GTT TAC CAT GAG GCT GA-3'and reverse, 5'-GCT TCA GGT TCC TGA TCCAA-3'), COX-2 primer (forward, 5'-CAA AGG CCT CCA TTG ACC AGA-3' and reverse, 5'-TGG ACG AGG TTT TTC CAC CAG-3')와 One-step RT-PCRPreMix kit (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi, Korea)를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 증폭된 DNA 산물은 ethidium bromide (EtBR, Sigma-Aldrich Chemical Co.
대상 데이터
- RAW 264.7 세포에서 청뇌명신환이 항염증 및 산화적인 스트레스 억제 관련 유전자들의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실험조건에 따라 배양된 세포들의 단백질을 수집하였다. 각 세포들의 단백질을 분리하기 위하여 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.
- 실험에 사용된 1차 항체는 iNOS, COX-2, NF-κB p65, IκBα, Nrf2, HO-1, Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), actin과 lamin B이며, Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Cell Signalling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 마우스 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank,Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS, WELGENE Inc., Daegu, Korea)과L-glutamine (2 mM), penicillin (100 U/ml) 및 streptomycin (100 U/ml, WelGENE Inc.)이 첨가된Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM,WELGENE Inc.)을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 통계 프로그램을 이용하여 평균± 표준편차 (mean ± SD)로 나타내었으며, p<0.05수준에서 Student’s t-test와 Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 결과에 대한 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- RAW 264.7 대식세포에서 세포 증식에 미치는 청뇌명신환의 영향을 조사하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. 먼저 6 well plate에 배양된 RAW 264.
- RAW 264.7 세포에서 청뇌명신환이 LPS 자극에 의한 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) 염색법을 이용하였다.
성능/효과
- Fig. 4에 나타난 바와 같이 LPS 처리에 의해 핵에서의 NF-κB p65의 발현이 증가하였고 세포질 κB-α 의 발현이 억제되는 것을 확인 할 수 있었으며, 청뇌명신환을 동시 처리한 조건에서 회복되는 것을 관찰 할 수 있었다.
- Fig. 6에 나타낸 바와 같이, 청뇌명신환의 처리 농도 및 시간 증가에 따라 Nrf2 QNs만 아니라 HO-1의 단백질 발현이 증가하였으며, Nrf2의 억제 인자인 Keap1의 발현은 감소되었다. 이러한 결과는 청뇌명신환의 산화적인 스트레스 억제효능이 Nrf2/HO-1 신호계 활성화와 연관성이 있음을 의미하는 것이다.
- LPS 자극을 주었을 때 NO와 PGE2의 생성이 대조군에 비하여 매우 증가되었고, 청뇌명신환을 동시 처리조건에서는 농도 증가에 따라 유의적으로 감소되었다(Fig. 2A 및 B). 또한, NO와 PGE2의 생성에 관여하는 iNOS와 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현에 미치는 청뇌명신환의 영향을 Western blotting과 RT-PCR을 통해 조사한 결과, LPS 자극에 의하여 증가된 두 유전자의 발현이 추출물 전처리된 조건에서 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 결론적으로, 청뇌명신환은 염증성 매개인자의 생성 및 발현과 ROS 생성을 억제함으로써 항염증 효능 및산화적인 스트레스 억제 효능을 나타냈으며, 이 과정에서 NF-κB와 Nrf2/HO-1 신호전달 경로가 관여하고 있음을 알 수 있었다.
- 7 세포 내 ROS 축적을 차단시켰으며, 이는 Nrf2/HO-1 신호전달경로의 활성화와 연관성이 있었다. 따라서 청뇌명신환은 LPS 자극으로 인해 증가된 대식세포에서 염증매개인자의 발현 및 생성을 억제하여 항염증 효능을 나타냈으며, ROS 생성과 연관하여 Nrf2/HO-1 신호전달 경로의 활성화를 통해 산화적인 반응을 억제하였음을 알 수 있었다.
- 3A 및 B). 따라서 청뇌명신환은 iNOS와 COX-2의 발현을 차단함으로서 NO와 PGE2의 생성을 억제함을 알 수 있었다.
- 따라서 청뇌명신환이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에 의한 NF-κB 신호계의 활성을 차단할 수 있는지의 여부를 조사한 결과, LPS가 처리된 배지에서 배양된 RAW 264.7 세포의 핵에서 NF-κB subunit인 p65의 발현이 증가한 반면, 세포질에서는 NF-κB의 발현감소와 함께 IκB-α의 발현 또한 억제되었다.
- 따라서 청뇌명신환이 나타내는 염증성 매개 인자 생성 억제가 NF-κB 활성 억제를 통하여 일어남을 알 수 있었다.
- 5). 따라서 청뇌명신환이 항염증 효능 뿐 만 아니라 산화적인 스트레스를 억제하는 능력도 있음을 알 수 있었다.
- 1A). 또한 광학현미경을 이용해 청뇌명신환 처리에 따른 형태적 변화에 대해 확인해 본 결과, 청뇌명신환만 처리하였을 때 독성이 없는 조건에서 큰 변화를 확인하기가 어려웠지만, LPS를 처리하였을 때 증가하였던 대식세포의 활성이 농도 의존적으로 감소되는 결과를 확인하였다(Fig. 1B).
- 본 실험에서는 iNOS와 COX-2의 분비에 의해 유도되는 NO와 PGE2의 생성18,19에 미치는 청뇌명신환의 영향을 조사한 결과, 청뇌명신환이 LPS 자극에 의해 증가하였던 NO와 PGE2 생성량을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 청뇌명신환은 동일 조건에서 iNOS와 COX2의 발현을 감소시켰으며, 이는 청뇌명신환이 LPS에 의한 iNOS와 COX-2의 발현 증가를 차단함으로서 NO와 PGE2의 생성을 억제하였음을 의미한다.
- 2A 및 B). 또한, NO와 PGE2의 생성에 관여하는 iNOS와 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현에 미치는 청뇌명신환의 영향을 Western blotting과 RT-PCR을 통해 조사한 결과, LPS 자극에 의하여 증가된 두 유전자의 발현이 추출물 전처리된 조건에서 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A 및 B). 따라서 청뇌명신환은 iNOS와 COX-2의 발현을 차단함으로서 NO와 PGE2의 생성을 억제함을 알 수 있었다.
- 따라서 염증성 매개인자의 발현을 조절하는 것만으로도 염증을 억제할 수 있는 핵심 방안으로 이용될 수 있다. 본 실험에서는 iNOS와 COX-2의 분비에 의해 유도되는 NO와 PGE2의 생성18,19에 미치는 청뇌명신환의 영향을 조사한 결과, 청뇌명신환이 LPS 자극에 의해 증가하였던 NO와 PGE2 생성량을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 청뇌명신환은 동일 조건에서 iNOS와 COX2의 발현을 감소시켰으며, 이는 청뇌명신환이 LPS에 의한 iNOS와 COX-2의 발현 증가를 차단함으로서 NO와 PGE2의 생성을 억제하였음을 의미한다.
- 7 세포에서 청뇌명신환의 산화적 스트레스를 억제할 수 있는지의 여부를 ROD 생성 억제 효능으로 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서 ROS의 생성이 매우 증가하였음을 flow cytometry 및 형광현미경학적 분석을 통하여 확인하였으며, 이러한 산화적 스트레스의 유발이 청뇌명신환이 존재하는 조건에서 배양된 RAW 264.7 세포에서는 유의적으로 감소되었다. 이러한 현상은 양성 대조군으로 사용된 NAC 처리군에서도 유사하게 관찰되어, 청뇌명신환은 염증성 반응에 동반되는 산화적인 스트레스도 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
- 7 대식세포 모델에서 청뇌명신환이염증반응과 산화적인 스트레스를 억제할 수 있는지의여부를 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면, 청뇌명신환은 LPS 자극에 의해 증가된 iNOS 및 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰고, 이들로 유도된 염증 매개인자인 NO와 PGE2의 생성 또한 유의적으로 억제하였다. 이러한 효과는 청뇌명신환의 NF-κB subunit 중 하나인 p65의 발현 억제 및 NF-κB 전사요소 억제제인 IκB-α 발현 증가와 연관이 있었다.
- 일반적으로 Nrf2는 세포질에서 억제인자인 Keap1에 결합되어 있지만, 스트레스 등의 자극에 노출하게 되면 Keap1에서 떨어져 핵 내로 이동하여 세포를 보호하기 위하여 항산화 유전자들의 전사활성을 촉진시킨다30,31. 이에 근거하여 RAW 264.7대식세포 모델에서 청뇌명신환이 Nrf2/HO-1 신호계의 활성을 향상시킬 수 있는지의 여부를 조사한 결과, 청뇌명신환의 처리 시간 및 농도 의존적으로 Nrf2와HO-1의 발현이 증가하였으며, Keap1의 발현 억제가 동반되었다. 이러한 결과는 청뇌명신환의 항산화 활성이 최소한 Nrf2/HO-1 신호계의 활성을 통하여 이루어지고 있음을 보여주는 결과이다.
후속연구
- 결론적으로, 청뇌명신환은 염증성 매개인자의 생성 및 발현과 ROS 생성을 억제함으로써 항염증 효능 및산화적인 스트레스 억제 효능을 나타냈으며, 이 과정에서 NF-κB와 Nrf2/HO-1 신호전달 경로가 관여하고 있음을 알 수 있었다. 비록 두 신호전달경로에 대한 추가적인 규명과 동물 실험을 통한 항염증 및 힝산화 효능에 대한 연구가 더 필요하지만, 청뇌명신환이 기억력증진 및 치매예방 뿐만 아니라 항염증 및 항산화 효능 소재로서의 개발 가능성이 높음을 보여주었다.
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