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문제 정의
- 우리는 LRRK2의 상호작용 단백질을 찾는 두 번째 방향의 연구를 진행하여, Rab5, p53, Snapin이 LRRK2의 상호작용 단백질이면서 LRRK2 인산화효소의 기질임을 보고하였다[8, 20, 23, 24]. 이러한 연구의 연장으로 우리는 MRS (methionyl-tRNA synthetase)가 새로운 종류의 LRRK2의 상호작용 단백질임을 본 연구에서 보고하고자 한다. MRS는 아미노산인 메티오닌을 자신의 상보적인 tRNA에 붙여주는 효소로서 단백질 생합성을 위해 필수적인 효소이다[22].
가설 설정
- Over-expression of MRS or LRRK2 does not increase stability of the partner protein. (A) MRS over-expression does not increase LRRK2 stability. HEK293T cells were co-transfected with Myc-LRRK2 (LRRK2 WT) and increasing concentration (0.
- (B) Down-regulation of MRS expression by siMRS RNA transfection showed no effect on LRRK2 stability in NIH3T3 cells. (C) LRRK2 over-expression does not increase MRS stability. NIH3T3 cells were transfected with Myc-LRRK2-WT, -G2019S or vector in a dose-dependent manner (0, 1, 3 μg).
제안 방법
- 16,000 g로 10분 동안 원심 분리하여 상등액은 버리고 남은 bead를 dPBS 200 μl로 16,000g에 1분 동안 씻어주는 과정을 2번 더 반복한 후 1x protein loading sample buffer [50 mM Tris HCl (pH6.8), 2% SDS, 10% Glycerol, 0.1% bromophenol blue, 0.25% b-mercaptoethanol] 30 μl를 첨가한 후에 95도에서 10분 동안 끓여준 후 단백질 전기영동을 진행한 후 LRRK2와 MRS 항체를 이용 하여 단백질 상호작용을 확인하였다.
- 형질전환에는 lipofectamine 2000을 사용하였다. 48시간 배양한 후, MRS, LRRK2, a-tubulin 항체를 이용하여 세포의 각 단백질 양을 Western blot으로 측정하였다. MRS의 농도를 저하시키기 위해서 siMRS RNA (5’-CUAC CGCUGGUUUAACAUUUCGUUU-3’, STpharm, Korea)를 합성하여 이용하였다.
- LRRK2와 상호작용하는 단백질을 찾기 위해 LRRK2가 많이 발현하는 세포인 NIH3T3 세포를 이용하여 면역침강법을 시행하였다. IgG와 LRRK2 항체를 사용한 결과에서 LRRK2 항체에서만 특이적으로 침전된 밴드 중, 강한 단백질 밴드를 추출해 단백질의 질량분석을 의뢰하였다. 그 결과, MRS가 LRRK2 단백질과 같이 면역침강 된다는 것을 반복적으로 확인하였다 (Fig.
- LRRK2 단백질은 serine/threonine 인산화효소 활성을 가지고 있기 때문에 LRRK2에 의해 MRS가 인산화되는지를 확인하기 위해 방사선 동위원소, [γ32P]-ATP를 이용해 실험을 진행하였다.
- LRRK2와 MRS의 상호 작용이 3가지 다른 종류의 반복적인 실험에서 확인되었기 때문에 LRRK2가 MRS를 인산화시키는 가를 관찰하였다. 인산화효소는 세포 내 신호전달회로의 중요 한 조절인자이다[6].
- LRRK2와 상호작용하는 단백질을 찾기 위해 LRRK2가 많이 발현하는 세포인 NIH3T3 세포를 이용하여 면역침강법을 시행하였다. IgG와 LRRK2 항체를 사용한 결과에서 LRRK2 항체에서만 특이적으로 침전된 밴드 중, 강한 단백질 밴드를 추출해 단백질의 질량분석을 의뢰하였다.
- 5×106 cell)를 150 mm 세포 배양판에 배양 후 48시간 후에 세포 용해물을 이용하여 normal rabbit IgG (Santa Cruz, #sc-2027)와 LRRKK2 항체(MJFF2) 로 면역침강반응법을 사용하여 전기영동을 진행하였으며, 전기영동 완료된 gel을 Silver stain kit (Pierce, #24612)로 염색하여 단백질 밴드를 확인하였다. LRRKK2 항체로 침전한 샘플에만 존재하는 단백질 밴드를 잘라서 의약바이오컨버젼스연구단(수원)에 분석을 의뢰하여 동정한 단백질인 MRS를 LRRK2와 상호작용 하는 단백질로 연구하였다.
- MRS나 LRRK2 과발현을 위해 HEK293T 세포나 NIH3T3 세포(1×105 cell)를 각각 24 mm 세포 배양판에 24시간 배양 후 표시된 MRS나 LRRK2 플라스미드를 표시된 양을 사용하여 형질전환을 하였다.
- MRS의 농도를 저하시키기 위해서 siMRS RNA (5’-CUAC CGCUGGUUUAACAUUUCGUUU-3’, STpharm, Korea)를 합성하여 이용하였다.
- NIH3T3 세포(1×105 cell)를 24 mm 세포 배양판에 24시간 배양한 후 lipofectamin 2000으로 사용하여 200 nM siMRS를 형질주입하여 세포 내 MRS의 양을 줄여서 세포의 각 단백질 양을 Western blot으로 측정하였다.
- NIH3T3 세포(1.5×106 cell)를 150 mm 세포 배양판에 배양 후 48시간 후에 세포 용해물을 이용하여 normal rabbit IgG (Santa Cruz, #sc-2027)와 LRRKK2 항체(MJFF2) 로 면역침강반응법을 사용하여 전기영동을 진행하였으며, 전기영동 완료된 gel을 Silver stain kit (Pierce, #24612)로 염색하여 단백질 밴드를 확인하였다.
- NIH3T3 세포(5×105 cell)를 60 mm 세포 배양판에 48시간 배양한 후, Co-IP 버퍼 [20 mM Tris HCl (pH7.5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 5% glycerol, 1 mM DTT, 1x PIC (Gendepot, #P3100-050), 1x PhosStop (Roche, #04 906 845 001)] 500 μl로 세포를 용해 하여 16,000 g로 10분 동안 원심 분리하여 상등액을 분리하였다.
- 하지만 MRS위치에는 상대적으로 너무 약한 인산화 밴드가 보여서 인산화여부를 확신할 수 없었다. 그래서 다시 LRRK2의 양을 증가시켜서 인산화반응을 진행하였다. 그 결과, auto-radiography에서 MRS 밴드 위치에 아무런 밴드가 나타나지 않음을 반복적으로 확인하였다(Fig.
- 파킨슨병은 단백질의 응집에 의해 초래되는 대표적 질병의 하나이며, LRRK2는 autophagy 조절자로서 단백질 분해에 영향을 준다는 사실이 잘 알려져있다[13]. 그러므로 LRRK2와 MRS의 상호작용이 상대단백질의 안정성에 서로 영향을 주는가를 각 단백질의 과발현을 통하여 관찰하였다.
- 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하여 GST-MRS 단백질을 발현한 세포의 상등액을 NIH3T3 세포 용해물과 4도에서 반응시켜서 glutathione-sepharose (GE Healthcare, #17075601)로 분리하였다[19]. LRRK2가 GST-MRS와 같이 분리되었는지의 여부는 glutathione-sepharose로 분리된 단백질을 전기영동 후 Western blot 으로 확인하였다.
- 먼저 MRS 유전자의 형질전환과 siMRS RNA를 이용한 넉 다운(Knock-down)으로 MRS 단백질의 양을 각각 증가, 또는 감소시킨 HEK293T 세포에서 LRRK2 단백질의 변화를 확인해 보았다. Fig.
- 동일한 실험을 NIH3T3 세포에서도 수행하였으나 유의미한 변화는 없었다(data not shown). 이 결과를 확인하기 위하여, MRS siRNA를 이용하여 MRS의 양을 감소시켜서 LRRK2의 양을 관찰하였다. a-tubulin의 양을 control로 조정하여 LRRK2 양을 비교했을 때에 MRS의 양은 감소되었으나 LRRK2의 양적인 변화를 확인 할 수 없었다(Fig.
대상 데이터
- LRRK2 발현 벡터는 이미 보고하였다[20]. MRS의 포유 동물 및 대장균용 발현 벡터는 서울대학교 바이오컨버젼스센타의 김성훈교수로부터 받았다.
- Western blot에 사용한 항체는 MRS (Neomix #NMS-01-0003), LRRK2 (N241A [Neuro Mab #75-253], MJFF2 [Abcam #ab133474]), a-tubulin (Sigma #T9026), β-actin (Santa Cruz #sc-47778)이다.
- 본 연구는 NIH3T3나 HEK293T 세포에서 진행되었다. 이는 LRRK2의 내재적인 발현이 상대적으로 높은 NIH3T3 세포에서 단백질 상호작용이 관찰되었고, MRS의 산화스트레스에 관한 선행 연구결과[9]도 HEK293T 세포에서 진행되었기 때문이다.
- Western blot에 사용한 항체는 MRS (Neomix #NMS-01-0003), LRRK2 (N241A [Neuro Mab #75-253], MJFF2 [Abcam #ab133474]), a-tubulin (Sigma #T9026), β-actin (Santa Cruz #sc-47778)이다. 세포의 형질전환에는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen #11668-027)을 사용하였다. LRRK2 발현 벡터는 이미 보고하였다[20].
- 실험에 사용한 NIH3T3, HEK293T 세포는 10% FBS (Hyclone)와 1% Penicillin streptomycin (Invitrogen)이 포함된 DMEM High Glucose (Hyclone) 세포배양액으로 세포배양기 (5% CO2 및 37도) 에서 100 mm 세포 배양판 (SPL)에 배양하였으며 일주일에 3번 간격으로 0.05% trypsin-EDTA (Invitrogen)를 사용하여 계대배양하였으며, 실험에 사용한 세포 배양판은 24 well 세포 배양판(SPL)이다. Western blot에 사용한 항체는 MRS (Neomix #NMS-01-0003), LRRK2 (N241A [Neuro Mab #75-253], MJFF2 [Abcam #ab133474]), a-tubulin (Sigma #T9026), β-actin (Santa Cruz #sc-47778)이다.
- cell)를 각각 24 mm 세포 배양판에 24시간 배양 후 표시된 MRS나 LRRK2 플라스미드를 표시된 양을 사용하여 형질전환을 하였다. 형질전환에는 lipofectamine 2000을 사용하였다. 48시간 배양한 후, MRS, LRRK2, a-tubulin 항체를 이용하여 세포의 각 단백질 양을 Western blot으로 측정하였다.
이론/모형
- ΔN-GST-LRRK2 G2019S 재조합단백질(Invitrogen #PV4881) 을 대장균에서 분리한 His-MRS단백질을 기질로 사용하여 kinase assay를 보고된 방법을 따라 진행하였다[8].
성능/효과
- 인산화효소 활성이 증가된 LRRK2 G2019S 돌연변이가 파킨슨병 환자에서 발견됨으로 인해 LRRK2에 의해 인산화되는 기질의 세포 내 기능변화가 파킨슨병 발병에 중요한 요인이 될 것이라는 추론하에 LRRK2에 의해 인산화되는 기질 단백질의 규명과 인산화 후에 나타나는 기능변화에 LRRK2 연구의 초점이 모아지고 있다[8, 15, 23]. MRS는 과발현하지 않은, 세포에 내재하는 단백질이 LRRK2와 결합한다는 것이 확인되었으나(Fig. 1) LRRK2에 의해 인산화되지는 않는 것으로 관찰되었다(Fig. 2). 그래서 우리는 LRRK2, MRS 상호작용이 MRS의 다른 기능에 변화를 나타내는지를 관찰하였으나 한 단백질의 과발현은 다른 상대 단백질의 양을 변화시키지 못하였다(Fig.
- 2B). 결론적으로 MRS는 LRRK2의 인산화 기질이 아님을 확인하였다.
- IgG와 LRRK2 항체를 사용한 결과에서 LRRK2 항체에서만 특이적으로 침전된 밴드 중, 강한 단백질 밴드를 추출해 단백질의 질량분석을 의뢰하였다. 그 결과, MRS가 LRRK2 단백질과 같이 면역침강 된다는 것을 반복적으로 확인하였다 (Fig. 1A). 질량분석법에서 관찰된 것을 재확인하기 위해 NIH 3T3 세포 내에 있는 MRS와 LRRK2의 상호작용을 각 항체를 이용하여 검출하였으며, 그 결과, LRRK2와 MRS 단백질이 NIH3T3 세포 내에서 상호작용을 한다는 것을 확인하였다 (Fig.
- 그래서 다시 LRRK2의 양을 증가시켜서 인산화반응을 진행하였다. 그 결과, auto-radiography에서 MRS 밴드 위치에 아무런 밴드가 나타나지 않음을 반복적으로 확인하였다(Fig. 2B). 결론적으로 MRS는 LRRK2의 인산화 기질이 아님을 확인하였다.
- 1B). 또한 GST-pull down assay를 통하여서도 GST-MRS와 LRRK2 단백질이 상호작용 한다는 것을 확인하였다(Fig. 1C).
- 또한 MRS가 산화적 스트레스 환경에 노출되게 되면 extracellular signal- related kinase (ERK)에 의해 serine 잔기 209번과 825번의 인산화가 유도되며, 이에 인산화된 MRS는 aminoacylation 활성의 변화를 초래함으로써 산화적 스트레스에 의한 세포사멸을 감소시켜서 세포의 방어기전을 유도한다고 보고되었다[9]. 본 연구는 MRS의 비정형적인 기능으로, DNA 손상이나 산화스트레스에 대한 방어기전 외에도, 파킨슨병과의 연관된 기능이 있을 가능성을 시사하고 있다.
- 본 연구에서 MRS는 LRRK2와 상호작용은 하면서 인산화 효소 기질이 아닌 것으로 확인되었다. LRRK2는 LRR, WD40 이라는 두 개의 단백질 상호작용 도메인을 가지고 있기 때문에 많은 단백질과 상호작용하며 이들 단백질은 인산화효소의 기질인 단백질도 있으나, 아닌 것도 있음이 보고되었다[15].
- 1A). 질량분석법에서 관찰된 것을 재확인하기 위해 NIH 3T3 세포 내에 있는 MRS와 LRRK2의 상호작용을 각 항체를 이용하여 검출하였으며, 그 결과, LRRK2와 MRS 단백질이 NIH3T3 세포 내에서 상호작용을 한다는 것을 확인하였다 (Fig. 1B). 또한 GST-pull down assay를 통하여서도 GST-MRS와 LRRK2 단백질이 상호작용 한다는 것을 확인하였다(Fig.
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