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문제 정의
- 한국에서도 최근 수의학 분야의 여러 연구자들이 다양한 세균 및 바이러스성 병원체 진단을 위한 LAMP 및 RT-LAMP 기법을 개발하여 왔으나(Cho 등, 2005; Hwang 등, 2011; Koh 등, 2013; Dong 등, 2014; Kim 등, 2015; Kim 등, 2016; Park 등, 2016; Park 등, 2017) 아직 FMDV의 진단에는 응용된 바가 없다. 따라서 이 연구에서는 7개 혈청형의 FMDV를 공통적으로 진단할 수 있는 pan-serotype RT-LAMP (RT-LAMP) 진단법을 개발하여 FMDV 표준진단법으로 활용하고 있는 RT-PCR 및 qRT-PCR과 진단효율을 비교함으로써 국내 발생 FMDV에 대한 진단 효용성을 검토하였기에 보고한다.
- 이 연구를 통하여 민감도와 특이도가 높으면서도 신속하게 모든 혈청형의 FMDV를 진단할 수 있는 RT-LAMP 진단법을 개발하였다. 개발 RT-LAMP는 62℃에서 40분간 반응으로 진단이 완료되었으며, HNB를 이용함으로써 반응결과를 별다른 처리 과정 없이 바로 육안으로 판독할 수 있었다.
제안 방법
- 2 µM의 F3와 B3 primer를 첨가하여 반응액을 제조하였으며, 제조한 반응액에 검사시료에서 추출한 RNA 시료 5 µL를 첨가한 다음, 멸균증류수로 최종 용량을 25 µL로 조정하였다. FMDV RNA 검출에 적합한 최적 RT-LAMP 조건을 확립하기 위하여 국내분리주(O/Andong/KOR/2010) 배양액으로부터 추출한 RNA을 이용하여 반응온도 (56∼68℃)와 반응시간(20∼60분)을 달리하여 RT-LAMP를 실시한 다음, 80℃에서 5분간 처리하여 반응액 내의 효소 활성을 제거하였다. 반응이 끝난 다음, 육안으로 HNB의 작용에 의한 반응액의 색깔 변화(음성 보라색, 양성 연청색)를 관찰하여 결과를 판독하였으며(Goto 등, 2009), 동시에 2.
- FMDV의 혈청형간 염기서열의 차이에 따른 검출 한계 변화의 가능성을 염두에 두고 혈청형 O(O/Boeun/KOR/2017), A (A/Yeoncheon/KOR/2017) 및 Asia 1 (As1/Shamir/89) FMDV 배양액을 PBS (pH 7.2)로 106 TCID50/mL에서 10−1 TCID50/mL까지 10배수 단계희석한 다음, 100 µL씩 들어내어 시판 핵산 추출키트(Inclone biotech, Korea)를 이용하여 핵산을 추출하여 50 µL의 증류수에 용출하였고, 그 중 5 µL를 template로 사용하여 표준 RT-PCR과 qRT-PCR 및 개발 RT-LAMP를 각각 실시한 다음, 진단법간 검출한계를 비교하였다.
- PCR 증폭기(Biometra, Germany)를 이용하여 45℃에서 50분간 역전사반응을 거친 다음, 95℃에서 15분간 처리하였고, 35 회전의 PCR 과정(denaturation 95℃, 20초; annealing 55℃, 40초; extension 72℃, 45초)를 수행하였고, 72℃에서 5분간 최종 반응하였다. PCR 증폭산물은 NEO green 염색액(NEO science, Korea)을 첨가한 1.5% agarose gel에 전기 영동한 다음, 자외선판독기(Bio-Rad, USA)로 326 bp (O/SKR/JC/2014 국내분리주 대비)의 특이 밴드를 관찰하여 판독하였다.
- 개발 RT-LAMP 진단법의 특이도를 확인하기 위하여 Table 1에 제시된 11종의 FMDV 배양액, Seneca A virus 배양액 및 3종의 배양세포(BHK21, PK-15, Vero cell)로부터 시판 핵산추출키트(Inclone biotech, Korea) 를 이용하여 핵산을 추출한 다음, 개발된 RT-LAMP를 이용하여 확립된 조건으로 반응을 실시하였고, 전술한 방법으로 유전자 증폭 여부를 확인하였다.
- FMDV RNA 검출에 적합한 최적 RT-LAMP 조건을 확립하기 위하여 국내분리주(O/Andong/KOR/2010) 배양액으로부터 추출한 RNA을 이용하여 반응온도 (56∼68℃)와 반응시간(20∼60분)을 달리하여 RT-LAMP를 실시한 다음, 80℃에서 5분간 처리하여 반응액 내의 효소 활성을 제거하였다. 반응이 끝난 다음, 육안으로 HNB의 작용에 의한 반응액의 색깔 변화(음성 보라색, 양성 연청색)를 관찰하여 결과를 판독하였으며(Goto 등, 2009), 동시에 2.0% agarose gel에 전기영동을 실시한 다음, 자외선판독기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 LAMP 반응에서 특이적으로 나타나는 사다리 모양의 유전자 증폭 밴드를 확인하여 양성 여부를 판정하였다.
- 야외 FMDV 시료에 대한 개발 RT-LAMP의 진단효율을 평가하기 위하여 농림축산검역본부의 협조를 받아 O, A, Asia 1 혈청형 및 다양한 국내ㆍ외 FMDV 분리주 35주를 무작위로 공시하여 개발 RT-LAMP와 한국에서 현재 표준진단법으로 사용하고 있는 RT-PCR (Reid 등, 2000) 및 qRT-PCR (Callahan 등, 2002)을 각각 실시하여 진단효율을 비교하였다. 그 결과, 개발 RT-LAMP와 RT-PCR 및 qRT-PCR의 결과가 100% 일치하여 개발 RT-LAMP가 바이러스 시료 수준에서는 기존 PCR 기반 진단법을 충분히 대체할 수 있는 것으로 확인되었다(Table 3).
- 그간 RT-LAMP 개발자들은 7개 혈청형의 FMDV를 공통적으로 진단할 수 있는 특이 primer를 설계하기 위해 노력해왔으며, 일부는 2B 유전자(Chen 등, 2011a) 또는 P1 유전자(Madhanmohan 등, 2013)를 대상으로 설계하였으나 대부분은 FMDV의 유전자 중에서 가장 안정하다고 알려진 3D 유전자를 대상으로 공통진 단용 primer를 설계하여 진단법을 개발하여 왔다(Duke 등, 2006; Shao 등, 2010; Guan 등, 2013; Yamazaki 등, 2013; Waters 등, 2014; Farooq 등, 2015). 이 연구에서도 대부분의 연구자들이 선택한 3D 유전자를 대상으로 특이 primer를 설계하기로 하고, 2000년 이후 GenBank에 등록된 109개의 다양한 혈청형의 FMDV 3D 유전자 염기서열을 수집하여 분석한 다음, 가장 안정적인 유전자 부위를 탐색하여 6종의 FMDV 검출용 primer set를 설계 및 제작하였다(Table 2). 설계한 primer set를 이용하여 Table 1의 다양한 혈청형 및 지역형의 FMDV를 대상으로 RT-LAMP를 실시한 결과, 7개 혈청형의 FMDV RNA를 모두 증폭할 수 있었으며, 음성대조군에서는 증폭반응이 일어나지 않아 개발한 RT-LAMP용 primer set가 FMDV에만 특이적으로 작동할 뿐만 아니라 모든 혈청형의 FMDV를검출하는데 적합함을 확인하였다(Fig.
- 현재와 같은 국내 FMD 비발생 상황에서는 개발 RT-LAMP의 진단효율을 실제 야외시료를 대상으로 평가하기가 불가능하였기 때문에 차선책으로 농림축 산검역본부에서 보유하고 있는 국내ㆍ외 FMDV 배양시료 35점(O 혈청형 21주, A 혈청형 10주, Asia 1 혈청형 3주 및 C 혈청형 1주)을 대상으로 진단효율을 평가하였다. 평가의 공정성을 확보하기 위하여 농림 축산검역본부의 차폐실험실에서 추출한 각 바이러스의 RNA 시료를 내역을 알 수 없도록 무작위로 선발하여 이 연구의 평가팀에 제공하였고, 평가팀에서는 별도의 실험실에서 내역을 알지 못하는 상태에서 각 RNA시료를 대상으로 RT-PCR, qRT-PCR 및 개발 RT-LAMP를 각각 실시하여 그 결과를 비교하였다.
- 현재와 같은 국내 FMD 비발생 상황에서는 개발 RT-LAMP의 진단효율을 실제 야외시료를 대상으로 평가하기가 불가능하였기 때문에 차선책으로 농림축 산검역본부에서 보유하고 있는 국내ㆍ외 FMDV 배양시료 35점(O 혈청형 21주, A 혈청형 10주, Asia 1 혈청형 3주 및 C 혈청형 1주)을 대상으로 진단효율을 평가하였다. 평가의 공정성을 확보하기 위하여 농림 축산검역본부의 차폐실험실에서 추출한 각 바이러스의 RNA 시료를 내역을 알 수 없도록 무작위로 선발하여 이 연구의 평가팀에 제공하였고, 평가팀에서는 별도의 실험실에서 내역을 알지 못하는 상태에서 각 RNA시료를 대상으로 RT-PCR, qRT-PCR 및 개발 RT-LAMP를 각각 실시하여 그 결과를 비교하였다.
대상 데이터
- 7개 혈청형의 FMDV를 특이적으로 증폭할 수 있는 RT-LAMP용 primer set를 설계하기 위하여 2000년 이후 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 GenBank database에 등록된 FMDV의 3D polymerase 유전자 염기서열 정보 중에서 혈청형별로 지역형및 유전형이 고루 포함되도록 하여 총 109개(O 혈청형 57, A 혈청형 21, Asia 1 혈청형 14, C 혈청형 2, SAT1 혈청형 5, SAT2 혈청형 7 및 SAT3 혈청형 3)의 유전자염기서열 정보를 수집하였다. 수집된 유전자염기서열을 DNASTARⓇ Lasergene (DNASTAR, Inc, USA) 프로그램으로 비교분석하여 가장 안정적인 부위를 선발한 다음, LAMP용 primer 설계 프로그램인 PrimerExplorer V4 software (http://primerexplorer.
- 국내분리주, 백신주 및 외국분리주를 포함한 총 11주의 FMDV를 농림축산검역본부의 협조를 받아 시험에 공시하였다(Table 1). O 혈청형은 한국에서 발생한 바 있는 SEA (South-East Asia) 지역형에 속하는 국내분리주 1주(O/Andong/KOR/2010)와 ME-SA (Middle East-South Asia) 지역에 속하는 국내분리주 1주(O/ Boeun/KOR/2017) 및 백신주 1주(O/Manisa/Turkey/69)를 공시하였다.
이론/모형
- RT-PCR은 농림축산검역본부에서 FMDV의 혈청형 공통진단용으로 사용하고 있는 Reid 등(2000)의 RT-PCR방법을 준용하여 FMDV의 5’UTR 유전자 부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 primer set를 이용하여 시판 IncloneTM one-step RT-PCR 키트(Inclone biotech, Korea)를 이용하여 실시하였다(Table 2). 12.
- qRT-PCR은 농림축산검역본부에서 FMDV 혈청형 공통진단용 표준진단법으로 사용하고 있는 Callahan 등(2002)의 방법을 준용하여 FMDV의 3D polymerase gene을 검출할 수 있는 AccuPowerⓇ FMDV Real-Time RT-PCR MasterMix Kit (Bioneer, Korea)와 CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)을 사용하여 실시하였다(Table 1). 44.
- 또한 LAMP 반응산물의 탁도 변화를 관찰하여 판독하는 방법은 실험자에 따라 판독에 오류를 유발할 가능성 있어 문제점으로 지적되어 왔다(Zhang 등, 2014). 이 연구에서는 Goto 등(2009)과 Farooq등(2015)이 보고한 HNB를 사전에 반응액에 첨가하여 반응결과를 육안으로 판독하는 방법을 이용하였으며, 그 결과, Fig. 2와 같이 음성인 보라색과 양성인 연청색의 반응액 색깔 변화를 육안으로 바로 판독할 수 있었다.
성능/효과
- 개발 RT-LAMP는 62℃에서 40분간 반응으로 진단이 완료되었으며, HNB를 이용함으로써 반응결과를 별다른 처리 과정 없이 바로 육안으로 판독할 수 있었다. 개발 RT-LAMP는 7개 혈청형의 FMDV RNA를 모두 증폭한 반면에 유사 바이러스와 배양세포 대조군에서는 증폭반응이 일어나지 않아 모든 혈청형의 FMDV에 대하여 특이적으로 반응함을 확인하였다. 개발 RT-LAMP의 검출 한계는 O, A 및 Asia 1 혈청형의 FMDV에 대하여 각각 102 , 103 and 103 TCID 50/mL로 기존의 RT-PCR에 비해 유사하거나 높았으며, qRT-PCR에 비해서는 다소 낮았다.
- 개발 RT-LAMP의 검출한계를 확인하기 위하여 O, A, 및 Asia 1 혈청형의 FMDV를 대상으로 RT-LAMP를 실시한 결과, 개발 RT-LAMP의 검출한계는 공시 바이러스(혈청형)에 따라 차이가 있었으며, 현재 한국에서 표준진단법으로 사용하고 있는 RT-PCR의 민감도와 비교하였을 때 O 및 A 혈청형의 FMDV에 대해서는 10배 더 민감한 반면에 Asia 1 혈청형에 대해서는 10배 낮았다. 또한 qRT-PCR의 민감도에 비해서는 개발 RT-LAMP의 민감도가 O 및 A 혈청형에 대해서는 10배 낮았으나 Asia 1 혈청형에 대해서는 동일한 민감도를 나타내었다(Fig.
- 개발 RT-LAMP의 특이도를 확인하기 위하여 FMDV 11주와 Seneca A virus 및 3종의 배양세포에서 추출한 핵산을 이용하여 개발된 RT-LAMP를 실시한 결과, 전체 11주의 FMDV 시료에서 모두 육안 및 전기영동으로 양성 증폭산물이 확인되었으며, Seneca A virus 및 배양세포 대조군에서는 증폭산물이 확인되지 않아 개발된 RT-LAMP가 모든 혈청형의 FMDV 3D 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있음을 확인하였다(Fig. 2).
- 국내ㆍ외 FMDV 분리주 총 35주(O 혈청형 21주, A 혈청형 10주, Asia 1 혈청형 3주 및 C 혈청형 1주)를 대상으로 개발 RT-LAMP와 표준 RT-PCR 및 qRT-PCR 을 실시하여 진단효율을 비교한 결과, 개발 RT-LAMP 와 RT-PCR 및 qRT-PCR 공히 공시한 FMDV 시료에서 모두 양성반응을 나타내어 개발 RT-LAMP가 표준 RT-PCR이나 qRT-PCR과 동일하게 공시한 O, A 및 Asia 1 혈청형의 FMDV를 특이적으로 진단할 수 있음을 확인하였다(Table 3).
- 개발 RT-LAMP의 검출 한계는 O, A 및 Asia 1 혈청형의 FMDV에 대하여 각각 102 , 103 and 103 TCID 50/mL로 기존의 RT-PCR에 비해 유사하거나 높았으며, qRT-PCR에 비해서는 다소 낮았다. 국내ㆍ외 다양한 혈청형의 FMDV를 대상으로 개발 RT-LAMP와 RT-PCR 및 qRT-PCR을 실시한 결과, 개발 RT-LAMP는 공시한 모든 혈청형의 FMDV를 모두 특이적으로 검출하였으며, RT-PCR 및 qRT-PCR의 결과와 100% (35/35) 일치하였다. 개발 RT-LAMP는 등온조건하에서 비교적 짧은 시간에 검사가 완료되기 때문에 기존의 RT-PCR이나 qRT-PCR 을 대체할 수 있는 FMDV 진단법으로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 야외 FMDV 시료에 대한 개발 RT-LAMP의 진단효율을 평가하기 위하여 농림축산검역본부의 협조를 받아 O, A, Asia 1 혈청형 및 다양한 국내ㆍ외 FMDV 분리주 35주를 무작위로 공시하여 개발 RT-LAMP와 한국에서 현재 표준진단법으로 사용하고 있는 RT-PCR (Reid 등, 2000) 및 qRT-PCR (Callahan 등, 2002)을 각각 실시하여 진단효율을 비교하였다. 그 결과, 개발 RT-LAMP와 RT-PCR 및 qRT-PCR의 결과가 100% 일치하여 개발 RT-LAMP가 바이러스 시료 수준에서는 기존 PCR 기반 진단법을 충분히 대체할 수 있는 것으로 확인되었다(Table 3). 그러나 개발 RT-LAMP의 현장 진단법으로서의 활용 가능성을 확인하기 위해서는 향후 다양한 야외의심시료에 대한 추가 검증이 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 이 연구에서도 대부분의 연구자들이 선택한 3D 유전자를 대상으로 특이 primer를 설계하기로 하고, 2000년 이후 GenBank에 등록된 109개의 다양한 혈청형의 FMDV 3D 유전자 염기서열을 수집하여 분석한 다음, 가장 안정적인 유전자 부위를 탐색하여 6종의 FMDV 검출용 primer set를 설계 및 제작하였다(Table 2). 설계한 primer set를 이용하여 Table 1의 다양한 혈청형 및 지역형의 FMDV를 대상으로 RT-LAMP를 실시한 결과, 7개 혈청형의 FMDV RNA를 모두 증폭할 수 있었으며, 음성대조군에서는 증폭반응이 일어나지 않아 개발한 RT-LAMP용 primer set가 FMDV에만 특이적으로 작동할 뿐만 아니라 모든 혈청형의 FMDV를검출하는데 적합함을 확인하였다(Fig. 2).
- 분석한 FMDV의 혈청형및 지역형간 유전적 다양성 때문에 일부 바이러스의 경우, primer 결합부위의 염기서열이 일치하지 않았으며, 이를 보완하기 위하여 해당 염기서열은 Table 2 와 같이 적절히 변성시켜 가능한 모든 FMDV를 검출할 수 있도록 하였다. 설계한 primer 염기서열들에 대하여 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통하여 특이도를 검증한 결과, FMDV의 3D 유전자와 특이적으로 반응함이 확인되었다. 설계한 primer set는 primer 제조업체(Bioneer Co, Korea)에 의뢰하여 합성하였다(Table 2).
후속연구
- 국내ㆍ외 다양한 혈청형의 FMDV를 대상으로 개발 RT-LAMP와 RT-PCR 및 qRT-PCR을 실시한 결과, 개발 RT-LAMP는 공시한 모든 혈청형의 FMDV를 모두 특이적으로 검출하였으며, RT-PCR 및 qRT-PCR의 결과와 100% (35/35) 일치하였다. 개발 RT-LAMP는 등온조건하에서 비교적 짧은 시간에 검사가 완료되기 때문에 기존의 RT-PCR이나 qRT-PCR 을 대체할 수 있는 FMDV 진단법으로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 그 결과, 개발 RT-LAMP와 RT-PCR 및 qRT-PCR의 결과가 100% 일치하여 개발 RT-LAMP가 바이러스 시료 수준에서는 기존 PCR 기반 진단법을 충분히 대체할 수 있는 것으로 확인되었다(Table 3). 그러나 개발 RT-LAMP의 현장 진단법으로서의 활용 가능성을 확인하기 위해서는 향후 다양한 야외의심시료에 대한 추가 검증이 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 이는 이전 연구자들이 개발한 FMDV 진단용 RT-LAMP의 민감도가 전반적으로 RT-PCR보다는 높고, qRT-PCR보다는 낮거나 유사하다는 보고와 일치하였다(Duke 등, 2006; Shao 등, 2010; Chen 등, 2011a; Guan 등, 2013; Waters 등, 2014; Farooq 등, 2015). 그러나 일부 보고자들이 개발한 RT-LAMP의 민감도가 qRT-PCR에 비해 높았다는 보고도 있어(Yamazaki 등, 2013) 향후 개발 RT-LAMP의 민감도를 개선하는 추가 연구가 필요하다고 생각된다. 한편 Fig.
- 3의 결과에서 보듯이 개발 RT-LAMP와 RT-PCR 및 qRT-PCR의 민감도는 공시 바이러스(혈청형)에 따라 10∼100배 차이가 나기 때문에 개발자가 어떤 바이러스를 대상으로 진단의 민감도를 검증하는가에 따라 결과가 달라질 수가 있다. 따라서 향후 다양한 표준 바이러스를 이용하여 기 개발된 진단법들의 민감도를 비교 검증하는 연구도 필요할 것으로 생각된다. 또한 적용 진단법별로 공시 바이러스에 따른 검출 민감도가 각기 다르게 나타나는 것이 확인되어 향후 야외 시료에 대한 FMDV 검사 시에는 1종 이상의 진단법을 동시에 적용하는 것이 진단의 정확도를 높일 수 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 향후 다양한 표준 바이러스를 이용하여 기 개발된 진단법들의 민감도를 비교 검증하는 연구도 필요할 것으로 생각된다. 또한 적용 진단법별로 공시 바이러스에 따른 검출 민감도가 각기 다르게 나타나는 것이 확인되어 향후 야외 시료에 대한 FMDV 검사 시에는 1종 이상의 진단법을 동시에 적용하는 것이 진단의 정확도를 높일 수 있을 것으로 생각된다.
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