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문제 정의
- 다시 말해, 실제로 피부 세포 및 조직에서 나타나는 다양한 종류의 활성산소종 생성 시스템인 Fe3+-EDTA/H2O2계에서의 총 항산화능 평가나 광노화의 중요한 실험 모델 중 하나인 광증감 반응으로 생성되는 1O2 등의 활성산소에 의해 개시되는 세포막 파괴와 세포 손상에 대한 세포 보호 효과에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 상기에 제시된 항산화능 평가와 함께 피부 각질 형성 세포인 HaCaT 세포에서 과산화수소 및 자외선으로 유도된 산화적 스트레스에 대한 인동덩굴 추출물 및 분획물에 대한 세포 보호 효과를 조사하였다.
- 본 연구는 피부 광노화에서 중요한 항산화 평가법을 이용하여 식물유래 천연 항산화제로서 인동덩굴의 각종 ROS에대한 항산화능을 재평가함으로써 화장품에서 꼭 필요한 항산화 기능성 화장품 소재로서 개발 가능성이 있는지를 확인하고자 하였다.
- 본 실험에서는 Fenton 반응에 의해 생성 된H2O2 , O2·− , ·OH와 같은 활성산소 소거능과 활성산소 생성 억제의 중요 수단인 킬레이팅 효과를 동시에 평가하여 총체적인 활성산소 소거능을 확인할 수 있다.
- 또한 세포막의 지질과산화반응을 개시하여 세포 손상을 촉진시킨다[14]. 따라서 본 실험법에서는 광증감제인 rose-bengal과 적혈구 세포를 이용하여 인동덩굴의 피부 광노화에서의 항산화능 및 세보 보호 효과를 평가하였다. 특히, 적혈구는 철을 함유하고 있어 암반응 상태에서도 Fenton 반응에 의한 다양한 ROS를 생성하고 세포막 및 구성 성분을 파괴시키기 때문에 천연물의 항산화 활성을 평가하는데 적합하였다.
제안 방법
- 이 여액을 감압 건조하여 분말을 얻었다. 항산화 효능을 나타내는 활성 물질을 효과적으로 추출하기 위해 50% 에탄올 추출물을 중간 정도의 극성을 갖는 에틸아세테이트로 3회 분획하였다. 에틸아세테이트 분획을 감압 · 농축하여 파우더를 얻었다.
- 대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2 와 FeCl3·6H2O 대신 증류수를 첨가하였다.
- 인동덩굴 추출물 및 분획물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈 정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
- 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광 등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한후 15 min 동안 광조사하였다.
- 시료를 농도별로 각각 50 μl씩 첨가하고 암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal (13 μM) 0.5 ml를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min동안 광조사하였다.
- 2 mM DPPH 용액 1 ml에 에탄올 1 ml를 첨가하고 여러 농도의 인동덩굴 추출물 1 ml를 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하였다. 자유 라디칼 소거활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도 (free radical scavenging activity, FSC50, μg/ml)로서 표기 하였으며, 자유 라디칼(DPPH) 소거활성(%)을 계산하는데 사용한 식은 다음과 같다.
- 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광 등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한후 15 min 동안 광조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴 정도를 15 min간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈 정도에 비례한다.
- 인동덩굴 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물이 각질 형성 세포인 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-di-phenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) assay를 이용하여 실험에 사용될 시료의 농도 범위를 결정하였다. 96-well plate에 1 × 104 cells/well로 분주하여 60−80%까지 배양하였다.
- 세포 내 ROS 소거활성 평가는 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate H2DCF-DA)를 사용하여 fluorescence를 측정하는 방법을 이용하였다.
- 인동덩굴 추출물 중 에틸아세테이트 분획물을 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milliopore 0.45 μm)를 이용하여 여과한 후 여과된 추출물 용액을 이용하여 극성 TLC (normal phase) 및 비극성 HPLC (C18) 분석에 이용하였다.
- 20 μM H2DCF-DA로 30 min 동안 37℃에서 처리한 후, CL-1000 ultraviolet crosslinker를 이용하여 DPBS 상태에서 200 mJ/cm2 UVB를 조사하여 세포 내 ROS를 생성시킨 직후, fluorescence ELISA reader (excitation, 490 nm emission, 530 nm) 기기를 통하여 형광의 세기를 측정하였다.
- TLC 분석 시 사용한 전개 용매는 Table 1에 나타내었다. 성분은 이미 보고된 분광학적 자료, 표준물질의 Rf 값과 자외선 및 NP-PEG (natural products-polyethylene glycol, 2-aminoethyl diphenylborinate) 발색법을 이용한 띠의 색상 등을 통해 확인하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 수용액과 0.
- 성분은 이미 보고된 분광학적 자료, 표준물질의 Rf 값과 자외선 및 NP-PEG (natural products-polyethylene glycol, 2-aminoethyl diphenylborinate) 발색법을 이용한 띠의 색상 등을 통해 확인하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 수용액과 0.5% acetic acid를 함유한 50% acetonitrile 수용액을 이용해 기울기 용리법으로 분석하였고, HPLC 분리조건은 Table 2에 나타내었다.
- 총 항산화능(ROS scavenging concentration, OSC50 )은 활성산소로부터 전자를 받은 luminol이 에너지를 방출하면서 내뿜는 420−450 nm 의 빛을 측정하여 평가하였다[4].
- 그 후 포화 Na2CO3 용액(2% w/v) 200 μl를 첨가하여 혼합하고 25℃에서 30 min 반응시킨 후 ELISA reader (Tecan, Austraia)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. Caffeic acid를 표준 물질로 하여 농도별 표준곡선을 작성한 후, 총 페놀성 화합물 함량을 측정하였다.
- 이 용액에 AlCl3 (10% w/v) 9 μl를 넣고, 1 min 후 NaOH (1 M) 60 μl와 증류수 72 μl를 첨가한 뒤 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로 luteolin을 이용하여 표준 곡선을 작성한 후, 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.
- 자외선 조사로 인해 생성되는 활성산소 중 라디칼을 보유하고 있는 것은 반응성이 높기 때문에 세포막과 결합하여 지질과산화반응을 개시할 수 있다. 이 때 라디칼에 전자를 제공하여 라디칼을 소거할 수 있는데 이러한 환원력을 이용하여 시료의 자유 라디칼 소거활성(free radical scavenging concentration, FSC50)을 측정하였다[6].
- 본 실험에서는 비교적 안정한 라디칼인 DPPH를 이용하여 인동덩굴의 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 라디칼 소거활성을 측정하였다. 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol을 대조군으로 라디칼 소거능을 비교했을 때, 자유 라디칼이 50% 소거되는 농도인 FSC50은 인동덩굴 50% 에탄올 추출물에서 152.
- 0.4−400.0 μg/ml 농도의 인동덩굴 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 HaCaT 세포에 24 h처리 후 세포 생존율을 확인하였다.
- 이를 바탕으로 본 실험에서는 인동덩굴 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 최고 농도를 12.5 μg/ml으로 설정하였다.
- MTT assay를 통해 인동덩굴 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 각질 형성 세포인 HaCaT 세포에 대한 독성을 확인함으로써 앞으로의 실험에 사용될 시료의 농도 범위를 결정하였다. 0.
- 그러므로 세포 내 ROS 억제 작용이 있는 항산화 물질은 피부 노화를 억제할 수 있다. 따라서 인동덩굴 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 각질 형성 세포 내 UVB로 유도된 ROS 소거 활성을 H2DCF-DA를 이용하여 측정하였다.
-
인동덩굴 추출물의 TLC 및 HPLC 성분 분석.
- 9에 나타내었다. HPLC 크로마토그램의 peak를 동정하기 위해 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 추출 및 여과하고 용매를 감압 건조시켜 파우더를 얻은 뒤, 에탄올로 녹여서 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. HPLC 분석 결과, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물의 TLC 크로마토그램에서의 LJT1 (Rf 0.
-
인동덩굴 추출물의 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량 측정.
- 페놀성 화합물 및 플라보노이드는 뛰어난 항산화 효능을 나타내는 물질로, 천연물의 항산화능에 매우 중요한 역할을 하는 성분 중 하나이다. 앞서 TLC와 HPLC를 통해 확인한 caffeic acid, luteolin을 포함한 페놀성 화합물 및 플라보노이드의 함량을 확인하기 위해 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 측정 결과는 Table 4에 나타내었다.
대상 데이터
- HPLC는 Shim-pack VP-ODS C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) (Shimadzu, Japan) 제품을 사용하였다.
- 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, apigenin, caffeic acid, coumaric acid, luteolin은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다.
- 기타 FeCl3 · 6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
- Free radical 소거 활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), EDTA, luminol, Folinciocalteu’s phenol reagent은 Sigma chemical Co. (USA)에서 구입하였다.
- (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다. 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, apigenin, caffeic acid, coumaric acid, luteolin은 Sigma Chemical Co.
- (USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 인동덩굴은 2017년 4월 서울 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 인동덩굴은 Fig. 1과 같은 방법으로 추출 및 분획을 실시하였다. 건조된 인동덩굴 400 g을 잘게 분쇄 하여 50% 에탄올 8 L에 24 h 동안 침적시킨 후 여과하였다.
- 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D. 값이 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 10 7 cells/ml이었다.
- 적혈구 현탁액 제조. 적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 1,518×g으로 5 min 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
- 각질 형성 세포인 HaCaT 세포주는 CLS Cell Line Service GmbH (Eppelheim, Germany)에서 얻어 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin/streptomycin (P/S)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하였고 통계자료의 값은 mean ± SD 로 표시하였다.
- 통계적 유의성 검증은 GraphPad Prism 5.0 (USA) 프로그램을 이용하였으며, Student’s t-test 및 oneway ANOVA 검정을 적용하여 p < 0.05 또는 p < 0.01 유의수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
- # p < 0.05 1 μg/ml versus 5 μg/ml of 50% EtOH extract by Student’s t-test.
- ap < 0.05 compared with H2O2 treated control in 50% EtOH extract dose-treated groups by one-way ANOVA, bp < 0.05 compared with H2O2 treated control in EtOAc fraction dose-treated groups by one-way ANOVA.
- ap < 0.05 compared with UVB treated control in 50% EtOH extract dose-treated groups by oneway ANOVA, bp < 0.05 compared with UVB treated control in EtOAc fraction dose-treated groups by one-way ANOVA.
이론/모형
- DPPH법을 이용한 Free Radical 소거활성. DPPH법은 시료의 라디칼 소거능을 평가할 수 있는 실험법으로서, 비교적 안정한 라디칼인 DPPH에 대한 전자주게능을 통하여 시료의 환원력을 측정하는 실험법이다.
- 인동덩굴 추출물의 총 페놀성 화합물 함량 측정은 Alves 등의 방법을 이용하였다[23]. 추출물 80 μl에 Folin-Ciocalteu 시약(50% v/v)을 20 μl를 첨가한 다음, 25℃에서 5 min 동안 반응시켰다.
- 인동덩굴 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등의 방법을 이용하였다[24]. 추출물 30 μl에 증류수 120 μl를 첨가한 다음, NaNO2 (25% w/v) 9 μl를 넣고 25℃에서 5 min 동안 반응시켰다.
- 본 실험법은 다양한 ROS를 생성하는 Fe3+-EDTA/H2O2 계에서 Fenton 반응을 이용한 항산화능 평가법이다. 본 실험에서는 Fenton 반응에 의해 생성 된H2O2 , O2·− , ·OH와 같은 활성산소 소거능과 활성산소 생성 억제의 중요 수단인 킬레이팅 효과를 동시에 평가하여 총체적인 활성산소 소거능을 확인할 수 있다.
- 50% EtOH extract and EtOAc fraction treatment on HaCaT cell viability. HaCaT cells were treated with various concentrations of samples for 24 h and cell viability was determined using the MTT assay. Data are presented as the mean ± SD.
- 8은 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물의 TLC 크로마토그램이며, 크게 6개의 띠로 분리되었다. 이 중 4개의 띠를 UV 및 NPPEG 발색법을 이용해 확인하였다. 실험 결과, Rf 값이 0.
성능/효과
- 수율은 건조된 인동덩굴(400 g)을 기준으로 계산하였다. 건조된 인동덩굴의 50% 에탄올 추출물은 4.85%, 에틸아세테이트 분획은 0.41%로 나타났다.
- 세척 후, 무혈청 배지로 바꿔 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 배양하였다. 24 h incubation후, MTT assay로 세포 생존율을 확인하여 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 분획물의 세포 보호 효과를 확인하였다.
- 따라서 인동덩굴 추출물의 자유 라디칼 소거활성은 (+)-α-tocopherol (FSC50 , 8.98 μg/ml)보다 높지 않았으며, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물이 50% 에탄올 추출물보다 통계적으로 유의하게 약 2배높은 자유 라디칼 소거능을 나타냄을 확인하였다.
- 95 μg/ml)와 비교하여도 높은 항산화능을 가지고 있음을 알 수 있다. 특히, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 50% 에탄올 추출물과 비교하여 약 4배 높은 항산화 효능을 나타내었으며, L-ascorbic acid보다 월등히 높은 항산화 효능을 가지고 있음을 확인하였다. L-Ascorbic acid와 비교하여 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물은 모두 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다.
- 본 실험에서는 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간(τ50 , min)을 측정하여 세포 보호 효과를 평가하였으며 세포 보호 효과가 클수록 값이 크게 나타났다.
- 또한, 1 μg/ml의 농도에서 인동덩굴 에틸아세테이트 분획은 50% 에탄올 추출물보다 약 2배 높은 세포 보호 효과를 나타내었으며 이는 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(Fig. 4).
- 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 1 μg/ml의 농도에서 가장 높은 세포 보호 효과를 나타내었으며, 동일한 농도의 (+)-α-tocopherol (31.1 min)과 비교하였을 때 매우 높은 세포 보호 효과를 나타내었다.
- 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물 또한 농도 의존적으로 세포 보호 효과가 나타났으나, 5 μg/ml의 농도에서 세포 보호 효과가 약간 감소하였고 10 μg/ml의 고농도에서는 세포 보호 효과가 현저히 감소하였다.
- 인동덩굴 50% 에탄올 추출물은 10 μg/ml의 농도에서 가장 높은 세포 보호 효과를 나타내었으며 동일한 농도에서 비교 물질로 사용한 지질과산화 연쇄 반응의 차단제인 지용성 항산화제 (+)-α-tocopherol (37.5 min)보다도 높은 세포 보호 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
- 인동덩굴 50% 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 세포 보호 효과가 증가하는 경향을 나타내었지만 25 μg/ ml의 고농도에서는 세포 보호 효과가 약간 감소하였다.
- 특히, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 50% 에탄올 추출물과 비교하여 약 4배 높은 항산화 효능을 나타내었으며, L-ascorbic acid보다 월등히 높은 항산화 효능을 가지고 있음을 확인하였다. L-Ascorbic acid와 비교하여 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물은 모두 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. Fig.
- L-Ascorbic acid와 비교하여 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물은 모두 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. Fig. 2와 비교하여 본 실험 결과에서 나타난 높은 항산화능을 통해 인동덩굴 추출물 및 분획물이 효과적인 킬레이트제라는 것을 확인하였다.
- 고농도에서의 인동덩굴 추출물 및 분획물의 세포 보호 효과 감소를 통해, 고농도의 추출물 및 분획물에 세포막 교란 혹은 세포 독성을 나타내는 물질의 존재 가능성을 확인하였다. 게다가 10 μg/ml 농도의 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물에서 대조군(30.
- 실험 결과, 아무 처리하지 않은 군에 비해 인동덩굴 50% 에탄올 추출물은 25 μg/ml, 에틸아세테이트 분획물은 12.5 μg/ml의 농도까지는 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig. 5).
- 활성산소인 과산화수소는 세포막을 통과하여 생체 내 미량으로 존재하는 금속 이온과 반응하여 다른 ROS를 생성시켜 세포 손상을 야기시킨다[19]. 따라서 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물이 과산화수소로 유도된 HaCaT 세포의 산화적 손상에 대한 세포 보호 효과를 확인하였다.
- 실험 결과, 과산화수소를 처리한 실험군은 처리하지 않은 군에 비하여 약 65%의 생존율을 나타내었다(Fig. 6A). 0.
- 0.4−12.5 μg/ml 농도 범위에서 50% 에탄올 추출물을 처리한 군은 최고 농도 12.5 μg/ml에서만 70.0%의 세포 생존율을 나타내 유의적 차이를 나타냈다.
- 50% 에탄올 추출물의 경우 UVB 처리군에 비해 1.56 μg/ml 이상에서 유의적 감소를 나타냈으며, 각각 33.9, 39.7, 44.3, 45.2% 감소율을 나타내었다.
- 인동덩굴 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 HaCaT 세포에 0.4−12.5 μg/ml 농도 범위로 24 h 처리하였을 때, 모두 농도 의존적으로 ROS 감소를 나타내었다(Fig. 7).
- 그러나 0.4−12.5 μg/ml 농도범위에서 에틸아세테이트 분획물을 처리한 군은 모든 농도에서 세포 생존율을 현저히 증가시켰으며 최대 78.6%까지증가시켰다(각각 73.2, 74.8, 76.9, 76.0, 78.0%).
- 6B에 나타내었다. 실험 결과, 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물 모두 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 최고 농도에서 50% 에탄올 추출물이 약 4.
- 실험 결과, 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물 모두 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 최고 농도에서 50% 에탄올 추출물이 약 4.5%의 증가율을 나타낸 것과 비교하여 에틸아세테이트 분획물은 약 14.6%의 증가율을 나타냄으로써 인동덩굴 50% 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 분획물이 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효능이 뛰어남을 확인하였다.
- 실험 결과, UVB를 조사한 실험군은 조사하지 않은 군(100%)에 비해 ROS가 453.6%로 증가하였다. 인동덩굴 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 HaCaT 세포에 0.
- 게다가 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물을 비교했을 때, 최고 농도 12.5 μg/ml에서 유의적 차이가 있음을 통계적으로 관찰함으로써 세포 내 ROS 억제 효능이 인동덩굴 50% 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 분획물에서 더욱 뛰어남을 확인하였다.
- 이 중 4개의 띠를 UV 및 NPPEG 발색법을 이용해 확인하였다. 실험 결과, Rf 값이 0.74인 LJT1은 coumaric acid로 나타났고 Rf 값이 0.63인 LJT2는 apigenin, Rf 값이 0.54인 LJT3는 caffeic acid, Rf값이 0.40인 LJT4는 luteolin으로 확인되었다. 확인된 성분 중에 caffeic acid와 luteolin이 가장 진한 색의 띠를 나타내었다.
- 40인 LJT4는 luteolin으로 확인되었다. 확인된 성분 중에 caffeic acid와 luteolin이 가장 진한 색의 띠를 나타내었다.
- HPLC 크로마토그램의 peak를 동정하기 위해 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 추출 및 여과하고 용매를 감압 건조시켜 파우더를 얻은 뒤, 에탄올로 녹여서 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. HPLC 분석 결과, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물의 TLC 크로마토그램에서의 LJT1 (Rf 0.74)은 Fig. 9의 HPLC peak 2 (coumaric acid), LJT2 (Rf 0.63)는 peak 4 (apigenin), LJT3 (Rf 0.54)는 peak 1 (caffeic acid), LJT4 (Rf 0.40)는 peak 3 (luteolin)과 일치함을 확인하였다.
- Luteolin의 항산화 효능은 높은 환원력과 플라보노이드 B 고리의 금속 이온 킬레이팅 작용에 기인하며, 상호작용할 수 있는 다른 항산화제가 존재하는 생물학적 시스템에서 항산화 시너지 효과를 나타낸다고 알려져 있다[21]. TLC 및 HPLC 성분 분석을 통해 인동덩굴 추출물의 주성분인 caffeic acid와 luteolin이 인동덩굴 추출물의 높은 항산화 활성과 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과에 기여함을 확인하였다.
- 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 분획물에 함유된 총 페놀성 화합물의 함량을 caffeic acid의 양으로 환산한 결과, 에틸아세테이트 분획물(159.2 mg/g)이 50% 에탄올 추출물 (35.7 mg/g)보다 약 4.5배 높은 함량을 나타내었다. 총 플라보노이드 함량을 luteolin의 양으로 환산하여 나타낸 결과, 인동덩굴 추출물과 분획물에 각각 145.
- 5배 높은 함량을 나타내었다. 총 플라보노이드 함량을 luteolin의 양으로 환산하여 나타낸 결과, 인동덩굴 추출물과 분획물에 각각 145.5, 635.4 mg/g의 총플라보노이드 함량을 나타내었다. 실험 결과를 통해 인동덩굴 추출물의 뛰어난 항산화 활성 및 세포 보호 효과가 다량의 페놀성 화합물과 플라보노이드의 함유에 의한 결과임을 확인하였으며, 특히 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 50% 에탄올 추출물보다 약 4.
- 4 mg/g의 총플라보노이드 함량을 나타내었다. 실험 결과를 통해 인동덩굴 추출물의 뛰어난 항산화 활성 및 세포 보호 효과가 다량의 페놀성 화합물과 플라보노이드의 함유에 의한 결과임을 확인하였으며, 특히 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 50% 에탄올 추출물보다 약 4.5배 높은 페놀성 화합물 및 플라보노이드를 함유하고 있어 더욱 우수한 항산화 활성을 나타냄을 확인하였다.
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