[논문]효소분해에 따른 물오리나무 Diarylheptanoid 화합물의 함량 변화

왕혜수; 황인혁; 이민원

효소분해에 따른 물오리나무 Diarylheptanoid 화합물의 함량 변화
Variation of Diarylheptanoid from Alnus sibirica Fitch. Ex Turcz. Processed Enzymatic Hydrolysis 원문보기

생약학회지, v.49 no.4, 2018년, pp.336 - 340

왕혜수 (중앙대학교 약학대학) , (중앙대학교 약학대학) , 황인혁 (중앙대학교 약학대학) , 이민원 (중앙대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Alnus sibirica Fisch. ex Turcz.(AS) geographically distributes in Korea, Japan, Northeast China and Russia. The bark of Alnus species have been used as traditional medicine for the treatment of allergic skin diseases. The content evaluation of compounds which were isolated from the barks of A. sibirica processed enzymatic hydrolysis(EAS); hirsutanonol(1), 5-O-methylhirsutanonol(2), rubranol(3), hirsutenone(4) and muricarpone B(5) was conducted using HPLC. Consequently, in EAS, the content of glycoside was decreased considerably. But the aglycones(1, 3 and 4) were increased highly and 2, 5 were formed newly.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. The structures of 1-5 isolated from EAS.
표 Table I. HPLC analysis condition
그림 Fig. 2. HPLC chromatograms of AS, EAS at 280 nm.
표 Table II. Contents of compounds (1-5)
표 Table III. Linear ranges, linear regression equation and LOQ of compounds (1-5)
표 Table IV. Precision and accuracy for the determination of compounds (1-5)

AI 본문요약
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제안 방법

확증표본은 AS-2015-01이며, 중앙대학교 약학대학 표본실에 보관되어있다. 3일간 건조시킨 AS 수피(2.8 kg)을 분쇄 후, 실온, 80% prethanol-A 용매 조건으로 3일씩 3회 반복 추출 하여 추출물 121 g을 확보하였다. 효소가수분해는 추출물:효소:증류수를 1:3:1 비율로 섞어 실온에서 3일간 반응 시켰다.
HPLC 분석조건 확립 − 지표성분(1-5)의 최적 분석법을 확립하였다.
Hirsutanonol 표준용액의 농도는 2300, 1150, 575, 287.5 µg/mL로 조제하였으며, 나머지 화합물들의 표준용액의 농도는1000, 500, 250, 125 µg/mL로 조제하였다.
Hirsutanonol(1), 5-O-methylhirsutanonol(2), rubranol(3), hirsutenone(4), muricarpon B(5)를 지표성분으로 이용한 밸리데이션 실험에 의해 분석법의 특이성, 직선성, 정량한계, 정밀성, 정확성을 검토하여 분석법을 검증하였다.
직선성(Linearity) − 직선성 평가를 위한 검량선을 얻기 위해 화합물들(1-5)을 70% MeOH로 희석하여 각 4 개의 농도가 되도록 용액을 만들어 실험을 진행하였다. Linear regression equation(y = ax+b y: peak 면적, x: 시료 농도 a: 직선의 기울기, b: y절편)을 구하였으며 상관계수(R²)의 값을 통해 직선성을 확인하였다. R²의 값이 0.
각 농도 범위는 hisutanonol은 2300, 1150, 575, 287.5 µg/mL이었고 나머지 화합물들의 농도 범위는 모두 1000, 500, 250, 125 µg/mL의 농도로 진행하였다.
본 연구에서는 EAS로부터 분리한 diarylheptanoid 화합물들에 대하여 High-Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 사용하여 밸리데이션 및 함량평가를 실시하였다.
HPLC 조건 − 화합물들(1-5)의 정량은 HPLC를 이용하였다. 분석조건은 flow rate 1 mL/min, 이동상으로 A line; 0.2% Acetic acid-H₂O, B line; Acetonitrile을 이용하여 Table I과 같은 조건으로 각 시료에 대한 함량분석을 실시하였다(Table I).
정량한계(LOQ) − 분석물질의 정량 가능한 최저농도 확인을 위하여, 정량한계(LOQ)를 측정하였다.
정확성(Accuracy) 및 정밀성(Precision) − 동일 농도의 시료에 대하여 일간 및 일내 변동을 알아보기 위해 정밀성 및 정확성 평가를 실시하였다.
5 µg/mL이었고 나머지 화합물들의 농도 범위는 모두 1000, 500, 250, 125 µg/mL의 농도로 진행하였다. 정확성은 표준값과 측정값 간의 일치되는 정도로 확인하였으며, 정밀성은 반복 분석하였을 때 분석물질에 대한 측정값들 사이의 근접성으로 측정하였다.
직선성(Linearity) − 직선성 평가를 위한 검량선을 얻기 위해 화합물들(1-5)을 70% MeOH로 희석하여 각 4 개의 농도가 되도록 용액을 만들어 실험을 진행하였다.
특이성(Specificity) − 지표성분이 효소가수분해 물오리나무 추출물 내 다른 물질과 간섭 없이 분리가 되는 것에 의해 특이성을 확인한다.
표준용액과 검액의 조제 − Hirsutanonol(1), 5-O-methylhirsutanonol(2), rubranol(3), hirsutenone(4), muricarpon B(5)를 70% MeOH에 녹여 stock solution을 조제했다.
56분에서 다른 물질의 간섭 없이 성분의 피크가 분리된 것을 확인하였다. 표준용액의 RT은 (1); 30.82분, (2); 37.63분, (3); 38.24분, (4); 39.02분, (5); 41.76분으로 표준용액의 피크 유지기간과 효소가수분해 물오리나무추출물 내의 피크 유지기간이 거의 일치한 것을 확인함으로써 특이성을 검증하였다(Fig. 2).
정확성(Accuracy) 및 정밀성(Precision) − 동일 농도의 시료에 대하여 일간 및 일내 변동을 알아보기 위해 정밀성 및 정확성 평가를 실시하였다. 화합물들(1-5)의 표준용액을 시료 농도당 3일간 반복성 시험, 일내 3회 반복성 시험을 하였다. 각 농도 범위는 hisutanonol은 2300, 1150, 575, 287.

대상 데이터

효소가수분해는 추출물:효소:증류수를 1:3:1 비율로 섞어 실온에서 3일간 반응 시켰다. 그리고 화합물은 이전 연구를 통해 확보된 것을 사용하였다.¹²⁾
본 연구에 이용된 효소는 α-amylase로 Aspergillus oryzae로부터 생성된 것이며 Novozyme사의 ‘Fungamyl super AX’을 이용하였다.
분석에 이용한 UV 파장은 280 nm로 설정하여 함량분석을 하였고, injection volume은 10 µL로 하였다.
재료 − 본 실험에 사용된 AS가지의 소재는 서울특별시 동작구 국사봉(2015. 01)에서 채집하였다.
01)에서 채집하였다. 채집한 AS가지는 김성식 연구관(국립수목원)의 검증을 받았다. 확증표본은 AS-2015-01이며, 중앙대학교 약학대학 표본실에 보관되어있다.

데이터처리

기울기 S는 분석물질의 검량선으로부터 구하였으며, 회귀직선에서 y절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 활용하였다.

이론/모형

기기 및 시약 − 밸리데이션과 함량분석에 사용된 High Performance Liquid Chromatography(HPLC) 기기는 Waters 600E Multi-solvent Delivery System(Waters, USA) 모델을 이용하였으며, 컬럼은 Hector C18 column(5 µm, 250×4.6mm)을 이용하였다.
정량한계(LOQ)는 QL=10×σ/S(σ: 반응의 표준편차, S: 검량선의 기울기)의식을 이용해 계산하였다.
함량분석 − 화합물(1-5)의 함량은 linear regression equation을 이용해 계산하였다.

성능/효과

직선성(Linearity) − 검량선의 Linear regression equation은 다음과 같았다. (1)Y=1309.1X-143570이며, 검량선의 상관계수(R²)는 0.9997, (2)Y=5539.9X-396070이며,R²는0.9998, (3)Y= 3092.1X-146577이며, 검량선의 상관계수(R²)는 1, (4)Y= 9222.2X-341971이며, 검량선의 상관계수(R²)는 0.9998, (5)Y= 3437.6X-202672이며, 검량선의 상관계수(R²)는 0.9997이다. 함량분석 결과, 모든 화합물의 검량선 모두 R²가 0.
이 물오리나무의 수피는 전통적으로 외상성 손상, 비출혈 등에 널리 이용되어 왔다.¹⁾ 또한 AS가 함유하고 있는 diarylheptanoids^,2,3) triterpenoids^,4) flavonoids⁵⁾와 같은 페놀성 화합물들은 항산화, 항염증 등과 같은 생리활성을 갖고 있으며,^6-8) 이전 연구를 통해서 물오리나무의 수피 발효물에 대한 항아토피 활성을 확인하였다.⁹⁾
31%로 양호한 값을 나타내었다. 5-O-methylhirsutanonol(2)의 정확성은 95.54~102.59% 이내로 확인하였으며, 정밀성은 변동계수(c.v., coefficient variation)로써 0.44~1.31%로 양호한 값을 나타내었다. Rubranol(3)의 정확성은 97.
AS의 주요 화합물인 oregonin(6)의 5번 탄소에 붙어있는 xylose가 효소에 의해 분해 되고 산화, 환원 반응에 의해 비당체(1-5) 화합물이 새로 생성되거나 증가하였다. AS와 EAS의 추출물 함량을 비교하였을 때 (1)은 0.98%에서 27.43%로, (3)은 1.13%에서 5.78%로, (4) 0.42%에서 6.99%로 크게 증가하였으며, (2), (5)의 peak는 새로 생성되었다(Fig. 2, Table II).
2). Hirsutanonol(1), 5-O-methylhirsutanonol(2), rubranol(3), hirsutenone(4), muricarpon B(5)의 함량은 EAS prethanol 추출물 대비 각 27.43%, 5.35%, 5.78%, 6.99%, 2.72%가 함유되어 있음을 확인하였다. 또한, 원소재의 건조 중량 대비 화합물(1-5)의 함량은 각 1.
75%로 양호한 값을 나타내었다. Muricarpon B(5)의 정확성은 94.60~101.57% 이내로 확인하였으며, 정밀성은 변동계수(c.v., coefficient variation)로써 0.79~1.12%로 양호한 값을 나타내었다(Table IV).
72%가 함유되어 있음을 확인하였다. 또한, 원소재의 건조 중량 대비 화합물(1-5)의 함량은 각 1.10%, 0.02%, 0.23%, 0.28%, 0.11%로 확인되었다.
90 µg/mL으로 측정되었다. 이를 통해 미량도 정량 가능함을 확인하였다(Table III).
정확성(Accuracy) 및 정밀성(Precision) – Hirsutanonol(1)의 정확성은 94.18~101.34% 이내로 확인하였으며, 정밀성은 변동계수(c.v., coefficient variation)로써 0.74~1.31%로 양호한 값을 나타내었다.
특이성(Specificity) − HPLC를 이용해 EAS 추출물의 chromatogram을 비교해 화합물들(1-5)의 retention time(RT)을 확인한 결과, 각 hirsutanonol(1)의 피크는 30.81분, 5-Omethylhirsutanonol(2)의 피크는 37.62분, rubranol(3)의 피크는 38.11분, hirsutenone(4)의 피크는 39.21분, muricarponeB(5)의 피크는 41.56분에서 다른 물질의 간섭 없이 성분의 피크가 분리된 것을 확인하였다.
9997이다. 함량분석 결과, 모든 화합물의 검량선 모두 R²가 0.9990 이상으로 나타나 높은 직선성을 보이고 있음을 확인하였다(Table III).
확립한 분석을 이용하여 함량분석을 시행한 결과, EAS 추출물에는 hirsutanonol(1), 5-O-methylhirsutanonol(2), rubranol(3), hirsutenone(4), muricarpon B(5)이 각 27.43%, 5.35%, 5.78%, 6.99%, 2.72%가 함유되어 있음을 확인하였다. 또한, 원소재의 건조 중량 대비 화합물(1-5)의 함량은 각 1.

후속연구

11%로 확인되었다. 연구의 결과로 EAS추출물에 존재하는 화합물의 함량분석에 있어서 중요한 기초자료로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	물오리나무의 수피는 어디에 이용되어 왔는가?	Alnus 속 식물 중 국내 자생식물인 물오리나무(Alnussibirica, AS)는 한국, 중국, 일본 그리고 러시아에서 자생하고 있는 것으로 알려져 있다. 이 물오리나무의 수피는 전통적으로 외상성 손상, 비출혈 등에 널리 이용되어 왔다.1) 또한 AS가 함유하고 있는 diarylheptanoids,2,3) triterpenoids,4) flavonoids5)와 같은 페놀성 화합물들은 항산화, 항염증 등과 같은 생리활성을 갖고 있으며,6-8) 이전 연구를 통해서 물오리나무의 수피 발효물에 대한 항아토피 활성을 확인하였다.
	물오리나무가 자생하고 있는 지역은?	Alnus 속 식물 중 국내 자생식물인 물오리나무(Alnussibirica, AS)는 한국, 중국, 일본 그리고 러시아에서 자생하고 있는 것으로 알려져 있다. 이 물오리나무의 수피는 전통적으로 외상성 손상, 비출혈 등에 널리 이용되어 왔다.
	정밀성 및 정확성 평가는 어떻게 실시하였는가?	정확성(Accuracy) 및 정밀성(Precision) − 동일 농도의 시료에 대하여 일간 및 일내 변동을 알아보기 위해 정밀성 및 정확성 평가를 실시하였다. 화합물들(1-5)의 표준용액을 시료 농도당 3일간 반복성 시험, 일내 3회 반복성 시험을 하였다. 각 농도 범위는 hisutanonol은 2300, 1150, 575, 287.5 µg/mL이었고 나머지 화합물들의 농도 범위는 모두 1000, 500, 250, 125 µg/mL의 농도로 진행하였다. 정확성은 표준값과 측정값 간의 일치되는 정도로 확인하였으며, 정밀성은 반복 분석하였을 때 분석물질에 대한 측정값들 사이의 근접성으로 측정하였다.

참고문헌 (12)

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표제어: PCR

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용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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