[논문]하수오 추출물, 분획물 및 주성분의 항산화, 세포 보호 및 항균 활성에 관한 평가

신혁수; 김민우; 송제리; 이준석; 하윤정; 전영희; 김지웅; 이윤주; 박수남

doi:10.15230/scsk.2018.44.4.407

하수오 추출물, 분획물 및 주성분의 항산화, 세포 보호 및 항균 활성에 관한 평가
Evaluation of Antioxidant, Cytoprotective and Antimicrobial Properties of Polygoni multiflori Radix Extract, Fractions and Its Major Constituent 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.44 no.4, 2018년, pp.407 - 417

신혁수 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원 센터) , 김민우 (한성과학고등학교) , 송제리 (한성과학고등학교) , 이준석 (한성과학고등학교) , 하윤정 (한성과학고등학교) , 전영희 (한성과학고등학교) , 김지웅 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원 센터) , 이윤주 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원 센터) , 박수남 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융.복합산업 지원 센터)

초록
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본 연구에서는 하수오를 이용하여 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물을 제조하고, 추출물 및 분획물의 항산화, 세포 보호 및 항균 효능을 평가하여 기능성 소재로서의 가능성을 확인하였다. 또한, 하수오에 주요하게 존재하는 성분의 활성도 검증하였다. HPLC-DAD, LC-EIS-MS를 통해 분석한 결과, 하수오의 주성분은 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene 2-O-${\beta}$-D-glucoside (THSG)이었다. 페놀류 및 THSG 함량은 에틸아세테이트 분획물이 에탄올 추출물 보다 각각 11.1 및 3.0배 높게 나타났다. DPPH 자유 라디칼 및 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ 시스템에서 생성된 ROS에 대한 소거 활성 평가에서, 에틸 아세테이트 분획물은 에탄올 추출물 보다 뛰어난 소거 활성을 나타냈다. 특히 ROS 소거 활성 평가에서 에틸 아세테이트 분획물과 THSG은 L-ascorbic acid와 동등한 소거 활성을 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 수행된 광증감 반응으로 유도된 적혈구의 산화적 손상에 대한 세포 보호 활성은 에틸아세테이트 분획물, 에탄올 추출물, THSG 순서로 나타났으며, 모든 실험군이 양성 대조군으로 사용한 (+)-${\alpha}$-tocopherol보다 우수한 활성을 나타냄을 확인하였다. 항균 활성 평가는 S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, C. albicans 균주를 대상으로, disc diffusion assay와 broth microdilution assay를 이용하여 수행하였다. 그 결과 추출물, 분획물 및 THSG 모두 모든 균주에 대해 항균 활성을 나타냈으며, 특히 그람 양성균인 S. aureus에 대해 methyl paraben보다 우수한 항균력을 나타냄을 확인하였다. 본 연구의 결과는 하수오가 항산화, 세포 보호 및 항균력에 관한 천연 소재로의 활용될 수 있는 가능성을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the antioxidant, cytoprotective and antimicrobial activities of 50% ethanol extract of Polygoni multiflori Radix (PMR) and its ethyl acetate fraction were evaluated to confirm the applicability as a functional ingredient. The activities of the major constituent of PMR were verified and 2, 3, 5, 4′-tetrahydroxystilbene 2-O-${\beta}$-D-glucoside (THSG) was confirmed to be the main component of extract and fraction using HPLC-DAD, LC-EIS-MS analysis. The phenolic and THSG contents of the ethyl acetate fraction were 11.1- and 3.0-folds higher than those of the ethanol extract, respectively. As a result of the DPPH assay and that of luminol dependent chemiluminescence assay in $Fe^{3+}$-EDTA/H2O2 system. the ethylacetate fraction was superior to the ethanol extract in free radical and ROS scavenging activities. Especially, the ethyl acetate fraction and THSG exhibited the similar scavenging activity like L-ascorbic acid in ROS scavenging activity. The ethyl acetate fraction perceived the most potent cytoprotective effect against oxidative damage of erythrocytes induced by photosensitization reaction, followed by the ethanol fraction, THSG and that of (+)-${\alpha}$-tocopherol, which was used as a positive control. Antimicrobial activities were evaluated by disc diffusion and broth microdilution assay against S. aureus, E. coli, P. aeruginosa and C. albicans. In particular, the antibacterial activity of the extract and fraction against S. aureus was superior to that of methyl paraben. Taken together, our results suggest that PMR could be used as a natural ingredient for antioxidant, cytoprotective and antimicrobial activities.

주제어

표/그림 (8)

$Figure 1. HPLC-DAD chromatograms of the (A) 50% ethanol extract (2.00 μg injected in 20 μL) and (B) ethyl acetate fraction (2.00 μg injected in 20 μL) of PMR acquired at 250-400 nm. (C) the ESI-MS spectrum of isolated compound (1) from the ethyl acetate fraction of PMR. (D) the MS2-spectrum of the [M+H]+ ions at m/z 407.13.$ 그림 Figure 1. HPLC-DAD chromatograms of the (A) 50% ethanol extract (2.00 μg injected in 20 μL) and (B) ethyl acetate fraction (2.00 μg injected in 20 μL) of PMR acquired at 250-400 nm. (C) the ESI-MS spectrum of isolated compound (1) from the ethyl acetate fraction of PMR. (D) the MS²-spectrum of the [M+H]⁺ ions at m/z 407.13.
표 Table 1. Weight Yields, Total Phenolic (TP) Contents and 2, 3, 5, 4'-Tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-lucoside (THSG) Contents of the Extract and Fraction from PMR
$Figure 2. TLC chromatograms (UV-254 (A, D), 365 nm (B, E) and NP-PEG reagents; UV-365 nm (C, F)). (A-C) the eluent system was ethyl acetate: chloroform: formic acid: water = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v), (D-F) the eluent was n-hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v). ① emodin ② 50% EtOH extract ③ EtOAc fraction ④ THSG ⑤ gallic acid.$ 그림 Figure 2. TLC chromatograms (UV-254 (A, D), 365 nm (B, E) and NP-PEG reagents; UV-365 nm (C, F)). (A-C) the eluent system was ethyl acetate: chloroform: formic acid: water = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v), (D-F) the eluent was n-hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v). ① emodin ② 50% EtOH extract ③ EtOAc fraction ④ THSG ⑤ gallic acid.
$Figure 3. (A) Free radical scavenging and (B) ROS scavenging activities of the 50% ethanol extract and ethyl acetate fraction of PMR and that of THSG, (+)-α-tocopherol and L-ascorbic acid. the FSC50 and OSC50 of the different samples were determined using DPPH assay and luminol-dependent chemiluminescence assay in the Fe3+-EDTA/H2O2 system, respectively. values are presented as mean ± SD (n = 3). a-d/a’-b’, different letters on the top of the bars denote significant differences (p < 0.05).$ 그림 Figure 3. (A) Free radical scavenging and (B) ROS scavenging activities of the 50% ethanol extract and ethyl acetate fraction of PMR and that of THSG, (+)-α-tocopherol and L-ascorbic acid. the FSC₅₀ and OSC₅₀ of the different samples were determined using DPPH assay and luminol-dependent chemiluminescence assay in the Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ system, respectively. values are presented as mean ± SD (n = 3). a-d/a’-b’, different letters on the top of the bars denote significant differences (p < 0.05).
$Figure 4. Inhibition of rose bengal sensitized photohemolysis by the 50% ethanol extract and ethyl acetate fraction of PMR and that of THSG and (+)-α-tocopherol. (a-c) Time-dependent cell viability of erythrocyte treated different concentration of the samples; 3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL, respectively.$ 그림 Figure 4. Inhibition of rose bengal sensitized photohemolysis by the 50% ethanol extract and ethyl acetate fraction of PMR and that of THSG and (+)-α-tocopherol. (a-c) Time-dependent cell viability of erythrocyte treated different concentration of the samples; 3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL, respectively.
표 Table 2. Cytoprotective Effects of the 50% Ethanol Extract and Ethyl Acetate Fraction of PMR and that of THSG and (+)-α-Tocopherol against 1O2-Induced Photohemolysis in Erythrocytes
$Figure 5. Photographs of the antibacterial test results of the 50% ethanol extract, and ethyl acetate fraction of PMR and that of THSG and methyl using the disk diffusion method against (a) S. aureus, (b) E. coli, (c) P. aeruginosa and (d) C. albicans.$ 그림 Figure 5. Photographs of the antibacterial test results of the 50% ethanol extract, and ethyl acetate fraction of PMR and that of THSG and methyl using the disk diffusion method against (a) S. aureus, (b) E. coli, (c) P. aeruginosa and (d) C. albicans.
표 Table 3. Values of MIC and MBC/MFCof the 50% Ethanol Extract, and Ethyl Acetate Fraction of PMR and that of THSG and Methyl Paraben by Broth Microdilution Assay (n = 3)

AI 본문요약
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문제 정의

하수오의 생리 활성에 관한 다양한 연구가 수행되었지만[17], Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ 시스템에서 생성된 ROS에 대한 소거 활성 및 광증감 반응에 의해 생성된 1O₂으로 유도된 세포 손상에 대한 보호효능에 관한 평가는 아직 수행된 바가 없다. 따라서 본연구에서는 하수오 및 주성분의 자유 라디칼 및 다양한 ROS에 대한 소거 활성과 광증감 반응으로 유도된적혈구 세포 손상에 대한 보호 효능에 관한 평가를 비롯하여 다양한 피부 상재균에 대한 항균 활성 평가에 관한 연구를 수행하여 기능성 소재로서의 가능성을 확인하였다.
본 실험에서는 활성을 luminol을 이용한 화학 발광법을 이용하여 Fe3+-EDTA/H2O2 시스템에서 생성된 O2⋅-, ⋅OH와 같은 다양한 ROS에 대한 시료들의 소거 활성을 평가하였다 [20,23].
본 연구에서는 하수오의 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 제조하였고, 이들의 항산화 및 항균 소재로서의 응용 가능성을 평가하였다. HPLC-DAD,LC-MS/MS 분석을 통해 추출물 및 분획물에 주요하게 존재하는 성분은 THSG인 것을 확인하였고, THSG의활성 평가도 수행하였다.
에틸 아세테이트 분획물과THSG은 양성 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid (1.44µg/mL)과 동등한 ROS 소거 활성을 나타내 우수한 항산화 소재로 응용할 가능성을 확인 하였다

제안 방법

32.15–1,000 µg/mL 농도(주입 용량, 20 µg/mL)로 제조된THSG 시료를 상기 조건을 이용해 분석하였고, 320 nm에서의 크로마토그램 peak 면적을 통해 검량 곡선(R2= 0.9954)을 작성한 뒤 함량을 결정하였다.
Disc diffusion assay에서 균주는1 × 107 colony forming unit (CFU)/mL의 농도로 균액을 제조하여 항균 활성 평가에 사용하였다.
추출물 및 분획물에 존재하는 주성분의 분리는 Thinlayer chromatography (105789, Merck, Darmstadt,Germany) 분석을 통해 수행하였다. Ethyl acetate-formicacid-chloroform-water (8 : 1 : 1 : 1, v/v)를 혼합하여 제조한 전개용매를 통해 추출물과 분획물을 전개하였다.TLC 판에서 주요하게 나타나는 밴드(R_f = 0.
HPLC-DAD 분석은 Shim-pack GIS C18column (5 µm, 4.6 × 250 mm, Shimadzu, Japan)을 사용하여 Shimadzu LC-20A HPLC system (Shimadzu, Japan)을 통해 40 ℃ 조건에서 기울기 용리(A 용매, 2% aceticacid in H2O/B용매, 0.5% acetic acid in 50% acetonitrileaqueous solution)를 사용하여 분석하였다.
본 연구에서는 하수오의 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 제조하였고, 이들의 항산화 및 항균 소재로서의 응용 가능성을 평가하였다. HPLC-DAD,LC-MS/MS 분석을 통해 추출물 및 분획물에 주요하게 존재하는 성분은 THSG인 것을 확인하였고, THSG의활성 평가도 수행하였다. 에틸 아세테이트 분획물은 에탄올 추출물보다 더 높은 페놀류와 THSG 함량을나타냈으며, 자유 라디칼 및 O₂^⋅-, ⋅OH^-와 같은 ROS에 대해서도 더 우수한 소거 활성을 나타냈다.
45 µm syringe filter에 통과시켜 불순물을 제거한 뒤 LC-ESI-MS분석에 사용하였다. LC/MS를 통한 분석은 Thermofisher scientific Inc. (USA)의 Dionex UltiMate 3000 rapid separation liquid chromatography (RSLC)와 결합된Q-Exactive Focus Orbitrap mass spectrometry system을통해 수행되었다. 전개 용매는 0.
이렇게 준비된 microplate를 48 h 동안 배양하였고,배양 후 육안으로 관찰하여 균이 증식되지 않은 최소농도를 MIC로 결정하였다. MBC 및 MFC는 균의 성장이 억제된 well의 균액을 평판 배지에 도말하여 48 h동안 배양 후 colony가 형성되지 않은 최소 농도로 결정하였다.
그리고 25 min 동안 루미놀과 활성산소의 화학발응에 의해 발생한 발광을 측정하였다. ROS 소거 활성은 아래와 같은 식 (2)로 계산하였고, ROS 소거 활성은 ROS를 50% 저해하는데 필요한 시료의 농도(OSC₅₀)를 구하여 비교하였다.
이 성분의 구조를 확인하기 위해 m/z 407 피크에 대해 MS/MS 분석을 수행하였다. m/z 245에서 glucosyl group이 이탈된 [M+H-C₆H₁₀O₅]⁺ [21], m/z 227 및 199에서 각각 hydroxystilbene 골격에서 H₂O와 CO가 이탈된[M+H-C₆H₁₀O₅-H₂O]⁺ 및 [M+H-C₆H₁₀O₅-CO]⁺ 형태의 피크를 확인하였다(Figure 1D)[22]. 상기의 최대 흡수 파장 및 LC-MS/MS 정보를 통해 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물에 주요하게 존재하는 성분은 THSG임을 확인하였고, 각각의 THSG의 함량은 시료 g당 79.
각 well에 160 µL의 배지를 추가로 주입하였고, 0.072-10.00mg/mL 농도 범위에서 항균 활성을 평가를 수행하였다.
각 시료를 luminometer (6-channel LB9505LT, Berthold, Germany)에 넣어준 뒤 35 ℃에서 5 min동안 인큐베이션 한 후, 150 mM H₂O₂ 40 µL를 첨가하였다. 그리고 25 min 동안 루미놀과 활성산소의 화학발응에 의해 발생한 발광을 측정하였다. ROS 소거 활성은 아래와 같은 식 (2)로 계산하였고, ROS 소거 활성은 ROS를 50% 저해하는데 필요한 시료의 농도(OSC₅₀)를 구하여 비교하였다.
그리고 상층액을 0.45 µm syringe filter에 통과시켜 불순물을 제거한 뒤 LC-ESI-MS분석에 사용하였다.
본 실험에서는 적혈구에 여러 농도의 시료를 처리한후, singlet oxygen에 의해 손상된 적혈구가 50% 용혈되는 시간(τ50)을 통해 시료들의 활성을 확인하였다.
에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물에 대한 자유 라디칼 소거 활성 평가는 각 시료에 주요하게 존재하는 THSG 및 대표적인 지용성 항산화제인(+)-α-tocopherol과 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid와 비교하여 진행하였다.
에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 THSG의 함량은 HPLC-DAD system을 이용하였다. 32.
이 성분을 LC-MS 분석을 통해 분석한 결과,negative ion mode의 m/z 405에서 [M-H]^- (data not shown), positive ion mode의 m/z 407에서 [M+H]⁺ 형태의 분자 이온 피크가 나타났다(Figure 1C)[16]. 이 성분의 구조를 확인하기 위해 m/z 407 피크에 대해 MS/MS 분석을 수행하였다. m/z 245에서 glucosyl group이 이탈된 [M+H-C₆H₁₀O₅]⁺ [21], m/z 227 및 199에서 각각 hydroxystilbene 골격에서 H₂O와 CO가 이탈된[M+H-C₆H₁₀O₅-H₂O]⁺ 및 [M+H-C₆H₁₀O₅-CO]⁺ 형태의 피크를 확인하였다(Figure 1D)[22].
여과액 중 일부를 감압 농축하였고, 24 h 동안 동결 건조하여 50% 에탄올 추출물을 얻었다. 이 추출물에서 에틸아세테이트(Daejung, Korea)에 우세하게 용해되는 성분을 추출하고자 여과액 500mL를 감압 증류하여 에탄올을 제거한 뒤, 에틸아세테이트 500mL를 이용하여 3회 반복 분획하였다. 이렇게 얻은 에틸아세테이트분획에 Na₂SO₄를 처리하여 미량의 물을 제거한 뒤 여과하였다.
00mg/mL 농도 범위에서 항균 활성을 평가를 수행하였다. 이렇게 준비된 microplate를 48 h 동안 배양하였고,배양 후 육안으로 관찰하여 균이 증식되지 않은 최소농도를 MIC로 결정하였다. MBC 및 MFC는 균의 성장이 억제된 well의 균액을 평판 배지에 도말하여 48 h동안 배양 후 colony가 형성되지 않은 최소 농도로 결정하였다.
광원은 20 W의 형광등으로,pyrex tube와 광원까지의 거리는 5 cm였다. 이후 15min 간격으로 시료의 투광도를 측정하였고, 적혈구가50% 용혈되는 시간을 통해 시료의 적혈구 용혈 저해활성을 비교 평가하였다.
자유 라디칼 소거 활성은 DPPH 라디칼 농도를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도(FSC₅₀)를 비교하여 평가하였다[19]. 다양한 농도로 제조한 분석 시료 0.
제조한 균액100 µL를 평판 배지에 균일하게 도말한 뒤 건조하였고, 각 시료 5 mg을 포함한 paper disc (8 mm diameter,Roshi Kaisha Ltd., Japan)를 배지에 밀착시켜 24 h 동안배양한 뒤 clear zone을 비교하여 항균 활성을 평가하였다.
추출물 및 분획물에 존재하는 주성분의 분리는 Thinlayer chromatography (105789, Merck, Darmstadt,Germany) 분석을 통해 수행하였다. Ethyl acetate-formicacid-chloroform-water (8 : 1 : 1 : 1, v/v)를 혼합하여 제조한 전개용매를 통해 추출물과 분획물을 전개하였다.
albicans에 대해서만 저해환을 나타냈다. 특히 에틸 아세테이트 분획물은 S. aureus 및 P. aeruginosa에 대해 육안 관찰을 통해 methyl paraben과 비교한 항균 활성이 동등 혹은 이상인 것으로 판단되었기에, 정량적인 비교를 위해 상기 균주들에 대해시료들의 MIC 및 MBC/MFC 값을 추가로 측정하였다.
자유 라디칼 및 ROS 소거 활성 평가에서 에틸 아세테이트 분획물은 에탄올 추출물 보다 우수한 소거 활성을 나타냈으며, 이러한 결과는 에틸 아세테이트 분획물에서 더 높은 페놀류 및 THSG 함량을 나타냈기 때문인것으로 판단된다. 하수오의 우수한 항산화 활성 평가 결과를 바탕으로, 하수오 추출물 및 분획물이 세포 수준에서도 항산화 활성을 나타내는지 확인하기 위해 적혈구산화적 손상에 대한 보호 활성 평가를 수행하였다.
하수오의 주성분은 상기 실험 방법의 조건으로 HPLC-DAD 및 LC-MS를 이용하여 분석하였다. 에탄올추출물 및 에틸 아세테이트 분획물의 HPLC-DAD 분석결과 36 min에서 강한 세기의 피크가 나타났고(Figure1A, B), 이 피크의 성분은 320 nm에서 최대 흡광도를 나타냈다.
에틸 아세테이트 분획물과 THSG는 동등한 자유 라디칼 소거 활성을 나타냈다. 하수오의 추가적인 항산화활성을 알아보기 위해 다양한 활성 산소종에 대한 소거 활성 평가를 수행하였다.

대상 데이터

FeCl3⋅6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan)에서 구매하였다.
Sodium sulfate (Na2SO4), Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, sodium carbonate (Na2CO3), 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical, 5-Amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione (luminol), ethylenediaminetetraaceticacid (EDTA), hydrogen peroxide (H2O2), heparin, rose Bengal (4, 5, 6, 7-Tetrachloro-2', 4', 5', 7'-tetraiodofluorescein disodium salt), L-ascorbic acid, (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), emodin (> 95%), gallic acid (> 97%)은 Sigma (USA)에서 구매하였다.
THSG (>98%)는 Chem Faces (China)에서 구매하였다.
albicans (ATCC10231)로 한국 미생물보존센터(KCCM, Korea)에서 분양받았다. 실험에 사용된 균주는 tryptic soy broth에서 37 ℃ 조건으로 배양기에서 24 h 배양하였다. Disc diffusion assay에서 균주는1 × 10⁷ colony forming unit (CFU)/mL의 농도로 균액을 제조하여 항균 활성 평가에 사용하였다.
실험에 사용된 중국산 하수오는 2018년 4월경 삼홍건재약업사(Korea)를 통해 구매하였다. 원물 200 g을잘게 분쇄하여 상온에서 72 h 동안 50% 에탄올(Daejung, Korea) 3L에 침적한 뒤 이를 여과하였다.
양성 대조군으로는 대표적인 지용성 항산화제인 α-tocopherol과 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid를 이용하였고, 이들의FSC50 값은 각각 7.54 및 2.81 µg/mL이었다(Figure 3A).
항균 활성 평가를 위하여 첫번째로 disc diffusion assay를 이용하여 확인하였다. 이 실험에 사용된 균주는 식품, 의약품 및 화장품 분야에서 검출이 제한되고 있는 균주인 S. aureus, E. Coli, P. aeruginosa, C. albicans를 사용하였으며, 양성 대조군은 항균 작용을 통해 방부력을 나타내는 methyl paraben을 사용하였다[30]. Figure 5에서 볼 수 있는 것과 같이, 에틸 아세테이트 분획물 및 methyl paraben은 실험에 사용된 모든 균주에 대해 저해환을 형성하였으며, 에탄올 추출물과THSG는 S.
(USA)의 Dionex UltiMate 3000 rapid separation liquid chromatography (RSLC)와 결합된Q-Exactive Focus Orbitrap mass spectrometry system을통해 수행되었다. 전개 용매는 0.1% formic acid가 포함된 H₂O와 acetonitrile을 사용하였고, MS parameter는 다음과 같은 조건을 사용하였다. Capillary temperature =300 ℃, source voltage = 3.
항균 활성 평가에 사용된 균주는 S. aureus(ATCC6538), E. coli (ATCC23736), P. aeruginosa(ATCC29336), C. albicans (ATCC10231)로 한국 미생물보존센터(KCCM, Korea)에서 분양받았다. 실험에 사용된 균주는 tryptic soy broth에서 37 ℃ 조건으로 배양기에서 24 h 배양하였다.

데이터처리

데이터의 유의성 평가에 사용된 소프트웨어는 Graphpad Prismv.6.01 (GraphPad Software Inc., USA)이며, one-way analysis of variance (ANOVA)를 이용하여 분산분석 후Tukey’s honestly significant difference (HSD) test를 통한사후 검증을 통해 p < 0.05 수준에서 유의성 분석을 수 행하였다.
본 실험의 모든 데이터는 3회 이상 반복하여 측정하였으며, 평균과 표준편차로 표시하였다. 데이터의 유의성 평가에 사용된 소프트웨어는 Graphpad Prismv.

이론/모형

광증감 반응으로 유도된 적혈구 광용혈 저해 활성은 기존에 보고된 방법을 사용하여 측정하였다[20]. 혈액1 mL를 3000 rpm으로 5 min 동안 원심 분리한 뒤 혈장을 제거하였다.
본 실험 결과를 확보하기 위한 적혈구의 산화적 손상의 유도는 rose bengal을 이용한 광증감반응을 이용하였다. Rose bengal은 480-550 nm 영역의 파장의 빛을 강하게 흡수한 뒤, type 2 광증감 반응을 통해 산소 분자에 에너지를 전달하여 높은 수율로 singlet oxygen의 생성을 유도한다[25].
, Japan)를 배지에 밀착시켜 24 h 동안배양한 뒤 clear zone을 비교하여 항균 활성을 평가하였다. 실험 균주에 대한 각 시료들의 Minimum inhibitory concentration (MIC)와 minimum bactericidalconcentration (MBC)/minimum fungicidal concentration (MFC) 은 broth microdilution assay를 통해 측정하였다.96-well plate에 각 시료를 연속적으로 2배씩 희석하여20 µL씩 넣어주었고, 각 균주는 3- 5 × 10⁶ CFU/mL의농도가 되도록 제조하여 20 µL씩 넣어주었다.
총 페놀류 함량은 페놀성 화합물이 기존에 알려진Folin & Ciocalteu 방법을 이용하여 측정하였다[18].
항균 활성 평가를 위하여 첫번째로 disc diffusion assay를 이용하여 확인하였다. 이 실험에 사용된 균주는 식품, 의약품 및 화장품 분야에서 검출이 제한되고 있는 균주인 S.
활성산소 소거 활성 평가는 luminol을 이용한 화학발광법을 이용하여 측정하였다[19]. 시험관에 다양한 농도로 제조한 분석 시료 50 µL, 증류수 1.

성능/효과

50% 에탄올을 이용하여 하수오에서 유효 성분을 추출 후 측정한, 원물 대비 수율은 28.4%였다. 에틸아세테이트를 이용한 추가적인 분획을 수행하였고, 분획물의 수율은 2.
THSG 또한 실험에 사용한 모든 균주에 대해 항균활성을 나타냈으며, S. aureus에 대해서는 methyl paraben보다 우수한 활성을 나타냈다. 하지만, THSG는 E.
Coli,P. aeruginosa, C. albicans에 대한 MIC는 50% 에탄올 추출물이 각각 1.25, 10.00, 2.50, 10.00 mg/mL, 에틸 아세테이트 분획물이 0.16, 5.00, 1.25, 2.50 mg/mL으로, 추출물 및 분획물은 실험에 사용한 모든 균주에 대해 항균 활성을 나타냈으며, 에틸 아세테이트 분획물은 에탄올 추출물 보다 낮은 MIC를 나타내 더 우수한 항균 활성을 보이는 것을 확인하였다. 또한 추출물 및 분획물은 그람 양성균인 S.
50 mg/mL으로, 추출물 및 분획물은 실험에 사용한 모든 균주에 대해 항균 활성을 나타냈으며, 에틸 아세테이트 분획물은 에탄올 추출물 보다 낮은 MIC를 나타내 더 우수한 항균 활성을 보이는 것을 확인하였다. 또한 추출물 및 분획물은 그람 양성균인 S. aureus에 대한 활성 측정 결과에서 methyl paraben보다 높은 항균 활성을 나타냈다. 특히 에틸아세테이트 분획물의 경우는 그람 음성균인 P.
또한 추출물과 분획물은 모두 양성대조군으로 사용한 (+)-α-tocopherol (36.1, 39.8, 46.8min) 보다 뛰어난 세포 보호 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
선행 연구 결과에서 적혈구의 산화적 손상에 대해 페놀성 화합물은 자유 라디칼 및 ROS 소거활성을 바탕으로 세포 보호 효능을 나타낸다고 보고되었다[10,28,29]. 본 실험의 결과에서 페놀류 및 THSG의 함량이 높은 에틸 아세테이트 분획물이 에탄올 추출물보다 높은 세포 보호 활성을 나타내는데, 이는 기존의 보고에 부합하는 결과로 판단된다.
m/z 245에서 glucosyl group이 이탈된 [M+H-C₆H₁₀O₅]⁺ [21], m/z 227 및 199에서 각각 hydroxystilbene 골격에서 H₂O와 CO가 이탈된[M+H-C₆H₁₀O₅-H₂O]⁺ 및 [M+H-C₆H₁₀O₅-CO]⁺ 형태의 피크를 확인하였다(Figure 1D)[22]. 상기의 최대 흡수 파장 및 LC-MS/MS 정보를 통해 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물에 주요하게 존재하는 성분은 THSG임을 확인하였고, 각각의 THSG의 함량은 시료 g당 79.4 및 880.5 mg이었다(Table 1). 이외에도 선행 연구와 TLC 분석을 통해 추출물 및 분획물에는 emodin과 gallic acid와 같은 성분이 일부 존재하는 것을 확인하였다(Figure 2).
에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획물 및 THSG의ROS 소거 활성(OSC50)은 각각 7.38, 1.33 및 1.73 µg/mL로 확인되었다(Figure 3B).
에틸 아세테이트 분획물은 에탄올 추출물보다 더 높은 페놀류와 THSG 함량을나타냈으며, 자유 라디칼 및 O2⋅-, ⋅OH-와 같은 ROS에 대해서도 더 우수한 소거 활성을 나타냈다.
이러한 결과를 바탕으로 수행된 1O2으로 유도된 적혈구 산화적손상에 대한 세포 보호 효능 평가에서 추출물, 분획물및 THSG은 (+)-α-tocopherol보다 우수한 활성을 나타냈다.
1%였다. 이렇게 얻은 추출물 및 분획물에 대한 페놀류 함량은 각각 원물 g당 80.0 mg GAE와239.6 mg GAE로 나타났다(Table 1).
자유 라디칼 및 ROS 소거 활성 평가에서 에틸 아세테이트 분획물은 에탄올 추출물 보다 우수한 소거 활성을 나타냈으며, 이러한 결과는 에틸 아세테이트 분획물에서 더 높은 페놀류 및 THSG 함량을 나타냈기 때문인것으로 판단된다. 하수오의 우수한 항산화 활성 평가 결과를 바탕으로, 하수오 추출물 및 분획물이 세포 수준에서도 항산화 활성을 나타내는지 확인하기 위해 적혈구산화적 손상에 대한 보호 활성 평가를 수행하였다.
하수오 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획물 및THSG의 자유 라디칼 소거 활성(FSC50)은 각각 57.2,20.53 및 19.3 µg/mL으로 확인되었다.
aureus에 대해서는 methyl paraben보다 우수한 활성을 나타냈다. 하지만, THSG는 E.Coli를 제외한 모든 균주에 대해 에틸 아세테이트 분획물보다 낮은 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 선행 연구에서 하수오에 존재하는 emodin 및 gallicacid는 상기 균주에 대한 항균 활성을 나타낸다고 보고하였다[32-36].
이러한 결과를 바탕으로 수행된 ¹O₂으로 유도된 적혈구 산화적손상에 대한 세포 보호 효능 평가에서 추출물, 분획물및 THSG은 (+)-α-tocopherol보다 우수한 활성을 나타냈다. 항균 활성 평가에 있어서 하수오 추출물 및 분획물은 실험에 사용된 모든 균주(S. aureus, E. Coli, P.aeruginosa, C. albicans)에 대해 항균 활성을 나타냈고,특히 에틸아세테이트 분획물은 그람 양성균인 S. aureus에 대해서 methyl paraben 보다 뛰어난 항균 활성을 나타냈다. 하지만 하수오의 우수한 세포 보호 및 항균활성에 관한 활성 물질은 THSG이외에도 추가적으로 존재할 것으로 판단된다.

후속연구

따라서 추후 연구에서 하수오의 추가적인 활성 물질에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 결론적으로 상기의 실험 결과, 하수오는 우수한 항산화 효능 및, 세포 보호, 항균 활성을 보유한 소재인 것으로 판단되며, 본 연구를 통해 관련된 분야에서 천연 소재로서 사용될 가능성을 제시하고자 한다.
하지만 하수오의 우수한 세포 보호 및 항균활성에 관한 활성 물질은 THSG이외에도 추가적으로 존재할 것으로 판단된다. 따라서 추후 연구에서 하수오의 추가적인 활성 물질에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 결론적으로 상기의 실험 결과, 하수오는 우수한 항산화 효능 및, 세포 보호, 항균 활성을 보유한 소재인 것으로 판단되며, 본 연구를 통해 관련된 분야에서 천연 소재로서 사용될 가능성을 제시하고자 한다.
THSG의 경우 세포 보호 활성이 농도 의존적으로 증가하였을 뿐만 아니라 (+)-α-tocopherol과 비교하여 유의적인 세포 보호 활성을 나타냈지만, 에탄올 추출물 및 에틸 아세테이트 분획물 보다는 낮은 보호 효능을 나타냈다. 따라서 하수오의 우수한 세포 보호 작용에 관여하는 추가적인 활성 물질이 존재할 것으로 판단되기에 이에 관한 규명이 필요할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	하수오의 효능에는 어떤 것이 있는가?	하수오(Radix polygoni multiflori)는 마디풀과에 속하는 하수오(Polygonum multiflorum Thunb)의 건조된 덩이뿌리를 지칭하는 라틴 생약명으로, 심혈관 질환 개선, 면역 기능 증대, 항염증, 항암 및 항노화 효능으로인해 중국을 비롯한 여러 나라에서 전통적으로 사용되어온 약재이다[15,16]. 하수오의 생리 활성에 관한 다양한 연구가 수행되었지만[17], Fe3+-EDTA/H2O2 시스템에서 생성된 ROS에 대한 소거 활성 및 광증감 반응에 의해 생성된 1O2으로 유도된 세포 손상에 대한 보호효능에 관한 평가는 아직 수행된 바가 없다.
	활성 산소종은 무엇인가?	활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 호기성 대사과정에서 지속해서 생성되고 소멸하는 산소 분자의 화학적 혹은 물리적으로 들뜬 형태로써, singlet oxygen (1O2), hydrogen peroxide (H2O2) hydroxyl radical(⋅OH-), superoxide anion radical (O2⋅-), lipid peroxide(ROOH) 등이 존재한다. 이러한 분자는 체내에서 세포주기, 분화 및 사멸 등에 관한 신호 전달 경로에 관여하는 등 체내 생리학적 기능에 영향을 미친다.
	ROS와 내인성 항산화제 간의 항상성이 무너졌을 때 어떤 문제가 발생하는가?	하지만 ROS는 큰 반응성을 가지고 있어 DNA, 세포 및 단백질을 손상할 수 있기 때문에 내인성 항산화제에 의해 항상성이 유지되고 있다. 하지만 이러한 균형이 붕괴하면 체내 산화적 스트레스가 유발될 수 있고, 이는 동맥경화, 당뇨병, 신경퇴화 등 다양한 질병 및 노화를 유발할 수 있다[1-4].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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