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문제 정의
- 본 연구는 2017년 4월부터 2018년 8월까지 경기도 및 인천 소재의 양식장 4개소를 대상으로 서해수산연구소와 민간 수산질병관리원이 합동으로 정기적 질병 예찰을 수행하던 중 연중 발생하는 특정 질병에 대한 원인 병원체 동정과 감염 특성에 대한 보고이다. 감염어는 두부 발적, 아가미 뚜껑 및 가슴지느러미 부위의 괴사와 아가미 중심정맥동(central venous sinuses)에 심한 울혈 증상이 특징적이었다.
- PCR에 의한 분자생물학적 진단법과 유전자 분석을 통해 이 질병의 원인 병원체는 일본에서 주로 보고한 뱀장어바이러스성내피세포괴사증(VECNE)의 원인체인 JEECV로 밝혀졌다. 본 연구는 국내 뱀장어 양식장에서 JEECV 및 VECNE 감염특성을 밝힌 첫 보고이다.
- 본 연구에서는 경기도 및 인천 일대 뱀장어 양식장에서 연중 발생하는 아가미 중심정맥동(CVS)에 심한 울혈을 형성하는 질병과 관련하여, 각 양식장의 감염어에서 공통적으로 검출되는 바이러스(JEECV)에 대한 유전학적 동정과 병리조직학적 감염 특성을 보고하고자 하였다.
- 국내 뱀장어 양식장에서의 VECNE 발병과 관련한 정확한 진단 및 발생 현황에 대한 공식 보고는 없으나, 전국적으로 뱀장어 양식장에서 매년 아가미울혈을 동반하는 유사한 질병은 이미 만연하다고 비공식 확인되고 있다. 본 연구에서는 인천, 경기지역의 뱀장어 양식장에서 빈번히 발생하고 있는 질병의 원인 병원체를 JEECV로 특정하고 질병의 감염 특성을 밝혀 국내 뱀장어 양식장에서 만연한 질병이지만 공식 보고된 바 없는 바이러스성내피세포괴사증(VECNE)을 첫 보고하고자 한다.
제안 방법
- 10% 중성포르말린에 고정되어 있던 아가미 조직을 투과전자현미경(TEM) 표본으로 제작을 위해 아가미를 1 mm3 내외 크기로 자른 후 2.5% glutaraldehyde로 1차 고정, 2% osmium tetroxide (OsO4)를 이용한 2차 고정을 거쳤다. Proplylene oxide (PO): Epon으로 포매한 후, 절편(두께 80 nm)을 제작하여 TEM (LIBRA-120, Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
- PCR 증폭 산물은 QIAxcel Advanced 자동전기영동 장치(Qiagen, Germany)를 이용하여 band를 확인하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제하여 direct sequencing법으로 염기서열을 분석하고 그 결과를 NCBI web site (www.
- 5% glutaraldehyde로 1차 고정, 2% osmium tetroxide (OsO4)를 이용한 2차 고정을 거쳤다. Proplylene oxide (PO): Epon으로 포매한 후, 절편(두께 80 nm)을 제작하여 TEM (LIBRA-120, Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
- RNA와 DNA 분리는 각각 RNeasy RNA mini kit (Qiagen, Germany), QIA amp DNA mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 상법에 따라 분리하였다. RNA 바이러스는 RT-PCR (One step RT-PCR, Bioneer)을 이용하여 cDNA 합성 및 PCR을 실시하였다.
- 각 양식장에서 검출된 JEECV PCR products를 sequencing 하고, 조류 및 포유류, 어류 등에서 기 보고된 Polyomavirus large T antigen 아미노산 서열과 비교하여 계통수를 작성하였다(Fig. 6). 본 연구에 얻은 아미노산 서열은 일본의 뱀장어(A.
- 뱀장어에 감염을 일으킬 수 있는 바이러스성 질병 중 Aquabirnavirus에 속하는 Eel virus european (EVE), Rhabdovirus에 속하는 Eel virus european X (EVEX), Alloherpesvirus에 속하는 Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1), Polyomavirus에 속하는 Japanese eel endothelial cells-infecting virus(JEECV)의 감염여부를 조사하였다. 시험어를 무균적으로 해부하여 아가미, 비장, 신장, 간을 적출하여 핵산을 분리하고 각 질병의 특이 primer(Table 1)를 사용하여 PCR 검사를 실시하였다.
- , 1994). 본 연구에서도 울혈증상을 보이는 아가미를 전자현미경으로 관찰한 결과 혈관세포 핵내 또는 세포질에서 70 nm 전후의 바이러스 입자를 관찰하였다.
- 시험어는 외부 및 내부 임상증상을 확인하였으며 체표와 지느러미, 아가미 및 각 내부 장기를 광학현미경으로 관찰하여 기생충 감염 여부를 조사하였고, 시험어를 무균적으로 해부하여 신장, 비장, 간 등의 내부장기에서 세균 배양 시험을 실시하였다.
- 뱀장어에 감염을 일으킬 수 있는 바이러스성 질병 중 Aquabirnavirus에 속하는 Eel virus european (EVE), Rhabdovirus에 속하는 Eel virus european X (EVEX), Alloherpesvirus에 속하는 Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1), Polyomavirus에 속하는 Japanese eel endothelial cells-infecting virus(JEECV)의 감염여부를 조사하였다. 시험어를 무균적으로 해부하여 아가미, 비장, 신장, 간을 적출하여 핵산을 분리하고 각 질병의 특이 primer(Table 1)를 사용하여 PCR 검사를 실시하였다.
- 시험어의 각 조직(아가미, 간, 신장, 비장)을 적출하여 10% 중성포르말린에 고정하고, 일반적인 조직처리과정에 따라 70, 80, 90, 95 및 100% 알코올에 탈수 탈지과정을 거쳐 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직은 microtome (RM2235, Leica, Germany)을 이용하여 4 μm 두께로 절편한 후 Herris’s hematoxylin-0.
- 2017년 4월부터 2018년 8월까지 경기도 및 인천 소재 순환 여과식 뱀장어 양식장 4개소를 대상으로 수시 또는 정기적으로 질병 예찰을 실시하였다. 양식장 사육수조에 있는 먹이틀을 관찰하여 아가미 덮개 발적 등의 특징적 임상증상을 보이며 폐사 또는 빈사상태로 있는 뱀장어를 채집하여 액체 산소 포장하여 실험실로 운반한 후 기생충, 세균, 바이러스 검사 및 병리조직학적 분석을 실시하였다.
- 포매된 조직은 microtome (RM2235, Leica, Germany)을 이용하여 4 μm 두께로 절편한 후 Herris’s hematoxylin-0.5% eosin (H-E) 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 2017년 4월부터 2018년 8월까지 경기도 및 인천 소재 순환 여과식 뱀장어 양식장 4개소를 대상으로 수시 또는 정기적으로 질병 예찰을 실시하였다. 양식장 사육수조에 있는 먹이틀을 관찰하여 아가미 덮개 발적 등의 특징적 임상증상을 보이며 폐사 또는 빈사상태로 있는 뱀장어를 채집하여 액체 산소 포장하여 실험실로 운반한 후 기생충, 세균, 바이러스 검사 및 병리조직학적 분석을 실시하였다.
- 경기도 및 인천시 소재 순환여과식 뱀장어 양식장 4개소를 대상으로 2017년 4월부터 2018년 8월까지 수시 또는 정기적으로 질병 예찰을 실시하였다. 특징적 임상 증상과 폐사를 동반하는 질병이 발생한 경우 기생충, 세균, 바이러스 검사를 실시하였고, 유전학적 검사를 통해 JEECV가 검출된 경우를 Table 2에 나타내었다.
데이터처리
- 증폭된 PCR 산물을 정제하여 direct sequencing법으로 염기서열을 분석하고 그 결과를 NCBI web site (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공되는 BLAST program 정보를 이용하여 상동성을 비교한 후, MEGA-7 프로그램을 이용하여 계통수를 작성하였다.
이론/모형
- RNA와 DNA 분리는 각각 RNeasy RNA mini kit (Qiagen, Germany), QIA amp DNA mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 상법에 따라 분리하였다. RNA 바이러스는 RT-PCR (One step RT-PCR, Bioneer)을 이용하여 cDNA 합성 및 PCR을 실시하였다.
성능/효과
- 그러나 주로 당년에 입식한 어린 뱀장어에서 가장 먼저 질병 증상이 나타났으며 폐사율 또한 높아 양식장에 따라 동일시기 입식량의 50% 이상이 폐사한 사례도 있었다. A. japonca와 A. bicola를 같은 양식장에 사육하는 양식장(Gg2)에서는 뱀장어 종에 관계없이 모두 감염되는 것으로 확인되었고 감염 증상이나 폐사 양상 또한 유사하였다.
- AngHV1감염증과 VECNE는 두부 발적, 아가미 뚜껑 및 지느러미출혈 등과 같은 유사한 증상을 보여 육안적 소견만으로는 구분이 어렵다. PCR 결과에서 AngHV1은 감염어의 아가미에서만 바이러스가 검출되었지만(Park et al., 2012), 본 연구에서의 JEECV는 감염어의 아가미 뿐만 아니라 신장, 비장, 간 등의 내부 장기에서도 바이러스가 검출되어 감염조직에 큰 차이를 보이는 것으로 생각된다. 본 연구의 검사시료에서는 모두 JEECV만이 단독 검출되었으나, 본 연구 이외의 양식장의 아가미 조직에서 JEECV와 AngHV1가 복합적으로 검출되는 경우도 있어 이들 두 질병에 대한 상관관계 분석과 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 판단된다.
- 감염된 뱀장어 아가미 새판의 횡단면을 전자현미경으로 관찰한 결과, 2차 새변의 벽주세포의 핵과 세포질 내에서 직경 65~80 nm (평균 72.7±3.1 nm)의 정이십면체 구조를 가진 바이러스 입자를 확인하였다(Fig. 4).
- japonica)에서 분리된 JEECV (accession number BAS53726, accession number BAJ72716)와 가장 높은 상동성 (100%)을 나타내었다. 다른 어종인 giant guitarfish (Rhynchobatus djiddensis)와 black sea bass (Centropristis striata)에서 분리된 polyomavirus와는 44%, 무태장어(A. marmorata)에서 분리된 polyomavirus와는 51%의 상동성을 나타내었다.
- 감염어는 새변의 중심정맥동(CVS)의 심한 울혈과 팽창, 간과 신장 조직의 출혈 등과 같은 병리조직학적 감염 특성을 보였다. 또한 아가미 혈관내피세포의 핵과 세포질에서 정이십면체 구조를 가진 직경 70 nm 전후의 바이러스 입자가 관찰되었다. PCR에 의한 분자생물학적 진단법과 유전자 분석을 통해 이 질병의 원인 병원체는 일본에서 주로 보고한 뱀장어바이러스성내피세포괴사증(VECNE)의 원인체인 JEECV로 밝혀졌다.
- 뱀장어 바이러스성 질병에 대한 특이 primer sets을 이용하여 PCR을 실시한 결과 JEECV만이 특이적으로 검출되었고, JEECV의 유전자는 감염어의 아가미뿐만 아니라 비장, 신장, 간 조직에서도 아가미와 유사한 감도로 검출되었다(Fig. 5).
- 6). 본 연구에 얻은 아미노산 서열은 일본의 뱀장어(A. japonica)에서 분리된 JEECV (accession number BAS53726, accession number BAJ72716)와 가장 높은 상동성 (100%)을 나타내었다. 다른 어종인 giant guitarfish (Rhynchobatus djiddensis)와 black sea bass (Centropristis striata)에서 분리된 polyomavirus와는 44%, 무태장어(A.
- 본 연구에서 조사한 뱀장어 양식장에서 연중 발생하고 있는 아가미 울혈증상을 동반하는 질병은 일본의 뱀장어 양식장에서 발생하는 JEECV에 의한 VECNE와 임상증상 및 병리조직학적 특성이 매우 유사하며, 유전학적 진단법을 통해 국내에서 검출된 바이러스와 일본의 JEECV와 100% 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 국내 뱀장어 양식장에서는 오래 전부터 JEECV가 분포하였을 것으로 추정되며 JEECV에 의한 질병인 VECNE 역시 빈번히 발생하고 있을 것으로 생각되나 안타깝게도 VECNE에 대한 체계적인 모니터링이나 질병 특성 연구가 부족한 실정이다.
- , 2008). 본 연구에서도 질병 진단 이후 일부 조사 대상 양식장에서는 사육수온을 35℃로 올려 3~5일 가온 처리하였을 때 폐사율이 감모하는 것을 확인하기도 하였으나 실질적으로 우리나라 사육시스템에서는 사육 수조별 가온이 어렵고 순환여과식으로 바이러스에 오염된 사육수로부터 격리가 거의 불가능하며 가온 처리에 따른 경제적 손실과 위험성으로 인해 쉽게 시도하기 어려운 것으로 조사되었다.
- 본 질병은 조사 대상 양식장에서 계절에 관계없이 연중 발생하였으며 뱀장어의 크기와도 무관하게 나타났다. 그러나 주로 당년에 입식한 어린 뱀장어에서 가장 먼저 질병 증상이 나타났으며 폐사율 또한 높아 양식장에 따라 동일시기 입식량의 50% 이상이 폐사한 사례도 있었다.
- 2017~2018년에 거쳐 인천 및 경기지역 뱀장어 양식장 4개소를 대상으로 질병 예찰 및 모니터링을 실시한 결과, 특징적으로 아가미울혈증상을 동반한 질병이 빈번히 발생하였다. 이 질병은 크기에 상관없이 발생하지만 입식 후 3개월 이내의 당년생 뱀장어에서 감염 빈도와 누적 폐사율이 높게 나타났다. 감염어는 새변의 중심정맥동(CVS)의 심한 울혈과 팽창, 간과 신장 조직의 출혈 등과 같은 병리조직학적 감염 특성을 보였다.
- 조직병리학적 관찰 결과, 아가미 새엽 중심정맥동 (Central Venous Sinus: CVS)에 다량의 혈액이 고여있는 울혈 증상이 확인되며, 1차 새엽상피와 2차 새엽의 기저부의 세포증생(hyperplasia)과 변성세포의 증가를 관찰할 수 있었다(Fig. 2A). 새엽 내 중심부 결합조직의 울혈과 새변 중심 혈관과 벽주세포 (Pillar cell)의 변성, 괴사에 따른 구조 파괴로 울혈이 나타나는 경우도 관찰되었다(Fig.
후속연구
- , 2012), 본 연구에서의 JEECV는 감염어의 아가미 뿐만 아니라 신장, 비장, 간 등의 내부 장기에서도 바이러스가 검출되어 감염조직에 큰 차이를 보이는 것으로 생각된다. 본 연구의 검사시료에서는 모두 JEECV만이 단독 검출되었으나, 본 연구 이외의 양식장의 아가미 조직에서 JEECV와 AngHV1가 복합적으로 검출되는 경우도 있어 이들 두 질병에 대한 상관관계 분석과 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 판단된다.
- 국내 뱀장어 양식장에서는 오래 전부터 JEECV가 분포하였을 것으로 추정되며 JEECV에 의한 질병인 VECNE 역시 빈번히 발생하고 있을 것으로 생각되나 안타깝게도 VECNE에 대한 체계적인 모니터링이나 질병 특성 연구가 부족한 실정이다. 향후 전국 뱀장어 양식장의 질병발생 현황 조사가 선행되어야 하며, 질병 피해 저감을 위한 예방, 역학, 치료 및 백신 연구 등의 후속 연구들이 조속히 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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