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문제 정의
- 그럼에도 본 실험은 조직유래 천연재료를 사용한 바이오잉크와 3D 바이오 프린터, 그리고 무지지체 배양 시스템을 이용하여 본래 추간판의 해부학적 구조와 성분 모사를 시도하고 유의미한 결과를 보였으며, 또한 추간판의 특정 부위에 국한되지 않고 통합적인 모델을 제시함으로써 추간판 질환 치료를 위한 발전된 가능성을 제시하였다.
- 따라서 본 연구에서는 콜라겐과 돼지연골 유래 세포외기질을 혼합한 바이오잉크를 제조한 뒤, 최근 조직공학 분야에서 다양하고 활발하게 응용되고 있는 3D 바이오프린팅 기술을 활용하여 섬유륜의 층판 구조를 구현한 지지체를 제작하였다. 또한, 연골세포와 세포가 합성한 세포외기질로 이루어진 무지지체(Scaffold-free) 조직 구조체로 수핵을 구현하여 섬유륜 모방 지지체와 결합함으로써 구조와 성분이 실제 추간판과 유사한 추간판 대체물 개발의 가능성을 확인하고자 하였다(그림 1).
- 뿐만 아니라 조직의 칼슘화를 막는 것에도 관여 한다고 알려져 있기 때문에[23] 수핵 모방 조직을 제작하는데 있어, 이러한 성분을 풍부하게 함유 시키는 것은 필수적이다. 본 실험에서는 이러한 수핵의 조건을 충족하기 위해서, 조직공학 분야에서 세포의 3차원 배양에 사용되는 방법 중 하나인 무지지체 배양 조직 제작 방식을 응용하여[24] 수핵 모방 무지지체 조직을 제작하였다. 본 연구에서 제작한 수핵 모방 무지지체 조직은 토끼 연골세포와 3차원 분화 유도 환경에서 연골세포가 합성하는 세포외기질의 복합물이다.
- 하지만 추간판 관련 질병은 추간판 각 부위에 독립적으로 발생하는 것이 아닌 연쇄적인 결함에 의한 것이기 때문에 추간판 기능 회복의 이상적인 형태는 추간판 전체를 복합적으로 재건하는 것이라고 할 수 있다[14-15]. 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해, 추간판을 구성하는 두 조직인 섬유륜과 수핵 조직을 각각 본래 해부학적 구조 및 성분과 유사하게 구현하는데 목적을 두었으며, 이를 위해 3D 바이오프린팅 및 무지지체 조직 제작 관련 조직공학적 기술을 응용하였다.
제안 방법
- 그 다음에 인큐베이터에서 16시간동안 0.1% Collagenase 처리 후 얻은 연골세포를 2번의 계대배양(P2)까지 세포 배양 배지(DMEM(Gibco), 10% FBS(Biotechnics research INC.), 5 ng/ml FGF(R&D systems), 100 U/ml penicillin G-100 μg/ml streptomycin(Gibco))를 이용하여 배양한다.
- 글리코사미노글리칸의 양을 확인하기위해 Blyscan sulfated Glycos-amino-glycan assay kit(Biocolor)를 이용하여 수핵 모방 무지지체 조직의 배양 1일, 5일, 5주 차에 각각 정량 분석 실험을 진행하였다.
- 두 번째로, 단일 세포에 할당되는 공간의 규모는 나노에서 마이크로 단위로 무척 작은 반면[25], 본 연구에서 제작된 지지체는 천연고분자 바이오잉크의 3D 프린팅 기술의 제한으로 500 µm이상의 상대적으로 큰 공간을 제공한다.
- 따라서 본 연구에서는 콜라겐과 돼지연골 유래 세포외기질을 혼합한 바이오잉크를 제조한 뒤, 최근 조직공학 분야에서 다양하고 활발하게 응용되고 있는 3D 바이오프린팅 기술을 활용하여 섬유륜의 층판 구조를 구현한 지지체를 제작하였다. 또한, 연골세포와 세포가 합성한 세포외기질로 이루어진 무지지체(Scaffold-free) 조직 구조체로 수핵을 구현하여 섬유륜 모방 지지체와 결합함으로써 구조와 성분이 실제 추간판과 유사한 추간판 대체물 개발의 가능성을 확인하고자 하였다(그림 1).
- 토끼 추간판, 섬유륜 모방 지지체, 연골세포가 파종된 섬유륜 모방 조직, 수핵 모방 무지지체 조직, 추간판 모방 복합 조직에서 H&E염색을 통해 세포 모양 및 분포를 확인하였고 Safranin-O(S-O) 염색을 통해 글리코사미노글리칸을 확인 하였다. 또한 면역조직염색을 통해 제 1형, 2형 콜라겐 발현을 확인하였다.
- 미세압출(micro-extrution) 방식의 3D 바이오프린터(대전 한국기계원)와 바이오잉크로 도관 지지체를 제작(Thickness: 400 μm, Thick shift: 98%, Grid: 1 mm, Angle: 60o, −60o crossed, Inner Diameter: 5 mm, Outer Diameter: 10 mm, Length: 60 mm) 후300 mMEDC-NHS 수용액에 하룻밤 처리하여 가교 시킨다.
- 세포 증식을 확인하기 위해 지지체에 P2 토끼 연골세포를 파종한 후 1일, 4일, 7일, 10일 차에 EZ-Cytox kit(DoGen)를 이용하여 WST 실험을 진행하였다.
- 세포를 파종 한 지지체에는 10일 배양 후 SEM 이미지 촬영 전, 0.4% 글루타르알데히드(Sigma-Aldrich)에 12시간 처리 한 뒤 50, 70, 90, 100% 에탄올(덕산)에 각 1시간씩 담가 탈수 시키는 전처리 과정을 진행하였고, 세포 파종이 안 된 지지체는 2일 동안 동결건조 한 뒤 탈수 후 주사전자현미경(JEOL, JSM-6700F)으로 이미지를 촬영하였다.
- 섬유륜 모방 지지체의 구조를 섬유륜 본래 해부학적 구조와 유사하게 구현하는 데에는 미세압출(Micro-extrusion) 방식의 3D 바이오프린터와 부속 모델링 소프트웨어가 중요한 역할을 하였다[16]. 소프트웨어를 이용하여 층판 구조 및 60o 로 기울어진 섬유륜의 층판 패턴을 모델링 하였고, 프린팅을 통해 이 계산된 모델을 원하는 크기로 제작하였다. 그리고 외관사진과 SEM 촬영 결과를 통해 제작된 지지체의 전체 크기, 가닥의 두께 및 패턴 등이 사전에 모델링한것과 유사함을 확인할 수 있었다.
- 지지체에 P2 토끼 연골세포를 파종을 한 후 하루 뒤에 Live&Dead Kit(Thermofisher scientific, USA)를 1시간 동안 처리 후 공초점 현광 현미경(Nikon-ESC LPSE TE2000U, 아주대학교 세포치료센터) (ex: 495 nm em: Live-515 nm, Dead-635 nm)을 이용해 세포 독성을 확인하였다.
- 하지만 본 연구에는 몇 가지 한계점이 존재한다. 첫 번째로, 수핵 모방 무지지체 조직과 3D 바이오프린팅 섬유륜 모방 조직을 통합된 복합 조직으로 만들기 위해, 토끼 연골세포를 섬유륜 모방 지지체에 접종하여 분화 배양한 조직과동일한 세포를 일정기간 배양한 수핵 모방 무지지체 조직을 물리적으로 복합화 하였다. 하지만 이미 섬유륜과 수핵 특성을 가진 조직으로 분화된 조직이어서 물리적으로 복합화 후 5주간의 배양을 더 진행하였으나 두 조직이 완전하게 결합되지는 않았다.
- 토끼 추간판, 섬유륜 모방 지지체, 연골세포가 파종된 섬유륜 모방 조직, 수핵 모방 무지지체 조직, 추간판 모방 복합 조직에서 H&E염색을 통해 세포 모양 및 분포를 확인하였고 Safranin-O(S-O) 염색을 통해 글리코사미노글리칸을 확인 하였다.
대상 데이터
- 2주령 뉴질랜드 화이트 토끼 대퇴골에서 연골을 분리. 그 다음에 인큐베이터에서 16시간동안 0.
- 8주령 돼지 대퇴골에서 연골을 분리 한 후 블렌더를 이용하여 분쇄한다. 분쇄된 돼지연골 유래 세포외기질 파우더를 저장액에 700 ml/g 12시간, SDS 50 ml/g 2시간, Dnase 100 μm/g 하룻밤 동안 처리하여 탈세포 과정을 진행한 후에 원심분리기(10000 rpm, 20 min)를 이용하여 3차수로 세척한다.
- 본 실험에서는 이러한 수핵의 조건을 충족하기 위해서, 조직공학 분야에서 세포의 3차원 배양에 사용되는 방법 중 하나인 무지지체 배양 조직 제작 방식을 응용하여[24] 수핵 모방 무지지체 조직을 제작하였다. 본 연구에서 제작한 수핵 모방 무지지체 조직은 토끼 연골세포와 3차원 분화 유도 환경에서 연골세포가 합성하는 세포외기질의 복합물이다. 일반적으로, 연골세포가 합성하는 세포외기질은 제 2형 콜라겐 및 글리코사미노글리칸, 어그리칸 등이다.
데이터처리
- 통계학적 비교분석은 GraphPad PRISM statistical package(ver 7.00, Graphpad software INC, San Diego, USA)를 이용하였고, 각 실험군 간의 비교는 Unpaired t test와 one-way analysis of ANOVA test로 진행하였다. 그림에서 각각의 수치는 평균 ± 표준편차(mean ± S.
성능/효과
- 토끼 추간판 조직의 H&E 염색 결과, 섬유륜 부분의 세포 배열이 타원형으로 겹겹이 쌓인 층판 구조를 이루고 있는 것을 확인 하였다(그림 5, A(H&E)). S-O 염색 결과를 통해 섬유륜 부분보다 수핵 부분에 진하게 염색이 된 것을 확인 하였다(그림 5, A(S-O)). 제 1형 콜라겐은 수핵조직 대비 섬유륜 부분에서 진하게 염색이 되었고, 제 2형 콜라겐은 섬유륜 조직 대비 수핵 부분에 진하게 염색이 된 것을 확인 하였다(그림 5, A(Col I, Col II)).
- 조직학 염색 결과, H&E 염색을 통해 섬유륜 모방 지지체에 토끼 연골세포가 부착되어 있는 것을 확인 할 수 있었다. S-O 염색에서 제작된 지지체 구조 위에 세포가 배양 되면서 세포외기질 구성요소인 글리코사미노글리칸이 형성되었음을 확인하였다. 또한 면역조직염색 결과에서도 부착 증식된 연골세포가 제1형 콜라겐을 합성하고 있음을 확인 하였다(그림 3).
- 일반적으로, 연골세포가 합성하는 세포외기질은 제 2형 콜라겐 및 글리코사미노글리칸, 어그리칸 등이다. 그렇기 때문에 본 연구에서는 연골세포를 이용한 무지지체 조직이 수핵 대체물에 적합하다고 판단하였고 조직학적 염색 및 정량 결과, 수핵 모방 무지지체 조직은 예상대로 제 2형 콜라겐과 글리코사미노글리칸을 풍부하게 함유하고 있었다. 3D 프린팅된 섬유륜 모방 지지체와 복합 조직을 만들기 위해서 수핵 모방 무지지체 조직을 일정기간 배양하여 골화 되지 않은 상태로 지름 10 mm이상까지 성장시키는데 성공하였다.
- 그리고 섬유륜 구조 모방 지지체의 세포 독성 평가를 하기 위해서 섬유륜 모방 지지체에 토끼 연골세포를 8x106 세포 파종 후하루 뒤에 Live & Dead kit을 이용한 표지 후 공초점 현광 현미경 이미지를 확인한 결과, 대부분이 초록색 형광을 띄며 붉은색 형광이 거의 관찰되지 않았다(그림 2, C).
- 소프트웨어를 이용하여 층판 구조 및 60o 로 기울어진 섬유륜의 층판 패턴을 모델링 하였고, 프린팅을 통해 이 계산된 모델을 원하는 크기로 제작하였다. 그리고 외관사진과 SEM 촬영 결과를 통해 제작된 지지체의 전체 크기, 가닥의 두께 및 패턴 등이 사전에 모델링한것과 유사함을 확인할 수 있었다. 또한, 섬유륜은 제 1형 콜라겐이 주를 이루고 제 2형 콜라겐 성분 또한 포함하기 때문에[17], 제 1형 콜라겐을 제 2형 콜라겐이 주성분인 돼지 연골 유래 세포외기질과 혼합한 바이오잉크를 프린팅에 사용하였다.
- 또한, 일반적인 추간판 조직을 구성하는 성분과 유사하게, 섬유륜 부분에는 제 1형 콜라겐이 수핵 부분보다 강하게 발현하였으며, 제 2형 콜라겐은 수핵 부분이 섬유륜 부분보다 강하게 발현된 것을 조직학적 염색을 통해 확인하였다. 따라서 본 연구 결과들을 통해, 그 해부학적 구조와 구성 성분이 본래 추간판과 유사한 추간판 모방 조직을 성공적으로 제작하였음을 알 수 있었다.
- 두 번째로, 단일 세포에 할당되는 공간의 규모는 나노에서 마이크로 단위로 무척 작은 반면[25], 본 연구에서 제작된 지지체는 천연고분자 바이오잉크의 3D 프린팅 기술의 제한으로 500 µm이상의 상대적으로 큰 공간을 제공한다. 따라서 실제 추간판 섬유 조직과 비교할 때 세포활동과 물리적 특성 및 세포분화에 영향을 주는 변수로 작용할 것으로 예상된다. 마지막으로, 본 연구 결과는 생체외 환경에서 단기적으로 관찰한 결과이며, 장기적 배양 또는 생체내 환경이 모방 조직에 어떤 영향을 미칠지는 아직 미지수로 남아있다.
- 그리고 섬유륜 구조 모방 지지체의 세포 독성 평가를 하기 위해서 섬유륜 모방 지지체에 토끼 연골세포를 8x106 세포 파종 후하루 뒤에 Live & Dead kit을 이용한 표지 후 공초점 현광 현미경 이미지를 확인한 결과, 대부분이 초록색 형광을 띄며 붉은색 형광이 거의 관찰되지 않았다(그림 2, C). 또한 WST 실험 결과, 1일, 4일, 7일, 10일차에서 세포 대사기능이 일반 배양 접시에서 키웠을 때 대비 85% 이상을 유지하는 것을 확인하였다(그림 2, D). 조직학 염색 결과, H&E 염색을 통해 섬유륜 모방 지지체에 토끼 연골세포가 부착되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.
- S-O 염색에서 제작된 지지체 구조 위에 세포가 배양 되면서 세포외기질 구성요소인 글리코사미노글리칸이 형성되었음을 확인하였다. 또한 면역조직염색 결과에서도 부착 증식된 연골세포가 제1형 콜라겐을 합성하고 있음을 확인 하였다(그림 3).
- 무지지체 배양 시스템을 이용하여 제작한 수핵 모방 무지 지체 조직은 배양 시간이 지날수록 크기가 커진 것을 확인할 수 있다(그림 4, A(Gross images, H&E)). 또한 세포외기질의 발현이 시간에 따라 증가 하는 것을 확인 하였으며, 글리코사미노글리칸 정량 실험 결과 역시 배양 시간이 경과함에 따라서 통계적으로 유의미하게 정량 값이 높아지는 것을 확인 할 수 있었다(그림 4, A(S-O), B). 제 2형 콜라겐면역조직 염색결과에서 또한 배양 시간이 경과함에 따라, 발현이 증가하는 경향을 확인할 수 있었다(그림 4, A(Col II)).
- 추간판 모방 복합 조직은 중앙에 수핵 부분이 존재하고 수핵 주변을 층판 형태로 감싸는 섬유륜 조직으로 구성되어있으며 배양 기간 동안 그 형태와 크기를 일정하게 유지하였고, 이로써 제작된 추간판 모방 복합 조직의 해부학적 구조가 추간판 본래의 구조와 유사성을 보인다는 점을 확인하였다. 또한, 일반적인 추간판 조직을 구성하는 성분과 유사하게, 섬유륜 부분에는 제 1형 콜라겐이 수핵 부분보다 강하게 발현하였으며, 제 2형 콜라겐은 수핵 부분이 섬유륜 부분보다 강하게 발현된 것을 조직학적 염색을 통해 확인하였다. 따라서 본 연구 결과들을 통해, 그 해부학적 구조와 구성 성분이 본래 추간판과 유사한 추간판 모방 조직을 성공적으로 제작하였음을 알 수 있었다.
- 따라서 실제 추간판 섬유 조직과 비교할 때 세포활동과 물리적 특성 및 세포분화에 영향을 주는 변수로 작용할 것으로 예상된다. 마지막으로, 본 연구 결과는 생체외 환경에서 단기적으로 관찰한 결과이며, 장기적 배양 또는 생체내 환경이 모방 조직에 어떤 영향을 미칠지는 아직 미지수로 남아있다. 이런 제한점들은 배양 환경 및 방법의 개선, 3D 바이오 프린팅 기술의 향상 등을 통해 추후 개선이 필요하다.
- 무지지체 배양 시스템을 이용하여 제작한 수핵 모방 무지 지체 조직은 배양 시간이 지날수록 크기가 커진 것을 확인할 수 있다(그림 4, A(Gross images, H&E)).
- 바이오잉크와 3D 바이오프린터를 이용하여 제작한 섬유륜 모방 지지체가 모델링된 수치에(Angle: 60°, -60° crossed, Inner Diameter: 5 mm, Outer Diameter: 10 mm, Height: 4mm) 부합하게 제작이 된 것을 확인 할 수 있었다(그림 2, A).
- 세포 파종을 하지 않은 섬유륜 모방 지지체의 H&E 염색 결과 층판 구조를 확인 할 수 있었으며, S-O 염색과 제1형 콜라겐 면역조직염색 또한 지지체에서 염색되어 콜라겐을 기반으로 하는 바이오 잉크의 구성 성분에 부합하는 결과를 얻었다.
- 3D 프린팅된 섬유륜 모방 지지체와 복합 조직을 만들기 위해서 수핵 모방 무지지체 조직을 일정기간 배양하여 골화 되지 않은 상태로 지름 10 mm이상까지 성장시키는데 성공하였다. 수핵 모방 무지지체 조직의 크기는 배양 기간 동안 증가하였는데, 글리코사미노글리칸의 양 또한 함께 증가함을 정량 분석을 통해 확인하였다. 이처럼, 제작된 수핵 모방 무지지체 조직은 수핵 본래의 성분과 유사한 구성성분을 포함하고 있으며 배양기간에 따른 크기 조절이 가능하다.
- 제 1형 콜라겐 및 돼지연골 유래 세포외기질은 모두 천연재료이기 때문에 세포 생존확인을 위한 Live&Dead 실험과 WST 실험에서 모두 세포 독성이 없음을 확인하였다.
- S-O 염색 결과에서 혼합한 두 조직 모두에서 세포가 만들어 내는 추간판 조직 기질인 글리코사미노글리칸이 형성되었음을 확인하였다(그림5, B(S-O)). 제 1형 콜라겐은 수핵 모방 무지지체 조직 부위보다 섬유륜 모방 지지체 및 그 주위에 있는 세포 기질에서 진하게 염색된 것을 확인 할 수 있었으며, 반대로 제 2형 콜라겐은 섬유륜 모방 지지체 및 그 주위 세포 기질 보다 수핵 모방 무지지체 조직에서 진하게 염색된 것을 확인 할 수 있었다(그림 5, B(Col I, Col II)).
- 또한 세포외기질의 발현이 시간에 따라 증가 하는 것을 확인 하였으며, 글리코사미노글리칸 정량 실험 결과 역시 배양 시간이 경과함에 따라서 통계적으로 유의미하게 정량 값이 높아지는 것을 확인 할 수 있었다(그림 4, A(S-O), B). 제 2형 콜라겐면역조직 염색결과에서 또한 배양 시간이 경과함에 따라, 발현이 증가하는 경향을 확인할 수 있었다(그림 4, A(Col II)).
- 조직학 염색 결과, H&E 염색을 통해 섬유륜 모방 지지체에 토끼 연골세포가 부착되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.
- 추간판 모방 복합 조직은 중앙에 수핵 부분이 존재하고 수핵 주변을 층판 형태로 감싸는 섬유륜 조직으로 구성되어있으며 배양 기간 동안 그 형태와 크기를 일정하게 유지하였고, 이로써 제작된 추간판 모방 복합 조직의 해부학적 구조가 추간판 본래의 구조와 유사성을 보인다는 점을 확인하였다. 또한, 일반적인 추간판 조직을 구성하는 성분과 유사하게, 섬유륜 부분에는 제 1형 콜라겐이 수핵 부분보다 강하게 발현하였으며, 제 2형 콜라겐은 수핵 부분이 섬유륜 부분보다 강하게 발현된 것을 조직학적 염색을 통해 확인하였다.
- 제 1형 콜라겐은 수핵조직 대비 섬유륜 부분에서 진하게 염색이 되었고, 제 2형 콜라겐은 섬유륜 조직 대비 수핵 부분에 진하게 염색이 된 것을 확인 하였다(그림 5, A(Col I, Col II)). 추간판 모방 복합조직 외관 사진을 보면 가운데 수핵 부분이 존재하고 수핵 주변에 층판 형태로 감싸는 섬유륜 조직으로 구성되어 있으며 배양 기간 동안 그 형태와 크기를 유지하는 것을 확인할 수 있었다(그림 5, B(Gross images)). H&E 염색 결과로 섬유륜 모방 지지체 사이사이에 세포가 존재를 하는 것을 확인 할 수 있었다(그림 5, B(H&E)).
- 또한 지지체 측면에서는 본래 섬유륜의 해부학적 구조를 모사하여 구현한 60o 각도의 가닥 패턴을 확인 할 수 있었다(그림2, B, b). 토끼 연골세포를 파종한 뒤 10일 후에 지지체에 토끼 연골세포가 부착 증식하여 지지체 가닥 사이에 세포외기질이 형성되었음을 확인 하였다(그림 2, B, c, d). 그리고 섬유륜 구조 모방 지지체의 세포 독성 평가를 하기 위해서 섬유륜 모방 지지체에 토끼 연골세포를 8x106 세포 파종 후하루 뒤에 Live & Dead kit을 이용한 표지 후 공초점 현광 현미경 이미지를 확인한 결과, 대부분이 초록색 형광을 띄며 붉은색 형광이 거의 관찰되지 않았다(그림 2, C).
- 토끼 추간판 조직의 H&E 염색 결과, 섬유륜 부분의 세포 배열이 타원형으로 겹겹이 쌓인 층판 구조를 이루고 있는 것을 확인 하였다(그림 5, A(H&E)).
후속연구
- 마지막으로, 본 연구 결과는 생체외 환경에서 단기적으로 관찰한 결과이며, 장기적 배양 또는 생체내 환경이 모방 조직에 어떤 영향을 미칠지는 아직 미지수로 남아있다. 이런 제한점들은 배양 환경 및 방법의 개선, 3D 바이오 프린팅 기술의 향상 등을 통해 추후 개선이 필요하다.
- 추간판의 손상에 따른 문제를 근본적으로 해결하기 위해서는 추간판의 생체역학적 기능을 온전히 대체하면서도 뛰어난 생체적합성을 가지는 조직공학적 대체물을 개발할 필요가 있다. 조직 기능의 회복 및 대체를 위해 조직 공학 분야에서는 다양한 바이오 소재를 이용한 3차원 지지체를 기반으로 세포를 배양하여 조직공학적 구조체를 개발하는 연구가 활발히 진행 중이다.
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