[논문]Burkholderia sp. OS17의 항균활성 증진을 위한 배양최적화

남영호; 최아영; 황병수; 정유진

doi:10.7845/kjm.2018.8036

Burkholderia sp. OS17의 항균활성 증진을 위한 배양최적화
Antimicrobial activities of Burkholderia sp. strains and optimization of culture conditions 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.54 no.4, 2018년, pp.428 - 435

남영호 (국립낙동강생물자원관 배양기술개발부) , 최아영 (국립낙동강생물자원관 배양기술개발부) , 황병수 (국립낙동강생물자원관 산업소재화연구부) , 정유진 (국립낙동강생물자원관 배양기술개발부)

초록
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본 연구는 담수환경에서 항균활성을 보유한 미생물을 발굴하고, 활성 증진을 위해 배양조건을 최적화하는 것이다. 상주시 중동면 오상저수지에서 시료를 채취하여 38종의 미생물을 순수분리하였다. 16S rRNA 염기서열 분석에 근거하여 Proteobacteria강(22종), Actinobacteria강(7종), Bacteroidetes강(6종), Firmicutes강(3종)으로 구성되어있는 것을 확인하였다. 메티실린내성 황색포도상구군 등 10종의 유해미생물에 대한 항균활성을 보유한 Burkholderia sp. OS17 균주를 선발하였다. 항균활성 증진을 위한 상용배지, 온도, 초기 pH별 생육 및 항균활성 비교실험을 수행하였다. OS17 균주는 YPD 배지, $35^{\circ}C$, pH 6.5로 배양했을 때 가장 활성이 높았다. LB, NB, TSB, R2A 배지와 $20^{\circ}C$, $25^{\circ}C$ 배양했을 때는 생장은 가능하나 항균활성이 전혀 없었다. 이전결과를 바탕으로 YPD 배지, $35^{\circ}C$에서 배양하면서 5 L fermenter를 이용하여 생육, 항균활성, pH 확인을 통해 배양 48시간을 최적 배양시간으로 선정하였다. 항균활성을 보유한 미생물의 배양 최적화는 항균물질 생산에 영향을 미치고, 이는 상업적 응용에 이점으로 작용할 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we isolated and identified bacteria from freshwater and soil collected from Osang reservoir, to screen antimicrobial bacteria against various pathogenic bacteria. 38 strains were isolated and assigned to the class Proteobacteria (22 strains), Actinobacteria (7 strains), Bacteroidets (6 strains), and Firmicutes (3 strains) based on 16S rRNA gene sequence analysis. Among them, strain OS17 showed a good growth inhibition against 5 methicillin-resistant Staphylococcus aureus subsp. aureus strains and Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Filobasidium neoformans. As a result of the 16S rRNA gene sequence analysis, strain OS17 show the high similarity with Burkholderia ambifaria $AMMD^T$, B. diffusa $AM747629^T$, B. tettitorii $LK023503^T$ 99.8%, 99.7%, 99.6%, respectively. We investigated cell growth and antimicrobial activity according to commercial culture medium, temperature, pH for culture optimization of strain OS17. Optimal conditions for growth and antimicrobial activity in strain OS17 were found to be: YPD medium, $35^{\circ}C$ and pH 6.5. When the strain was cultured in LB, NB, TSB, R2A media at $20^{\circ}C$ and $25^{\circ}C$, the antimicrobial activity did not show. Culture filtrate of strain OS17 showed antimicrobial activity against 5 MRSA strains, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, and Filobasidium neoformans with inhibition zones from 2 to 8 mm. Optimal reaction time was 48 h in YPD medium, 100 rpm and 0.3 vvm in 2 L-scale fed-batch fermentation process for antimicrobial activity. Culture optimization of strain OS17 can be improved on antimicrobial activity. Therefore, the antimicrobial activity of Burkholderia sp. OS17 had potential as antibiotics for pathogens including MRSA.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing the relationships among isolates belonging to the order Burkholderia sp. OS17 and related taxa.
표 Table 1. Strains obtained from Osang reservoir
그림 Fig. 2. Growth, pH (A) and antimicrobial activities (B) of Burkholderia sp. OS17 according to commercial media.
그림 Fig. 3. Growth, pH (A) and antimicrobial activities (B) of Burkholderia sp. OS17 according to culture temperature.
그림 Fig. 4. Growth, pH (A) and antimicrobial activities (B) of Burkholderia sp. OS17 according to initial pH.
그림 Fig. 6. HPLC profiles of Burkholderia sp. OS17 according to commercial media.
그림 Fig. 5. Growth, pH and antimicrobial activities of Burkholderia sp. OS17 according to culture time by 5 L fermenter
그림 Fig. 7. HPLC profiles of Burkholderia sp. OS17 according to culture temperature.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 담수환경에서 항균활성을 보유한 미생물을 발굴하고, 활성 증진을 위해 배양조건을 최적화하는 것이다. 상주시 중동면 오상저수지에서 시료를 채취하여 38종의 미생물을 순수분리하였다.
본 연구의 목적은 항생물질을 생산하는 담수미생물을 발굴 하고 항균활성을 증진시킬 수 있는 배양조건을 최적화하는 것이다.
이에 향후, 공통 피크에서 나타난 항균물질을 순수하게 정제하여 단일 물질로 인해 나타난 것인지 확인하고, 화학적 특성과 구조를 규명하고 자 한다. 아울러 세포 및 동물 실험을 통해 인체에 대한 독성여부도 파악하여, 항생제로서의 개발 가능성을 확인하고자 한다.
OS17 균주는 특정배양조건에서 항균활성이 나타났으며, HPLC 분석을 통해 활성을 보유한 피크를 확인하였다. 이에 향후, 공통 피크에서 나타난 항균물질을 순수하게 정제하여 단일 물질로 인해 나타난 것인지 확인하고, 화학적 특성과 구조를 규명하고 자 한다. 아울러 세포 및 동물 실험을 통해 인체에 대한 독성여부도 파악하여, 항생제로서의 개발 가능성을 확인하고자 한다.

제안 방법

HPLC는 Agilent 1260 system과 254 nm 검출파장을 사용하였으며, 분석방법은 C18 컬럼(Agilent Extend-C18 5u 250 × 4.6 mm), 유속 1 ml/min, 이동상은 물(A): 아세토니트릴(B) 기울기 조건(0~5 min: 5% B, 5~45 min: 5~95% B, 45~55 min: 95% B)를 주어 10 µl씩 주입하여 분석을 진행하였다.
OS17 균주는 5 L fermenter를 이용하여 최적 배양시간 조건을 확인하였다. 이전 실험결과로 선정된 최적조건으로 YPD 배지, 35°C, 교반속도 100 rpm, 통기량은 0.
OS17 균주는 특정배양조건에서 항균활성이 나타났으며, HPLC 분석을 통해 활성을 보유한 피크를 확인하였다. 이에 향후, 공통 피크에서 나타난 항균물질을 순수하게 정제하여 단일 물질로 인해 나타난 것인지 확인하고, 화학적 특성과 구조를 규명하고 자 한다.
OS17 균주는 배지에 따른 생육의 차이가 많이 났다. OS17 균주의 S. aureus CCARM 3089･3090･3091･3095, S. aureus KCCM 40510, E. faecalis KCCM 11814, B. cereus KCTC 3624, B. subtilis KACC 10111, E. coli KCTC 2443, F. neoformans KCTC 7902 10종에 대하여 생장억제거리를 측정하였다. OS17 균주는 YPD 배지와 Bennett’s 배지에서 높은 항균활성을 나타냈으며, LB, NB, TSB, R2A 배지의 배양액은 항균활성이 전혀 없었다(Fig.
1). OS17 균주의 생장이 가능한 배지, 온도, pH를 탐색하고 최적 생장조건을 확인하였다. OS17 균주는 R2A, TSA, MA, LB, NA 고체 배지에 모두 자랐으며, TSA와 LB에서 육안상 가장 잘 자랐다.
9였으며 대사산물로 산성물질이 생성되는 것으로 예상된다. OS17 균주의 최적배지는 YPD로 선정하였고 이후 진행되는 온도, 초기 pH별 생육 및 활성비교 실험은 YPD 배지에서 배양하여 진행하였다.
Reasoner’s2A agar (R2A, Difco), Tryptic Soy Agar (TSA, Difco), Marine Agar (MA, Difco), Luria Bertani (LB, Difco), Nutrient broth (NB, Difco)의 상용화된 고체배지를 사용하여 미생물을 획선평판법으로 접종한 뒤, 30°C에서 3일간 정치배양 후 배지종류에 따른 생장여부를 육안으로 관찰하였다.
온도는 고체배지에 균주를 접종한 후에 4℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃에서 3일 배양 후 육안으로 생장여부를 확인하였다. pH는 4~12까지 0.5 간격으로 액체배지의 pH를 조절한 후 균주를 접종하고 28℃, 180 rpm으로 3일간 배양 후 육안으로 생장여부를 확인하였다.
85% (w/v) NaCl 용액에 연속 희석하여 Reasoner’s2A agar (R2A, Difco) 고체배지에 도말한 후, 25℃에서 3일간 배양하였다. 균체의 다양한 형태적 특성에 따라 각각 분리하고, 계대배양 과정을 거쳐 순수 분리하였다. 유전자 분석서비스는 Macrogen에 의뢰하여 진행하였다.
5로 희석 후 100 µl를 고체배지에 도말하였다. 그 후 순수분리한 균주를 도말배지 위에 streaking 한 후 28℃, 24시간 정치배양 후 주변의 억제지대 (clear zone) 관찰을 통해 1차로 항균활성 보유 미생물을 확인하였다. 선발된 미생물을 30℃, 48시간, 130 rpm으로 진탕배양한 후, 배양상등액을 필터(0.
배양여액 400 µl를 종이디스크(paper disc)에 올려 완전건조 후 표적미생물이 도말된 고체배지에 올려 28℃, 24시간 정치배양 후 억제지대(inhibition zone)를 확인하였다.
배지는 LB, NA, TSB, YPD, R2A, Bennett’s의 상용화된 배지를 사용하여 배지종류 별 생육 및 항균활성을 확인하였다.
OS17 균주는 6개 배지 중 YPD와 Bennett’s 배지에서만 활성이 있고, 20~40℃ 배양온도에 활성 확인 시 30℃, 35℃에만 항균활성을 확인하였다. 배지와 배양온도별 항균활성 차이가 크기 때문에 각 배지･온도별HPLC 패턴을 확인하였다. 확인 결과, YPD와 Bennett’s 배지, 배양온도는 30℃, 35℃ 시료에서 머무름 시간 4.
본 실험을 위하여 경북 상주시 중동면의 축산농가 인근 오상저수지(36°26′22″N 128°16′40″S)에서 하천수와 퇴적토를 채취하였다. 수질환경은 멀티수질측정기인 YSI (556MPS)를 이용하여 측정하였다. 채취한 시료는 0.
생육패턴 확인결과, 접종 후 배양 24시간에 정지기로 들어서는 것으로 확인되었으며, 120시간 후에도 OD값은 감소되지 않았다. 시간별로 배양액을 회수하여 B. cereus KCTC 3624, S. aureus KCCM 4051 대상으로 평판디스크 측정법으로 배양시간별 항균활성을 확인하였다. 확인결과, 48시간 후 항균활성이 가장 좋았으며, 배양 120시간까지 항균활성은 더 증대되지 않고 유지되는 것을 확인하였다(Fig.
배지는 LB, NA, TSB, YPD, R2A, Bennett’s의 상용화된 배지를 사용하여 배지종류 별 생육 및 항균활성을 확인하였다. 온도는 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃에서 온도별로 배양하였으며, pH는 5.5~8.5까지 0.5 간격으로 배지의 초기 pH를 조절한 후 각각의 최종 배양물의 생육 및 항균활성을 확인하였다. 위의 배양조건 결과를 바탕으로 5 L fermenter를 이용한 시간대별 배양액의 항균활성 확인하여 가장 효율적으로 항균물질을 생산할 수 있는 배양시간을 선정하였다.
Reasoner’s2A agar (R2A, Difco), Tryptic Soy Agar (TSA, Difco), Marine Agar (MA, Difco), Luria Bertani (LB, Difco), Nutrient broth (NB, Difco)의 상용화된 고체배지를 사용하여 미생물을 획선평판법으로 접종한 뒤, 30°C에서 3일간 정치배양 후 배지종류에 따른 생장여부를 육안으로 관찰하였다. 온도는 고체배지에 균주를 접종한 후에 4℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃에서 3일 배양 후 육안으로 생장여부를 확인하였다. pH는 4~12까지 0.
5 간격으로 배지의 초기 pH를 조절한 후 각각의 최종 배양물의 생육 및 항균활성을 확인하였다. 위의 배양조건 결과를 바탕으로 5 L fermenter를 이용한 시간대별 배양액의 항균활성 확인하여 가장 효율적으로 항균물질을 생산할 수 있는 배양시간을 선정하였다. 항균미생물의 배지와 온도별 HPLC 패턴을 확인하기 위해 6개 배지에 5 ml씩 배양한 뒤, 에틸아세테이트로 2번 추출 후 농축하여 샘플로 사용하였다.
LB, NB, TSB, R2A 배지와 20℃, 25℃ 배양했을 때는 생장은 가능하나 항균활성이 전혀 없었다. 이전결과를 바탕으로 YPD 배지, 35℃에서 배양하면서 5 L fermenter를 이용하여 생육, 항균활성, pH 확인을 통해 배양 48시간을 최적 배양시간으로 선정하였다. 항균활성을 보유한 미생물의 배양 최적화는 항균물질 생산에 영향을 미치고, 이는 상업적 응용에 이점으로 작용할 수 있다.
최적 배지로 선정된 YPD 배지를 이용하여 온도별 생육을 비교하기 위해 생육량과 pH를 측정하였다. 균체성장은 20~35℃ 범위에서 OD값이 3.
최적 배지로 선정된 YPD 배지와 최적 배양온도 35℃에서 초기 pH별 생육을 비교하기 위해 생육량과 pH를 측정하였다. 균체성장은 pH 8.
배양여액 400 µl를 종이디스크(paper disc)에 올려 완전건조 후 표적미생물이 도말된 고체배지에 올려 28℃, 24시간 정치배양 후 억제지대(inhibition zone)를 확인하였다. 최종 선발한 항균미생물의 최적 배양조건 설정을 위해 배지, 온도, 초기 pH 별 생육 및 항균활성을 조사하였다. 초기 배양조건은 선발된 항균미생물을 종균(seed culture)으로 3% (v/v)로 접종하여, 28℃, 100 rpm으로 2일간 배양하였다.
항균활성 보유 미생물의 생장 가능한 배양조건과 최적 생장조건을 확인하기 위하여 배지, 온도, pH 테스트를 수행하였다. Reasoner’s2A agar (R2A, Difco), Tryptic Soy Agar (TSA, Difco), Marine Agar (MA, Difco), Luria Bertani (LB, Difco), Nutrient broth (NB, Difco)의 상용화된 고체배지를 사용하여 미생물을 획선평판법으로 접종한 뒤, 30°C에서 3일간 정치배양 후 배지종류에 따른 생장여부를 육안으로 관찰하였다.
항균활성 증진을 위한 배양배지 최적화 연구를 위해 상용 배지 LB, NB, TSB, YPD, R2A, Bennett’s 배지에서 균주 생육량과 pH를 측정하였다.
OS17 균주를 선발하였다. 항균활성 증진을 위한 상용배지, 온도, 초기 pH별 생육 및 항균활성 비교실험을 수행하였다. OS17 균주는 YPD 배지, 35℃, pH 6.

대상 데이터

메티실린내성 황색포도상구군 등 10종의 유해미생물에 대한 항균활성을 보유한 Burkholderia sp. OS17 균주를 선발하였다. 항균활성 증진을 위한 상용배지, 온도, 초기 pH별 생육 및 항균활성 비교실험을 수행하였다.
순수분리한 미생물 중 항균활성 보유 미생물을 탐색하기 위해 10종의 표적미생물을 사용하였고, 각 미생물들은 항생제내 성균주은행(ARM), 한국미생물보존센터(KCCM), 생물자원 센터(KCTC), 농업유전자원정보센터(KACC)에서 methicillinresistant Staphylococcus aureus subsp. aureus CCARM 3089･ 3090･3091･3095와 KCCM 40510, Bacillus cereus KCTC 3624, Bacillus subtilis KACC 10111, Escherichia coli KCTC 2443, Filobasidium neoformans KATC 7902를 분양 받았다. 표적 미생물을 30℃, 24시간 액체배양 한 뒤, 배양액을 분광광도계를 이용하여 OD₆₀₀값 0.
미생물의 핵산은 Qiagen DNeasy Tissue Kit를 이용하여 추출하였고, 16S rRNA 유전자의 증폭은 universal primer (27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'와 1492R, 5'-TA CGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하였다.
본 실험을 위하여 경북 상주시 중동면의 축산농가 인근 오상저수지(36°26′22″N 128°16′40″S)에서 하천수와 퇴적토를 채취하였다.
본 연구를 통하여 2016년 3월17일 낙동면 오상저수지에서 물과 주변 흙시료에서 각 24주씩 총 48균주들을 분리하였고, 중복되는 10종을 제외하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 오상저수지에서 분리한 미생물들은 Proteobacteria강 (22종), Actinobacteria강(7종), Bacteroidetes강(6종), Firmicutes 강(3종)으로 구성되어 있었다(Table 1).
본 연구는 담수환경에서 항균활성을 보유한 미생물을 발굴하고, 활성 증진을 위해 배양조건을 최적화하는 것이다. 상주시 중동면 오상저수지에서 시료를 채취하여 38종의 미생물을 순수분리하였다. 16S rRNA 염기서열 분석에 근거하여 Proteobacteria강(22종), Actinobacteria강(7종), Bacteroidetes 강(6종), Firmicutes강(3종)으로 구성되어있는 것을 확인하였다.
위의 배양조건 결과를 바탕으로 5 L fermenter를 이용한 시간대별 배양액의 항균활성 확인하여 가장 효율적으로 항균물질을 생산할 수 있는 배양시간을 선정하였다. 항균미생물의 배지와 온도별 HPLC 패턴을 확인하기 위해 6개 배지에 5 ml씩 배양한 뒤, 에틸아세테이트로 2번 추출 후 농축하여 샘플로 사용하였다. HPLC는 Agilent 1260 system과 254 nm 검출파장을 사용하였으며, 분석방법은 C18 컬럼(Agilent Extend-C18 5u 250 × 4.

데이터처리

미생물의 핵산은 Qiagen DNeasy Tissue Kit를 이용하여 추출하였고, 16S rRNA 유전자의 증폭은 universal primer (27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'와 1492R, 5'-TA CGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하였다. EzBioCloud (Yoon et al., 2017)를 사용하여 연관성이 높은 유전자 서열을 획득, 비교 및 분석을 진행하였다. Multiple alignment는 CLUSTAL X program을 사용하여 수행하였다(Thompson et al.

이론/모형

, 2017)를 사용하여 연관성이 높은 유전자 서열을 획득, 비교 및 분석을 진행하였다. Multiple alignment는 CLUSTAL X program을 사용하여 수행하였다(Thompson et al., 1997). 그 이후에 BioEdit program (Hall, 1999)을 사용하여 염기서열들을 정렬하고, 계통수는 MEGA 7 program (Kumar et al.
, 1997). 그 이후에 BioEdit program (Hall, 1999)을 사용하여 염기서열들을 정렬하고, 계통수는 MEGA 7 program (Kumar et al., 2016)에서 제공하는 neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987), maximum-likelihood (Felsenstein, 1985) 그리고 maximumparsimony (Fitch, 1971) algorithms을 이용하여 그렸다. 순수분리된 미생물의 16S rRNA 유전자의 상동성은 EzBioCloud 를 통해 계산하였다.
, 2016)에서 제공하는 neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987), maximum-likelihood (Felsenstein, 1985) 그리고 maximumparsimony (Fitch, 1971) algorithms을 이용하여 그렸다. 순수분리된 미생물의 16S rRNA 유전자의 상동성은 EzBioCloud 를 통해 계산하였다. Bootstrap values는 1,000 replicates를 만들어 계산하였다(Felsenstein, 1985).
균체의 다양한 형태적 특성에 따라 각각 분리하고, 계대배양 과정을 거쳐 순수 분리하였다. 유전자 분석서비스는 Macrogen에 의뢰하여 진행하였다. 미생물의 핵산은 Qiagen DNeasy Tissue Kit를 이용하여 추출하였고, 16S rRNA 유전자의 증폭은 universal primer (27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'와 1492R, 5'-TA CGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하였다.

성능/효과

상주시 중동면 오상저수지에서 시료를 채취하여 38종의 미생물을 순수분리하였다. 16S rRNA 염기서열 분석에 근거하여 Proteobacteria강(22종), Actinobacteria강(7종), Bacteroidetes 강(6종), Firmicutes강(3종)으로 구성되어있는 것을 확인하였다. 메티실린내성 황색포도상구군 등 10종의 유해미생물에 대한 항균활성을 보유한 Burkholderia sp.
순수분리된 38종의 균주를 대상으로 항균활성 보유 미생물을 탐색한 결과, OS17 균주가 획선평판법과 배양여액을 이용한 paper disc법 모두에서 항균활성을 확인하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의한 계통분석을 통해 OS17 균주가 Burkholderia ambifaria AMMD^T, Burkholderia diffusa AM747629^T, Burkholderia tettitorii LK023503^T 와각각99.8%, 99.7%, 99.6%의 상동성을 보였고 Burkholderia 속 (genus)에 속하는 종(species)으로 확인하였다(Fig. 1). OS17 균주의 생장이 가능한 배지, 온도, pH를 탐색하고 최적 생장조건을 확인하였다.
본 연구를 통하여 2016년 3월17일 낙동면 오상저수지에서 물과 주변 흙시료에서 각 24주씩 총 48균주들을 분리하였고, 중복되는 10종을 제외하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 오상저수지에서 분리한 미생물들은 Proteobacteria강 (22종), Actinobacteria강(7종), Bacteroidetes강(6종), Firmicutes 강(3종)으로 구성되어 있었다(Table 1). 오상저수지의 환경분석 결과, 수온은 14.
OS17 균주는 6개 배지 중 YPD와 Bennett’s 배지에서만 활성이 있고, 20~40℃ 배양온도에 활성 확인 시 30℃, 35℃에만 항균활성을 확인하였다.
OS17 균주의 생장이 가능한 배지, 온도, pH를 탐색하고 최적 생장조건을 확인하였다. OS17 균주는 R2A, TSA, MA, LB, NA 고체 배지에 모두 자랐으며, TSA와 LB에서 육안상 가장 잘 자랐다. 또한, 이 균주는 배양온도 10℃에서 45℃까지 생장이 가능했고, 20~35℃까지 육안상 가장 잘 자랐다.
5에서 4~8 mm의 억제거리를 확인하였다. OS17 균주는 초기 pH가 6.5일 때 10종의 유해미생물에 대해 가장 활성이 높았다(Fig. 4B). 따라서, 항균활성 최적 초기 pH 는 6.
OS17 균주의 항생제내성균과 장내유해미생물 10종에 대한 온도별 항균활성확인 결과, 30℃와 35℃에서만 2~6 mm의 억제거리를 확인하였다. OS17 균주를 35℃에서 배양했을 때 그 배양여액 10종의 유해미생물에 대해 가장 활성이 높았으며, 20℃와 25℃ 배양여액은 전혀 활성이 없었다(Fig. 3B). 따라서, 항균활성 최적 배양온도는 35℃로 선정하였다.
3A). OS17 균주의 항생제내성균과 장내유해미생물 10종에 대한 온도별 항균활성확인 결과, 30℃와 35℃에서만 2~6 mm의 억제거리를 확인하였다. OS17 균주를 35℃에서 배양했을 때 그 배양여액 10종의 유해미생물에 대해 가장 활성이 높았으며, 20℃와 25℃ 배양여액은 전혀 활성이 없었다(Fig.
4A). OS17 균주의 항생제내성균과 장내유해미생물 10종에 대한 초기 pH별 항균활성확인 결과, pH 5.5~8.8까지 모두 활성이 있었으며 pH 6.5에서 4~8 mm의 억제거리를 확인하였다. OS17 균주는 초기 pH가 6.
항균활성 증진을 위한 배양배지 최적화 연구를 위해 상용 배지 LB, NB, TSB, YPD, R2A, Bennett’s 배지에서 균주 생육량과 pH를 측정하였다. 가장 높은 생육을 보인 배지는 LB, TSB, YPD 배지로 OD값이 각각 5.6, 5.1, 3.5로 확인되었고, R2A 배지에서는 OD값이 1.1로 가장 낮은 생육을 보였다(Fig. 2A). OS17 균주는 배지에 따른 생육의 차이가 많이 났다.
최적 배지로 선정된 YPD 배지와 최적 배양온도 35℃에서 초기 pH별 생육을 비교하기 위해 생육량과 pH를 측정하였다. 균체성장은 pH 8.0과 8.5에서 OD값이 7로 가장 잘 생장하였고, pH 5.5~7.5까지는 OD값이 2.8~5.1 범위로 확인하였다(Fig. 4A). OS17 균주의 항생제내성균과 장내유해미생물 10종에 대한 초기 pH별 항균활성확인 결과, pH 5.
OS17 균주는 R2A, TSA, MA, LB, NA 고체 배지에 모두 자랐으며, TSA와 LB에서 육안상 가장 잘 자랐다. 또한, 이 균주는 배양온도 10℃에서 45℃까지 생장이 가능했고, 20~35℃까지 육안상 가장 잘 자랐다. pH는 pH 4.
3 vvm 조건하에 진행하였다. 생육패턴 확인결과, 접종 후 배양 24시간에 정지기로 들어서는 것으로 확인되었으며, 120시간 후에도 OD값은 감소되지 않았다. 시간별로 배양액을 회수하여 B.
4 mg/L, 전기전도도는 330 µs/cm로 측정되었다. 순수분리된 38종의 균주를 대상으로 항균활성 보유 미생물을 탐색한 결과, OS17 균주가 획선평판법과 배양여액을 이용한 paper disc법 모두에서 항균활성을 확인하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의한 계통분석을 통해 OS17 균주가 Burkholderia ambifaria AMMD^T, Burkholderia diffusa AM747629^T, Burkholderia tettitorii LK023503^T 와각각99.
오상저수지의 환경분석 결과, 수온은 14.5°C, pH 7.8, DO 11.4 mg/L, 전기전도도는 330 µs/cm로 측정되었다.
YPD 배지가 Bennett’s 배지보다 활성이 더 좋은 이유는 함량이 더 높은 차이로 예측된다. 이 결과로 OS17균주의 항균물질 생산에 적합한 배지의 조성과 적절한 함량예측이 가능하다.
활성이 나타나면서 배양액의 pH가 2 가까이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 최적 배양시간은 접종 후 48시간까지 배양하는 것이 가장 효율적으로 항균 유용물질을 생산할 수 있는 조건으로 판단된다.
항균활성을 보였던 2개 배지의 조성과 함량은 YPD 배지(dextrose 2%, yeast extract 1%, peptone 2%)와 Bennett’s 배지(dextrose 1%, yeast extract 0.1%, proteose peptone No.3 0.2%)로 함량차이만 있을 뿐 조성이 유사하다.
확인 결과, YPD와 Bennett’s 배지, 배양온도는 30℃, 35℃ 시료에서 머무름 시간 4.9분에 공통적으로 나타나는 peak를 확인할 수 있었다(Figs. 6 and 7).
aureus KCCM 4051 대상으로 평판디스크 측정법으로 배양시간별 항균활성을 확인하였다. 확인결과, 48시간 후 항균활성이 가장 좋았으며, 배양 120시간까지 항균활성은 더 증대되지 않고 유지되는 것을 확인하였다(Fig. 5). 활성이 나타나면서 배양액의 pH가 2 가까이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
활성이 가장 좋았던 YPD 배양여액에서 F. neoformans에 대해서만 억제거리가 2 mm였고, 그 외 표적미생물에 대해서는 억제거리가 4~5 mm였다(Fig. 2B). 항균활성을 나타내는 YPD, Bennett`s 배양물은 pH가 3.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	미생물의 세포생장성과 항생물질 생산에 영향을 주는 요인은 무엇이 있는가?	이러한, 항균물질을 생산할 수 있는 미생물산업이 각광을 받으면서 대장균, 효모 등 미생물들의 유용물질 생산성을 높일 수 있는 배양조건, 정제공정 등의 최적화 연구의 중요성이 대두되었다. 이전의 많은 연구결과에 따르면 환경요인, pH, 온도, 공기량 등의 배양조건이 미생물의 세포생장성과 항생물질 생산에 영향을 줄 수 있다(Guerra-Santos et al., 1986; AbdelMawgoud et al.
	Burkholderia 속 미생물이 생산할 수 있는 항균제는 무엇이 있는가?	, 2011). 잘 알려진 종류로는 pyrrolnitrin (Cartwright et al., 1995), altericidins (Kirinuki et al., 1977), cepacin A와 cepacin B (Parke et al., 1984), pseudoanes 과 cepacidines A와 B (Meyers et al., 1987), pseudane (Homma et al., 1989), phenazine (Cartwright et al., 1995), cepaciamides A와 B (Jiao et al., 1996), quinolinone (Moon et al., 1996), lipo-peptides와 AFC-BC11 (Kang et al., 1998), CF661 (Quan et al., 2006)를 포함한다.
	항생물질은 무엇인가?	항생물질이란 모든 생물을 죽이거나 성장을 억제시키는 물질을 말하며 이러한 물질로 만든 약을 항생제(antibiotics) 또는 항균제(antimicrobial agents)라는 용어가 함께 사용되고 있다. 1960년도 들어서면서부터 전 세계적으로 항생제 내성균이 출현하면서 현재는 항생제 내성균과도 대항할 수 있는 미생물의 새로운 대사물질을 찾기 위한 노력이 계속되고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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