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문제 정의
- 미세조류 동결보존에 있어서 미국의 텍사스대학 조류 자원은행(UTEX)이 2018년 8월 기준으로 약 488 strains의 미세조류를 냉동 보존하고 있으며(Table 1), 이러한 냉동 보존에 의한 자원관리는 적은 비용으로 방대한 생물자원을 효율적으로 관리할 수 있도록 하고 있다(Brand and Diller 2004). 본 연구에서는 UTEX에서 동결보존에 성공한 strains 중 국립생물자원관에 보유하고 있는 Nitzschia frustulum (NIBRDIC000499724)와 Nitzschia amabilis (NIBRDIC000499742) 두 종을 대상으로 동결보존방법에 대한 연구를 수행하였다.
- 미세조류 중 규조류는 전 세계적으로 발견되며 규산질로 구성된 cell wall 은 이미 산업적으로 많이 이용되고 있다. 본 연구에서는 해양 규조류 Nizschia frustulum과 Nitzschia amabilis를 이용하여 장기 동결보존을 위한 기초연구를 수행하였다.
- 이 연구에서는 유용한 생물학적 자원인 미세조류 Nitzschia sp.에 대한 적절한 동결보존제를 탐색하였다. 국립생물자원관(NIBR) 국가배양센터에서는 미세조류 자원관리의 효율성을 높이기 위해 종 특성에 관계없는 균일한 동결보존제 및 보존방법 개발을 최종 목적으로 하고 있으며, 차후 연구에서는 유리화 과정을 조절하여 세포 손상을 최소화 하고 분자생물학적인 접근법을 활용하여 동결 직후의 살아있는 세포 수를 높일 수 있는 방향으로 연구를 확대할 계획이다.
제안 방법
- DMSO와 methanol은 멸균한 해수로 농도에 맞춰 희석한 후 클린벤치에서 DMSO는 Pall Life Sciences사의 0.2 μm DMSO Safty Syringe filter를 이용하여 여과하였고, methanol은 Sartorius stedim biotech의 0.2 μm Syringe filter로 여과하여 제조하였다.
- The concentrations of microalgae cells used for cryopreservation was 104 cells ml-1 . Glycerol and DMSO were used as CPAs to give a final concentrations of 5%, 10%, and 15%, respectively. For methanol, the final concentration of the preservation mixture was set at 12% due to the difficulty of dissolving in F / 2 medium.
- Glycerol은 F/2 배지 에 각각 10%, 20%, 30% 농도로 첨가한 후 121°C 에서 15분간 고압멸균 하였다.
- 2 ㎛ GTTP Membrane Filters를 이용하여 불순물을 여과한 해수를 121°C에서 15분간 고압멸균한 후 배지를 24°C의 적정온도로 식힌 상태에서 Guillard’s (F/2) Marine Water Enrichment Solution (50x, liquid, plant cell culture tested) (Sigma aldrich, USA)을 20 ml L-1 첨가하여 제조하였다. 냉동 보존을 위한 cell 농도를 맞추기 위해, 4주간 104 cells ml-1로 배양된 미세조류는 F/2 배지를 이용하여 농도를 각각 104 cells ml-1, 103 cells ml-1, 102 cells ml-1로 희석하여 준비하였다.
- 농도의 미세조류와 동결보존제는 2 ml cryo tube에 1 ml씩(미세조류 배양체 1 ml: 동결보존제 1 ml) 혼합하여 total volume 2 ml이 되도록 제조하였다. 냉동된 cryo tube 에서 각각의 보존제 최종농도는 5%, 10%, 15%가 되도록 하였으며, Methanol의 경우 5%, 10%, 12%를 최종 농도로 사용하였다. 미세조류와 동결보존제를 혼합한 cryo tube는 isopropyl alcohol을 채운 cryo 1°C freezing container (Nalgene, USA)에 넣어 -80°C에서 1시간 30분 동안 냉동한 후, cryo box에 옮겨 단기보존은 24시간, 장기보존은 4주간 액체질소에 보관하였다.
- 동결보존을 위해 배양체별로 각각 희석하여 준비한 104 cells ml-1, 103 cells ml-1, 102 cells ml-1 농도의 미세조류와 동결보존제는 2 ml cryo tube에 1 ml씩(미세조류 배양체 1 ml: 동결보존제 1 ml) 혼합하여 total volume 2 ml이 되도록 제조하였다.
- 따라서 본 연구에서는 F/2배지에 녹을 수 있는 methanol의 최고 농도 24%를 사용하였고, 미세조류 세포와 혼합 후 최종 농도 12% methanol을 맞추기 위해 24% 메탄올을 제작하였다. 동결보존제로 12% methanol을 사용하였을 때 세포 독성 및 재배양 여부를 확인하기 위하여 냉동보존된 N. frustulum 과 N. amabilis 또한 각각 F/2 배지를 보존제 대신 넣은 세포를 대조군으로 취하여 실험을 진행하였다. 동결 보존 후 원심분리하여 상층을 제거하는 방법으로도 수행하였 으나 유실되는 양이 많아 재배양에 실패하였다(data 미제 시).
- 동결보존제로는 세포막 침투성 보존제인 glycerol, DMSO, methanol을 각각 5, 10, 15% 농도로 제조하여 실험하였고 메탄올의 경우 시약 특성상 5, 10, 12% 농도로 실험하였으며 미세조류는 N. frustulum과 N. amabilis 두 종을 각각 102 , 103 , 104 cells ml-1 로 희석하여 사용하였다. 실험에 사용한 미세조류 두 종 모두 메탄올 12%에서 가장 높은 생존율을 보였으며 N.
- 메탄올의 경우 동결보존제 제작과정에서 15% methanol은 2 배 stock인 30% methanol 을 제작하게 되는데 F/2 배지에 용해되지 않고 뿌옇게 되는 현상이 있었다. 따라서 본 연구에서는 F/2배지에 녹을 수 있는 methanol의 최고 농도 24%를 사용하였고, 미세조류 세포와 혼합 후 최종 농도 12% methanol을 맞추기 위해 24% 메탄올을 제작하였다. 동결보존제로 12% methanol을 사용하였을 때 세포 독성 및 재배양 여부를 확인하기 위하여 냉동보존된 N.
- 미세조류 장기보존을 위한 동결보존제는 glycerol, DMSO (Dimethyl sulfoxide), methanol을 선정하였으며 각각 10%, 20%, 30%로 멸균해수로 희석하여 제조하였다. Glycerol은 F/2 배지 에 각각 10%, 20%, 30% 농도로 첨가한 후 121°C 에서 15분간 고압멸균 하였다.
- 미세조류 장기보존을 위해 104 cells ml-1 농도로 성장한 Nitzschia frustulum 과 Nitzschia amabilis 두 종을 F/2 배지에 각각 1% (v/v)씩 분주하여 33 μmol m-2 s-1, 20°C에서 4주간 배양하였다.
- 재배양된 미세조류는 Sedgwick-Rfter chamber (Matsunami, Japan) 플랑크톤 계수기에 1 ml을 떨어뜨리고 glass slide를 위에 덮은 뒤 역상현미경을 이용하여 동결보존 전, 동결 보존 후, 재배양 후에 온전한 형태의 세포만 계수하였다.
- 조류 배양에 사용한 F/2 배지는 VISION사의 SUCTION MASTER 감압여과기와 Merck Millipore사의 0.2 ㎛ GTTP Membrane Filters를 이용하여 불순물을 여과한 해수를 121°C에서 15분간 고압멸균한 후 배지를 24°C의 적정온도로 식힌 상태에서 Guillard’s (F/2) Marine Water Enrichment Solution (50x, liquid, plant cell culture tested) (Sigma aldrich, USA)을 20 ml L-1 첨가하여 제조하였다.
- 해동과 정은 37°C 항온 수조에서 급속 해동 방법을 선택하였다.
대상 데이터
- 미세조류 장기보존을 위해 사용된 Nitzschia frustulum과 Nitzschia amabilis 두 종은 2016년 국립생물자원관 자생생물 조사 발굴 연구사업(조류분야)로 발굴 되었다. 채집지는 충청남도 태안군 소원면 파도리 해수욕장에서 채집되었으며. 배양조건은 F/2 배지에서 33 μmol m-2 s-1, 20°C이다.
데이터처리
- 동결보존제 농도별 미세조류 Nitzschia sp.의 생존률 결과는 SPSS (ver.17.0) One-way ANOVA를 이용하여 통계분석 하였으며 tukey-test를 이용해 사후분석하였다.
성능/효과
- 06%로 전체 실험군 중 가장 낮게 생존하였다. Glycerol의 경우 5, 10, 15% 모두 동결보존제를 첨가하지 않은 대조구 보다는 높게 나타났지만 메탄올 12%에서의 생존율보다는 비교적 낮은 결과를 나타냈으며, glycerol함량이 낮을수록 생존율이 높아지는 양상을 보였다. One-way ANOVA를 이용한 통계분석 결과 두 종 모두 생존율이 가장 높게 나타난 메탄올 12%가 동결보존 제를 첨가하지 않은 control과 유의적인 차이를 보였으며 생존율이 가장 낮게 나타난 DMSO 5, 10, 15%의 결과와도 차이를 나타냈다(Fig.
- Glycerol의 경우 5, 10, 15% 모두 동결보존제를 첨가하지 않은 대조구 보다는 높게 나타났지만 메탄올 12%에서의 생존율보다는 비교적 낮은 결과를 나타냈으며, glycerol함량이 낮을수록 생존율이 높아지는 양상을 보였다. One-way ANOVA를 이용한 통계분석 결과 두 종 모두 생존율이 가장 높게 나타난 메탄올 12%가 동결보존 제를 첨가하지 않은 control과 유의적인 차이를 보였으며 생존율이 가장 낮게 나타난 DMSO 5, 10, 15%의 결과와도 차이를 나타냈다(Fig. 3). 본 결과는 미세조류 동결보존에 있어서 세포 내 침투가 가능한 methanol과 같은 보존제가 효율이 높다는 사례와 일치한다(Andersen 2005; Day and Brand 2005).
- 따라서 원심분리에 의한 손실률을 최소화하기 위해 보존액과 미세조류가 혼합된 total volume인 2ml을 그대로 사용하였고, 보존제의 독성을 최소화하기 위해 150 ml의 F/2 배지에 넣음으로써 보존제의 영향을 약화시켰다. 그결과 N. frustulum은 3주 후 약 10배 이상 재배양이 되었고, N. amabilis는 약12배 정도 재배양에 성공하였다(Fig. 4). 실제 냉동하지 않은 세포의 배양주기와 비교했을 때는 배양 속도가 느린 경향이 있으나 동결보존 후 재배양이 되었다는 점은 매우 중요한 성과이다.
- 16%로 나타났다. 동결 후 해동한 미세조류를 3주간 재배양한 결과에서는 N. frustulum이 재배양 초기 농도보다 약10배 증가하였고 N. amabilis는 약12배 증가한 결과를 나타내었다. 본 연구에서는 유용생물자원인 미세조류 Nizschia sp.
- 동결보존제의 종류 및 농도에 따른 미세조류의 생존율은 N. frustulum과 N. amabilis 모두 methanol 의 함량이 높을수록 생존율이 높게 나타났고 12%에서 각각 6.94 ± 0.31%, 8.85 ± 0.16%로 가장 높은 성장률을 나타내었다.
- 동결보존 직후의 세포 계수 결과 DMSO보다는 methanol과 glycerol에서 살아있는 세포가 많았다. 또한 glycerol 보다는 methanol에서 살아있는 세포 수가 많았으며 농도가 높아질수록 효율이 높았다. 메탄올의 경우 동결보존제 제작과정에서 15% methanol은 2 배 stock인 30% methanol 을 제작하게 되는데 F/2 배지에 용해되지 않고 뿌옇게 되는 현상이 있었다.
- 미세조류 동결 전·후의 형태를 비교하기 위해 광학현미경 400배율에서 관찰한 결과 동결 전에는 규산질의 단단한 세포벽 내부에 구성 물질이 잘 갖춰진 생존 세포의 형태가 관찰되었으나 동결 후에는 세포가 사멸하였으며 내부를 차지하고 있던 구성 요소들이 방출되어 세포벽만 남은 형태가 관찰되었다(Fig. 5).
- 2004). 본 연구 결과에서는 DMSO를 보존제로 사용하였을 때 보존효율이 glycerol, Methanol 과 비교했을 때 상당히 낮아지는 것을 확인하였다. 이것은 세포와 보존제가 혼합되어 세포 내에서 물질 평형을 이루는 시간이 2 ~ 3분 이상 지연될수록 보존제의 세포 독성이 강하게 나타나며 세포파괴를 촉진시키는데 DMSO는 대체로 이러한 현상이 높다고 보고된 사례와 일치하였다(Redekar and Wagh 2000; Tanniou et al.
- 2013). 본 연구에서도 동결 보존 후와 trypan blue를 이용한 염색 결과 세포벽 잔해만 남아 있는 것이 관찰되어 이러한 사실을 입증하였다(Fig. 5와 Fig. 6). 이러한 문제점을 보완하기 위해선 특수한 동결보존제의 선별과 유리화과정을 통한 세포 내 점성의 유리질 얼음형성과정을 개선해야 할 필요성이 있다(Polge et al.
- 세가지 동결보존제 중 DMSO의 경우 농도가 높을수록 생존율이 감소하였으며 두 종 모두 DMSO 15%에서 각각 3.61 ± 0.08%, 3.35 ± 0.06%로 전체 실험군 중 가장 낮게 생존하였다.
- 실험에 사용한 미세조류 두 종 모두 메탄올 12%에서 가장 높은 생존율을 보였으며 N. frustulum은 6.94 ± 0.31%, N. amabilis는 8.85 ± 0.16%로 나타났다.
후속연구
- 에 대한 적절한 동결보존제를 탐색하였다. 국립생물자원관(NIBR) 국가배양센터에서는 미세조류 자원관리의 효율성을 높이기 위해 종 특성에 관계없는 균일한 동결보존제 및 보존방법 개발을 최종 목적으로 하고 있으며, 차후 연구에서는 유리화 과정을 조절하여 세포 손상을 최소화 하고 분자생물학적인 접근법을 활용하여 동결 직후의 살아있는 세포 수를 높일 수 있는 방향으로 연구를 확대할 계획이다.
- 본 연구에서 사용하는 미세조류는 유용 생물자원으로 활용도가 높으나 동결보존하는 방법이 개발되어 있지 않아 장기보존에 어려움이 있다. 대부분의 원핵생물이나 균류 등의 미생물은 종에 관계없이 glycerol 을 이용하여 저온동결보존이 가능하나 미세조류는 동결보존제의 종류와 농도, 유리화 과정 및 해동방법 등에 따라 세포 재생률에 차이가 있기 때문에 구체적인 연구가 필요하다. 미세조류 중 규조류는 전 세계적으로 발견되며 규산질로 구성된 cell wall 은 이미 산업적으로 많이 이용되고 있다.
- 그러나 이렇게 세포 표면이 다당류로 둘러싸인 규조류의 경우 동결보존제의 침투 효율에 문제가 발생할 수 있으며, 동결보존제에 세포가 노출되는 시간이 길수록 해동 후 재생률 (viability)이 낮아진다(Fleck 1998). 동결 직후의 생 세포 수가 약 8 ~ 10% 정도 밖에 되지 않아 위험요소가 높은 점은 본 미세조류 동결보존법 연구에서 개선되어야 할 사항이다. 또한 동결 후 살아있는 미세조류도 세포 주변에 다당류 점액질이 분비되거나, 세포내 탄수화물, 지방, 단백질의 함량이 변화하는 등의 현상이 발생하기 때문에(Kumari et al.
- 본 연구에서는 유용생물자원인 미세조류 Nizschia sp.에 한하여 적합한 동결보존제를 탐색하였으며 이 자료를 바탕으로 더 많은 동결보존제에 대한 효과와 다양한 미세조류 종에 적합한 동결보존 기법 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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