본 연구에서는 제주산마의 액상정액 및 동결정액의 성상 개선을 위하여 펜톡시필린 수준을 설정하여 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성을 평가하였다. 말 동결-융해 정액의 30분 경과 후 정액성상 비교 결과 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구에서 Progressive Motility(PM)가 $53.25{\pm}2.87$, $50.28{\pm}2.14$로 $40.09{\pm}5.15$와 $41.27{\pm}2.82$인 대조구와 16mM(T3)에 유의적으로 높게 나타났으며(p<0.05), Progressive Fast Motility(PFM)도 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구가 각각 $22.44{\pm}1.62$와$ 22.74{\pm}3.07$로 대조구와 16mM(T3) 처리구의 $13.47{\pm}1.48$와 $14.66{\pm}3.68$ 보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 말 동결-융해 정액의 30분 경과 후 정액성상 비교 결과에서는 총 운동성(Total Motility)에서 T1와 T2가 $68.96{\pm}1.64$와 $67.90{\pm}6.72$로 $53.48{\pm}4.84$와 $58.14{\pm}2.65$인 대조구와 T3에 비해 유의적으로 높은 운동성을 보였다(p<0.05). 이상의 결과를 종합해 볼 때 펜톡시필린 4mM와 8mM를 처리했을 때 대조구보다 정자의 운동성을 증진시키는 효과가 있었으며, 펜톡시필린 16mM 이상의 처리에서는 정자 성상에 좋지 않은 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 활성산소를 억제하는 효과가 액상정액 보존 과정에서 발생하는 ROS로부터 정자를 안정적으로 보호하는 것으로 판단되며, 동결-융해 정액의 펜톡시필린 처리구 4mM 첨가구에서 다른 처리구보다 융해 후 1시간 동안 총운동성이 약 10%가량 높은 경향을 나타내었다. 펜톡시필린 처리가 동결-융해 후 정자의 운동성을 10% 이상 개선시킨다는 Taylor 등(2013)의 보고와도 비슷한 경향을 보였으며, 펜톡시필린이 동결-융해 후 정자 운동성 향상 등 정자 성상을 개선하는 것으로 판단된다.
본 연구에서는 제주산마의 액상정액 및 동결정액의 성상 개선을 위하여 펜톡시필린 수준을 설정하여 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성을 평가하였다. 말 동결-융해 정액의 30분 경과 후 정액성상 비교 결과 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구에서 Progressive Motility(PM)가 $53.25{\pm}2.87$, $50.28{\pm}2.14$로 $40.09{\pm}5.15$와 $41.27{\pm}2.82$인 대조구와 16mM(T3)에 유의적으로 높게 나타났으며(p<0.05), Progressive Fast Motility(PFM)도 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구가 각각 $22.44{\pm}1.62$와$ 22.74{\pm}3.07$로 대조구와 16mM(T3) 처리구의 $13.47{\pm}1.48$와 $14.66{\pm}3.68$ 보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 말 동결-융해 정액의 30분 경과 후 정액성상 비교 결과에서는 총 운동성(Total Motility)에서 T1와 T2가 $68.96{\pm}1.64$와 $67.90{\pm}6.72$로 $53.48{\pm}4.84$와 $58.14{\pm}2.65$인 대조구와 T3에 비해 유의적으로 높은 운동성을 보였다(p<0.05). 이상의 결과를 종합해 볼 때 펜톡시필린 4mM와 8mM를 처리했을 때 대조구보다 정자의 운동성을 증진시키는 효과가 있었으며, 펜톡시필린 16mM 이상의 처리에서는 정자 성상에 좋지 않은 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 활성산소를 억제하는 효과가 액상정액 보존 과정에서 발생하는 ROS로부터 정자를 안정적으로 보호하는 것으로 판단되며, 동결-융해 정액의 펜톡시필린 처리구 4mM 첨가구에서 다른 처리구보다 융해 후 1시간 동안 총운동성이 약 10%가량 높은 경향을 나타내었다. 펜톡시필린 처리가 동결-융해 후 정자의 운동성을 10% 이상 개선시킨다는 Taylor 등(2013)의 보고와도 비슷한 경향을 보였으며, 펜톡시필린이 동결-융해 후 정자 운동성 향상 등 정자 성상을 개선하는 것으로 판단된다.
This study was conducted to determine the effect of pentoxifylline levels on sperm motility, survival rate, sperm membrane integrity of frozen semen and fresh-extended equine semen in Jeju cross-bred horses. As a result of sperm characteristic comparison depending on pentoxifylline levles at 30 minu...
This study was conducted to determine the effect of pentoxifylline levels on sperm motility, survival rate, sperm membrane integrity of frozen semen and fresh-extended equine semen in Jeju cross-bred horses. As a result of sperm characteristic comparison depending on pentoxifylline levles at 30 minutes post-thaw, the progressive motilities were $53.25{\pm}2.87$ (4mM pentoxifylline) and $50.28{\pm}2.14$ (8mM pentoxifylline) and significantly higher compared to the control group($40.09{\pm}5.15$) and other treatment group (16mM pentoxifylline, $41.27{\pm}2.82$). The progressive fast motility were $22.44{\pm}1.62$ (4mM pentoxifylline,) and $22.74{\pm}3.07$ (8mM pentoxifylline) and significantly higher compared to the control group ($13.47{\pm}1.48$) and other treatment group (16mM pentoxifylline, $14.66{\pm}3.68$) (p<0.05). As a result of sperm characteristic comparison depending on pentoxifylline levles at 30 minutes post-thaw were $68.96{\pm}1.64$ (4mM pentoxifylline) and $67.90{\pm}6.72$ (8mM pentoxifylline) and significantly higher compared to the control group ($53.48{\pm}4.84$) and other treatment group (16mM pentoxifylline, $58.14{\pm}2.65$) (p<0.05). In conclusion, these results suggest that treatment groups with 4mM and 8mM pentoxifylline were higher compare to equine seperm mobility and the control group and treatment groups with more than 16mM pentoxifylline has a negative effect on sperm characteristics. After thawing, the total motility in post-thawed equine sperm has increased by 10 percent for 1 hour. these results suggest that pentoxifylline contributes to the improvement of the equine sperm motility and characteristics in post-thawed semen.
This study was conducted to determine the effect of pentoxifylline levels on sperm motility, survival rate, sperm membrane integrity of frozen semen and fresh-extended equine semen in Jeju cross-bred horses. As a result of sperm characteristic comparison depending on pentoxifylline levles at 30 minutes post-thaw, the progressive motilities were $53.25{\pm}2.87$ (4mM pentoxifylline) and $50.28{\pm}2.14$ (8mM pentoxifylline) and significantly higher compared to the control group($40.09{\pm}5.15$) and other treatment group (16mM pentoxifylline, $41.27{\pm}2.82$). The progressive fast motility were $22.44{\pm}1.62$ (4mM pentoxifylline,) and $22.74{\pm}3.07$ (8mM pentoxifylline) and significantly higher compared to the control group ($13.47{\pm}1.48$) and other treatment group (16mM pentoxifylline, $14.66{\pm}3.68$) (p<0.05). As a result of sperm characteristic comparison depending on pentoxifylline levles at 30 minutes post-thaw were $68.96{\pm}1.64$ (4mM pentoxifylline) and $67.90{\pm}6.72$ (8mM pentoxifylline) and significantly higher compared to the control group ($53.48{\pm}4.84$) and other treatment group (16mM pentoxifylline, $58.14{\pm}2.65$) (p<0.05). In conclusion, these results suggest that treatment groups with 4mM and 8mM pentoxifylline were higher compare to equine seperm mobility and the control group and treatment groups with more than 16mM pentoxifylline has a negative effect on sperm characteristics. After thawing, the total motility in post-thawed equine sperm has increased by 10 percent for 1 hour. these results suggest that pentoxifylline contributes to the improvement of the equine sperm motility and characteristics in post-thawed semen.
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문제 정의
하지만 Stanic 등(2002)의 연구에서는 동결 전 펜톡시필린 처리가 처리하지 않은 구에 비해 운동성저하와 LIN의 감소를 일으킨다고 보고하였다. 본 연구는 동결정액의 생존율 향상을 위한 기초 연구로서 국립축산과학원 난지축산연구소에서 한라마의 액상정액 및 동결정액의 성상 개선을 위하여 펜톡시필린처리 수준에 따른 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성을 평가･분석하기 위해 수행하였다.
본 연구에서는 제주산마의 액상정액 및 동결정액의 성상 개선을 위하여 펜톡시필린 수준을 설정하여 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성을 평가하였다. 말 동결-융해 정액의 30분 경과 후 정액성상 비교 결과 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구에서 Progressive Motility(PM)가 53.
제안 방법
2시간 동안 3차 증류수가 4℃로 떨어진 것을 확인 후 정액을 INRA freeze희석제를 이용하여 최종 농도가 100×106/ml이 되도록 희석하고 펜톡시필린 처리 그룹과 비처리 그룹으로 나누어 정액주입기를 이용하여 0.5ml 스트로우(FHK, Japan)에 주입하였다.
Table 1에서는 말 동결-융해 정액의 융해 직후 정액의 성상을 비교하였다. CASA system을 이용한 운동성 검사와 정자세포의 생사검사, 정자막 온전성 검사를 수행하였다. 정자 세포막 온전성은 정자의 대사 뿐만 아니라 난자와의 수정, 정자의 수정능획득 및 첨체반응과도 밀접한 관계가 있어 정자의 수정능 평가에 유용한 지표로 사용되고 있다.
혼합된 용액은 37℃ water bath에서 5분 배양한 후 슬라이드 글라스에 도말하여 꼬리가 말린 것과 말리지 않은 정자를 검사하였다. MicroLux 현미경을 이용하여 400배율에서 총 200개의 정자를 카운트하여 정자막의 온전성을 평가하였다.
운동성평가는 그림 1의 알고리즘을 통하여 TM(total motility), PM(Progressive motility), RM(Rapid motility), SM(Slow motility), CM(Circular motility), LM(Local motility)를 측정하였다. 냉장정액은 24시간 간격으로 72시간까지 분석하였으며, 동결정액은 융해후 15분, 30분, 1시간 후의 정액 성상을 분석 하였다.
농도는 SpermaCue (Potometro spermacue, Minitube, Germany)를 이용하여 조사하였으며, ARS의 gel filter 3.5’‘를 이용하여 겔 성분을 분리 하였다.
동결된 정액은 고블렛에 넣어 액체질소에 보관하였다. 동결정액의 정자 성상 검사는 액체질소통에서 꺼낸 후 상온에 약 4초간 노출 후 37℃의 물에서 30초간 침지 후 정자 성상을 평가하였다.
공시축의 연령은 3세에서 8세 사이로 말의 번식계절동안 최소 5회 이상 정액채취경험이 있는 개체를 공시하였다. 사료급여는 농후사료(열량 3,825kcal/kg, CP 16.5%)를 체중의 2.0% 공급하였으며, 조사료(톨페스큐, 오차드그라스, 이탈리안라이그라스)는 자유채식토록 하였다.
염색은 2% Eosin G(Minitube), 4% Nigrosin(Minitube)와 정자를 1:2:1로 혼합하여, 피펫팅 후 혼합액 10㎕를 슬라이드 글라스에 도말하였다. 염색된 정자는 MicroLux(X 70, Olympus, Japan)를 이용하여 400배율에서 정자의 처리 당 200개의 정자를 관찰하여 생존율을 평가하였다.
회수한 정자 펠렛은 최종 농도를 50×106/ml로 희석하여 대조구와 펜톡시필린 처리 그룹으로 처리한 후 15 ml 튜브에 보관하였다. 온도가 급속히 떨어지는 것을 방지하기 위해 3차 증류수에 담가 4℃냉장고에 보관하며 운동성이 70% 이하가 되는 시점까지 24시간 간격으로 정자 성상을 분석하였다.
정자의 운동성 평가는 CASA(Computer-assisted sperm analysis, minitube, DE/Androvision, Germany)를 이용하여 수행하였다. 운동성평가는 그림 1의 알고리즘을 통하여 TM(total motility), PM(Progressive motility), RM(Rapid motility), SM(Slow motility), CM(Circular motility), LM(Local motility)를 측정하였다. 냉장정액은 24시간 간격으로 72시간까지 분석하였으며, 동결정액은 융해후 15분, 30분, 1시간 후의 정액 성상을 분석 하였다.
정액은 채취 직후 10분 이내 실험실로 운반하여 겔(gel) 제거 후 부피, 농도, 운동성 등을 조사하였다. 농도는 SpermaCue (Potometro spermacue, Minitube, Germany)를 이용하여 조사하였으며, ARS의 gel filter 3.
정자막 온전성 평가는 Nie와 Wenzel 등(2001)의 방법을 변형한 Hypo-Osmetic Swelling Test(Host : 저장액 팽창 검사)를 이용하여 정자 미부의 팽창 형태를 분석하였다.
한라마 씨수마의 정액채취는 채취 시마다 같은 시간인 오전 9시에서 10시 사이에 실시하였으며, 개채별로 월 6회 실시하였다. 씨수말은 충분히 시정한 후 초음파 검사를 통해 발정기를 확인한 씨암말에 승가를 허용하거나 암말의 뇨를 도포한 의빈대를 사용하여 정액을 채취하였다.
25mM Sucrose) 저장액 990㎕에 혼합하였다. 혼합된 용액은 37℃ water bath에서 5분 배양한 후 슬라이드 글라스에 도말하여 꼬리가 말린 것과 말리지 않은 정자를 검사하였다. MicroLux 현미경을 이용하여 400배율에서 총 200개의 정자를 카운트하여 정자막의 온전성을 평가하였다.
대상 데이터
본 연구의 공시마는 국립축산과학원 난지축산연구소에서 사육·보유하고 있는 Jeju crossbred (더러브렛×제주마) 수말(씨수마) 5두에 대해 2016년 4월부터 2017년 8월까지 공시하였다.
한라마 씨수마의 정액채취는 채취 시마다 같은 시간인 오전 9시에서 10시 사이에 실시하였으며, 개채별로 월 6회 실시하였다. 씨수말은 충분히 시정한 후 초음파 검사를 통해 발정기를 확인한 씨암말에 승가를 허용하거나 암말의 뇨를 도포한 의빈대를 사용하여 정액을 채취하였다. 정액채취는 독성이 제거된 50ml 플라스틱 일회용 용기를 인공질(INRA model, IMV, French)에 장착하여 사용하였으며, 자외선 차단용 커버를 용기 주변을 감싸았다.
씨수말은 충분히 시정한 후 초음파 검사를 통해 발정기를 확인한 씨암말에 승가를 허용하거나 암말의 뇨를 도포한 의빈대를 사용하여 정액을 채취하였다. 정액채취는 독성이 제거된 50ml 플라스틱 일회용 용기를 인공질(INRA model, IMV, French)에 장착하여 사용하였으며, 자외선 차단용 커버를 용기 주변을 감싸았다. 인공질은 45~50℃의 온수를 이용하여 인공질 내부 온도가 38℃가 되도록 유지하였으며, 삽입을 원활하게 하기 위해 젤을 도포하였다.
데이터처리
통계 처리는 R 통계 package(version 3.0.3)를 이용하여 대조구와 처리 구간에 분산분석을 실시하였으며, ANOVA 분석 후 Duncan‘s 다중 검정을 이용하여 유의성(p<0.05)이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
정자의 생존율 평가는 Eosin-Nigrosin 염색법을 이용하였다. 염색은 2% Eosin G(Minitube), 4% Nigrosin(Minitube)와 정자를 1:2:1로 혼합하여, 피펫팅 후 혼합액 10㎕를 슬라이드 글라스에 도말하였다.
정자의 운동성 평가는 CASA(Computer-assisted sperm analysis, minitube, DE/Androvision, Germany)를 이용하여 수행하였다. 운동성평가는 그림 1의 알고리즘을 통하여 TM(total motility), PM(Progressive motility), RM(Rapid motility), SM(Slow motility), CM(Circular motility), LM(Local motility)를 측정하였다.
성능/효과
펜톡시필린을 처리하지 않은 것 보다는 4mM에서 8mM까지 처리하였을 때 운동성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료되며, 그 이상의 펜톡시필린을 처리하였을 경우에는 정자의 운동성을 저하시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 총 운동성에서도 T1, T2가 대조구와 T3 처리구에 비해 높은 운동성을 보였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
말 동결-융해 정액의 30분 경과 후 정액성상 비교 결과 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구에서 Progressive Motility(PM)가 53.25±2.87, 50.28±2.14로 40.09±5.15와 41.27±2.82인 대조구와 16mM(T3)에 유의적으로 높게 나타났으며(p<0.05), Progressive Fast Motility(PFM)도 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구가 각각 22.44±1.62와 22.74±3.07로 대조구와 16mM(T3) 처리구의 13.47±1.48와 14.66±3.68 보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05).
말 동결-융해 정액의 30분 경과 후 정액성상 비교 결과에서는 총 운동성(Total Motility)에서 T1와 T2가 68.96±1.64와 67.90±6.72로 53.48±4.84와 58.14±2.65인 대조구와 T3에 비해 유의적으로 높은 운동성을 보였다(p<0.05).
05). 본 연구에서는 펜톡시필린 처리 농도별 Progressive Motility(PM)와 Progressive Fast Motility(PFM)에서 결과에서 보는바와 같이 높은 PM과 PFM을 보였다. 펜톡시필린을 처리하지 않은 것 보다는 4mM에서 8mM까지 처리하였을 때 운동성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료되며, 그 이상의 펜톡시필린을 처리하였을 경우에는 정자의 운동성을 저하시키는 것을 확인할 수 있었다.
융해 후 1시간이 경과하였을 때 정자 성상분석에서는 총 운동성(Total Motility)에서 T1와 T2가 68.96±1.64와 67.90±6.72로 53.48±4.84와 58.14±2.65인 대조구와 T3에 비해 유의적으로 높은 운동성을 보였다(p<0.05).
이상의 결과를 종합해 볼 때 펜톡시필린 4mM와 8mM를 처리했을 때 대조구보다 정자의 운동성을 증진시키는 효과가 있었으며, 펜톡시필린 16mM 이상의 처리에서는 정자 성상에 좋지 않은 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 활성산소를 억제하는 효과가 액상정액 보존 과정에서 발생하는 ROS로부터 정자를 안정적으로 보호하는 것으로 판단되며, 동결-융해 정액의 펜톡시필린 처리구 4mM 첨가구에서 다른 처리구보다 융해 후 1시간 동안 총운동성이 약10%가량 높은 경향을 나타내었다. 펜톡시필린 처리가 동결-융해 후 정자의 운동성을 10% 이상 개선시킨다는 Taylor 등(2013)의 보고와도 비슷한 경향을 보였으며, 펜톡시필린이 동결-융해 후 정자 운동성 향상 등 정자 성상을 개선하는 것으로 판단된다.
이상의 결과를 종합해 볼 때 펜톡시필린 4mM와 8mM를 처리했을 때 대조구보다 정자의 운동성을 증진시키는 효과가 있었으며, 펜톡시필린 16mM 이상의 처리에서는 정자 성상에 좋지 않은 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 펜톡시필린 처리가 동결-융해 후 정자의 운동성을 10% 이상 개선시킨다는 Taylor 등(2013)의 보고와도 비슷한 경향을 보였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 펜톡시필린 4mM와 8mM를 처리했을 때 대조구보다 정자의 운동성을 증진시키는 효과가 있었으며, 펜톡시필린 16mM 이상의 처리에서는 정자 성상에 좋지 않은 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
정액의 동결-융해 후 30분이 경과하였을 때 정자 성상 분석에서는 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구에서 Progressive Motility(PM)가 53.25±2.87, 50.28±2.14로 40.09±5.15와 41.27±2.82인 대조구와 16mM(T3)에 유의적으로 높게 나타났으며 (p<0.05), Progressive Fast Motility(PFM)도 펜톡시필린 4mM(T1)처리구와 8mM(T2)처리구가 각각 22.44±1.62와 22.74±3.07로 대조구와 16mM(T3) 처리구의 13.47±1.48와 14.66±3.68 보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05).
펜톡시필린 처리 농도별 융해 직후 직진운동성에서는 4mM 처리구와 8mM 처리구인 T1, T2에서 56.93±4.19, 55.86±3.01로 대조구와 8mM 처리구인 47.24±3.27, 42.02± 10.31 보다 높은 직진운동성을 보였으나 유의적인 차이를 보이지는 않았다.
본 연구에서는 펜톡시필린 처리 농도별 Progressive Motility(PM)와 Progressive Fast Motility(PFM)에서 결과에서 보는바와 같이 높은 PM과 PFM을 보였다. 펜톡시필린을 처리하지 않은 것 보다는 4mM에서 8mM까지 처리하였을 때 운동성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료되며, 그 이상의 펜톡시필린을 처리하였을 경우에는 정자의 운동성을 저하시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 총 운동성에서도 T1, T2가 대조구와 T3 처리구에 비해 높은 운동성을 보였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
말 정액 채취 시 정자의 성상에 영향을 미치는 것은?
말 정액 채취 시 원정액의 품질과 정액채취 방법, 원심분리 방법, 동결 속도 등 정자의 성상에 많은 영향을 미치는 것으로 보고되어지고 있다(Amann와 Pickett 1987, Ecot 등, 2000). 이처럼 말에서 정자의 이용 기술은 냉장 및 동결체계에 관한 여러 연구가 진행되고 있으며, 결과 또한 안정적으로 보고되고 있으나(Loomis and Graham, 2008, Backman 등, 2004), 국내의 경우 경주용(더러브렛종) 말은 자연종부에 의존하고 있어 인공번식에 필요한 정액 채취, 정자의 냉장 및 동결 기술 등 인공수정에 관한 연구는 미흡한 실정이다.
Phosphodiesterase란 무엇인가?
Phosphodiesterase(PDE)는 정자 내 효소로써의 인산이에스테르 결합을 깨뜨리며 cAMP(cyclic Adenosine monophosphate)를 AMP로 변화시킨다. cAMP는 정자의 첨체반응과 정자 운동에 메신저 역할을 하며, PDE 억제제인 펜톡시필린 첨가시 cAMP의 인산화를 방지하여 세포막 사이의 cAMP농도가 높아지는 효과가 있다.
정자막 온전성 검사를 정자의 수정능 평가의 지표로 사용하는 이유는?
CASA system을 이용한 운동성 검사와 정자세포의 생사검사, 정자막 온전성 검사를 수행하였다. 정자 세포막 온전성은 정자의 대사 뿐만 아니라 난자와의 수정, 정자의 수정능획득 및 첨체반응과도 밀접한 관계가 있어 정자의 수정능 평가에 유용한 지표로 사용되고 있다. 펜톡시필린 첨가는 조기 첨체반응을 방지하고 수정률을 높이며(Henkel 등, 2003), Zhang 등(2005)은 활성산소를 억제하는 효과가 있다고 보고하였다.
참고문헌 (15)
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