최근 지구온난화로 인해 모기의 서식지가 넓어짐에 따라, 모기가 매개하는 감염병의 감염기회가 높아지고 있다. 플라비바이러스는 대표적인 모기매개 바이러스로, 아시아 국가 내에서 상대적으로 감염빈도가 높은 플라비바이러스로는 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스가 있다. 이들은 감염증상 및 치료방법이 다르기 때문에 정확한 구별진단이 요구되고 있지만, 아직까지 정확하게 구별 가능한 진단기술이 없다. 본 연구에서는 생물정보학 데이터베이스에 구축된 정보 및 분석도구를 바탕으로 플라비바이러스 구별 진단법에 대해 제안하였다. 3종 플라비바이러스의 면역진단을 위한 표적 단백질로는 외피단백질 및 비구조단백질 1을 선정하였으며, 이들의 아미노산 다중 서열 분석을 통해 상동성을 분석하였다. 이로부터 연속적 10-15개의 펩타이드로 구성된 항원결정기 후보를 선별하였으며, 면역원성 분석과 3차원 구조 예측을 통해 가장 유용한 항원결정기 2종을 제시하였다. 이는 아시아 국가 내에서 감염빈도가 높은 3종의 플라비바이러스의 구별진단을 위한 활용 가치가 높을 것으로 기대된다.
최근 지구온난화로 인해 모기의 서식지가 넓어짐에 따라, 모기가 매개하는 감염병의 감염기회가 높아지고 있다. 플라비바이러스는 대표적인 모기매개 바이러스로, 아시아 국가 내에서 상대적으로 감염빈도가 높은 플라비바이러스로는 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스가 있다. 이들은 감염증상 및 치료방법이 다르기 때문에 정확한 구별진단이 요구되고 있지만, 아직까지 정확하게 구별 가능한 진단기술이 없다. 본 연구에서는 생물정보학 데이터베이스에 구축된 정보 및 분석도구를 바탕으로 플라비바이러스 구별 진단법에 대해 제안하였다. 3종 플라비바이러스의 면역진단을 위한 표적 단백질로는 외피단백질 및 비구조단백질 1을 선정하였으며, 이들의 아미노산 다중 서열 분석을 통해 상동성을 분석하였다. 이로부터 연속적 10-15개의 펩타이드로 구성된 항원결정기 후보를 선별하였으며, 면역원성 분석과 3차원 구조 예측을 통해 가장 유용한 항원결정기 2종을 제시하였다. 이는 아시아 국가 내에서 감염빈도가 높은 3종의 플라비바이러스의 구별진단을 위한 활용 가치가 높을 것으로 기대된다.
Recently, global warming has widened the habitat of mosquitoes and infection chances for mosquito-borne diseases are increasing. Flavivirus is a typical mosquito-borne virus. Flaviviruses with a relatively high frequency of infection in Asian countries include Zika, Dengue, and Japanese encephalitis...
Recently, global warming has widened the habitat of mosquitoes and infection chances for mosquito-borne diseases are increasing. Flavivirus is a typical mosquito-borne virus. Flaviviruses with a relatively high frequency of infection in Asian countries include Zika, Dengue, and Japanese encephalitis viruses. Although distinctive diagnosis of flaviviruses is required because the symptoms and therapeutic method differ, there is no diagnostic method that can distinguish them accurately yet. In this study, we propose distinctive diagnosis method of flaviviruses using informations and analysis tools constructed in bioinformatic databases. The envelope protein and non-structural protein 1 which are useful protein for the immuno-diagnostics of three flaviviruses were selected. Their homology was analyzed by multiple sequence alignments and epitope candidates consisting of 10-15 amino acids were selected. Finally two epitopes were suggested to be most useful by immunogenicity analysis and 3D structure prediction. These approaches and results are expected to be great value in the distinctive diagnosis of three flaviviruses with a high frequency of infection in Asian countries.
Recently, global warming has widened the habitat of mosquitoes and infection chances for mosquito-borne diseases are increasing. Flavivirus is a typical mosquito-borne virus. Flaviviruses with a relatively high frequency of infection in Asian countries include Zika, Dengue, and Japanese encephalitis viruses. Although distinctive diagnosis of flaviviruses is required because the symptoms and therapeutic method differ, there is no diagnostic method that can distinguish them accurately yet. In this study, we propose distinctive diagnosis method of flaviviruses using informations and analysis tools constructed in bioinformatic databases. The envelope protein and non-structural protein 1 which are useful protein for the immuno-diagnostics of three flaviviruses were selected. Their homology was analyzed by multiple sequence alignments and epitope candidates consisting of 10-15 amino acids were selected. Finally two epitopes were suggested to be most useful by immunogenicity analysis and 3D structure prediction. These approaches and results are expected to be great value in the distinctive diagnosis of three flaviviruses with a high frequency of infection in Asian countries.
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문제 정의
특히 아시아 국가들에서 최근 감염빈도가 상대적으로 높은 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스 등 3종의 플라비바이러스 감염에 대한 구별진단이 더욱더 중요해지고 있는 상황이다. 따라서 본 연구에서는 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스를 구별하기 위한 연구방법론을 제시하고 이의 활용방안에 대해 논의하고자 한다.
본 연구에서는 여러 가지 생물정보학 데이터베이스를 활용한 정보 및 분석기법을 바탕으로, 아시아 국가 내에서 감염빈도가 상대적으로 높은 3종의 플라비바이러스인 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스 감염으로부터 이들을 구별하기 위한 항원결정기를 도출하였다. 바이러스 정보가 구축된 데이터베이스, 단백질에 대한 아미노산 서열이 구축된 데이터베이스, 아미노산 서열 분석도구, 단백질 3차원 구조 예측 데이터베이스, 항원결정기 면역원성 분석 데이터베이스, 펩타이드 3차원 구조 예측 데이터베이스 등의 생물 정보학 관련 데이터베이스를 종합적으로 활용하였으 며, 이로부터 3종의 플라비바이러스가 공통으로 갖는 여러 종류의 단백질 중에서도 면역진단에 유리한 외피 단백질 및 비구조단백질 1을 표적 단백질로 선정하였다.
구체적으로는 항원-항체반응을 기초로 하는 면역진단 분야에서 아직까지 서로 다른 플라비바이러스 구별이 불가능하다는 한계를 극복하기 위해, 여러 생물정보학 관련 데이터베이스(database, DB)를 이용하였다. 생물정보학 데이터베이스에 구축된 정보들 및 생물정보학적 분석기법을 바탕으로, 플라비바이러스를 구성하고 있는 단백질들에 대한 항원결정기(epitope)를 제시하고, 이를 활용한 아시아 국가 내에서 감염빈도가 높은 3종의 플라비바이러스 구별을 위한 면역진단 기술 개발에 대해 논의하고자 한다.
제안 방법
3종 플라비바이러스 구별을 위한 최적의 항원결정기를 외피단백질로부터 1종, 비구조단백질 1로부터 1종을 선정하였으며, 최종 항원결정기는 각각의 플라비바이러스별로 2종을 제시하였다. 최종 선정은 양(+)의 면역원성을 갖는 동시에 3차원 구조를 형성할 것으로 예측되는 항원결정기에 우선순위를 두었다.
3종의 플라비바이러스 모두 외피단백질로부터는 E6 항원결정기를, 비구조단백질 1로부터는 N2 항원결정기를 최종 선정하였다. 외피단백질로부터 선정된 항원결정기를 보면, 지카 바이러스의 경우 3차원 구조를 가질 것으로 예측되는 항원결정기는 E4, E6, E10, E11의 4종이 있었지만, 이 중에서 E6이 면역원성이 가장 높은 것으로 분석되어 최종 선정하였다.
일반적으로 단백질이 아닌 펩타이드를 면역원(immunogen)으로 이용하여 항체를 생산하고자 할 경우, 6개~15개의 연속적인 아미노산으로 구성된 펩타이드가 적절하다고 알려져 있다[33-35]. 3차원 구조 예측이 가능한 최소 아미노산 수인 9개를 고려하여, 9개~15개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 각각의 바이러스 구별을 위한 항원결정기로 선별하였다.
지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스의 외피단백질 및 비구조단백질 1 모두 UniProt 데이터 베이스에서 제공되는 다중 서열 분석도구(multiple sequence alignment)를 이용하였다. 다중 서열 분석을 통해 각각의 표적 단백질간 동일성(identity)과 유사성(similarity)을 바탕으로 상동성을 분석하였다.
앞선 두 가지 기준을 모두 만족하는 항원결정기라 할지라도, 표적 단백질의 외곽 부위에 존재하지 않는다면 이로부터 생산된 항체를 실제 면역진단에 적용할 수 없을 가능성이 높다. 따라서 위의 3가지 조건을 모두 만족하는 항원 결정기를 서로 다른 3종의 플라비바이러스 구별을 위한 항원결정기로 선별하였다.
Swiss-Model 데이터베이스상에서 [그림 2]와 [그림 3]에 나타낸 각각의 단백질에 대한 아미노산 위치(순서)와 해당 서열을 직접 확인할 수 있고, 마우스의 클릭-드래그 과정을 통해 3차원적인 회전이 가능하다. 따라서 위의 과정을 통해 일일이 항원결정기 후보의 표면 노출여부를 파악하였다.
항원결정기 후보를 선정함에 있어, 1차적으로 항체가 인지하는 항원결정기가 일반적으로 5개~20개의 연속적인 아미노산으로 구성되어 있다는 특징을 고려하였다 [36]. 또한 펩타이드를 이용하여 단일클론항체를 생산하고자 할 경우 15개 이하의 아미노산이 유리하다는 점과 3차원 구조 예측이 가능한 최소 아미노산 수인 9개를 종합적으로 고려하여 항원결정기의 아미노산 수를 최소 9개에서 최대 15개로 한정하였다. 플라비바이러스 간 동일성의 경우 컷-오프 11.
마지막으로 표적 단백질의 3차원 구조 확인(예측)을 통해, 해당 항원결정기가 표적 단백질의 외곽 부위에 존재하는지 확인한 다음 외곽 부위에 존재하는 것이 확인된 경우 최종 항원결정기로 선별하였다. 3차원 구조 확인(예측)은 스위스 생물정보학 연구소(SIB)에서 제공하는 데이터베이스 중의 하나인 Swiss-Model (http://swissmodel.
본 연구에서는 여러 가지 생물정보학 데이터베이스를 활용한 정보 및 분석기법을 바탕으로, 아시아 국가 내에서 감염빈도가 상대적으로 높은 3종의 플라비바이러스인 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스 감염으로부터 이들을 구별하기 위한 항원결정기를 도출하였다. 바이러스 정보가 구축된 데이터베이스, 단백질에 대한 아미노산 서열이 구축된 데이터베이스, 아미노산 서열 분석도구, 단백질 3차원 구조 예측 데이터베이스, 항원결정기 면역원성 분석 데이터베이스, 펩타이드 3차원 구조 예측 데이터베이스 등의 생물 정보학 관련 데이터베이스를 종합적으로 활용하였으 며, 이로부터 3종의 플라비바이러스가 공통으로 갖는 여러 종류의 단백질 중에서도 면역진단에 유리한 외피 단백질 및 비구조단백질 1을 표적 단백질로 선정하였다. 생물정보학적 접근을 통해 표적 단백질 내에서도 각각의 플라비바이러스간에 차별성이 두드러지는 부분을 선별하였으며, 이를 면역진단 기술 개발을 위한 항원결정기로 제시하였다.
본 연구는 면역진단에 활용 가능한 각각의 플라비바이러스에 특이적으로 반응할 수 있는 단일클론항체 생산을 위한 정보를 제공하는 것이 목적이므로, IEDB 데이터베이스에서 제공하는 여러 가지의 항원결정기 예측 모드 중에서도 항체 생산과 관련도가 가장 높은 'B 세포 항원결정기 예측(B Cell Epitpe Prediction)' 모드를 이용하였다.
연구는 아시아 국가 내에서 감염빈도가 높은 3종의 플라비바이러스인 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스를 대상으로 하였다. 생물정보학 연구 분야의 유명 포털 중 하나인, 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics, SIB)에서 제공하는 ExPASy(http://www.expasy.org)의 ViralZone 데이터베이스로부터 플라비바이러스를 구성하는 여러 종류의 단백질을 확인하였다. 여러 종류의 단백질 중에서도, 면역진단에 적용하기 위해 바이러스의 외부에 노출되어 있어 항체의 접근 및 결합이 유리한 단백질인 외피단백질 및 비구조단백질 1을 3종의 플라비바이러스 구별을 위한 표적 단백질로 선정하였다.
바이러스 정보가 구축된 데이터베이스, 단백질에 대한 아미노산 서열이 구축된 데이터베이스, 아미노산 서열 분석도구, 단백질 3차원 구조 예측 데이터베이스, 항원결정기 면역원성 분석 데이터베이스, 펩타이드 3차원 구조 예측 데이터베이스 등의 생물 정보학 관련 데이터베이스를 종합적으로 활용하였으 며, 이로부터 3종의 플라비바이러스가 공통으로 갖는 여러 종류의 단백질 중에서도 면역진단에 유리한 외피 단백질 및 비구조단백질 1을 표적 단백질로 선정하였다. 생물정보학적 접근을 통해 표적 단백질 내에서도 각각의 플라비바이러스간에 차별성이 두드러지는 부분을 선별하였으며, 이를 면역진단 기술 개발을 위한 항원결정기로 제시하였다.
선별된 항원결정기들 중에서 실제 생물학적 실험에 이용되었을 경우 그 성공 가능성이 높은 항원결정기를 선별하기 위해 면역원성과 3차원 구조를 예측하였다. 항원결정기의 생체 내 면역원성은 미국 국립 알레르기 및 감염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID)에서 제공하는 Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB) 데이터베이스(http://www.
아시아 국가 내에서 상대적으로 감염빈도가 높은 3종의 플라비바이러스 구별을 위한 표적 단백질의 아미노산 서열은 ViralZone 데이터베이스 및 UniProt 데이터베이스로부터 얻어진 정보들을 종합적으로 분석하여 선정하였다.
앞서 IEDB 데이터베이스의 'BepiPred' 모드에서분석된 단일클론항체 개발을 위한 항원성을 의미하는 면역원성과 PEP-FOLD 3.5 분석도구를 이용한 3차원 구조 형성여부를 종합적으로 고려하여 3종의 플라비바이러스 구별을 위한 항원결정기를 선정하였다.
외피단백질로부터 선별된 6종의 항원결정기 및 비구조단백질 1로부터 선별된 3종의 항원결정기를 포함한 총 9종의 항원결정기에 대해 IEDB 데이터베이스를 통해 면역원성을 분석하고, PEP-FOLD 3.5 분석도구를 이용하여 항원결정기의 3차원 구조를 예측하였다.
최종 선정은 양(+)의 면역원성을 갖는 동시에 3차원 구조를 형성할 것으로 예측되는 항원결정기에 우선순위를 두었다. 이 때, 실제 단일클론항체 생산과 같은 생물학적 실험으로의 적용 가능성을 고려하여 3차원 구조 형성여부를 우선적으로 고려하였으며, 차순으로 양(+)의 면역원성 중 높은 값을 갖는 항원결정기를 고려하였다.
5를 이용하였다. 이를 종합하여 면역원성 점수(score)가 양(+)의 점수를 갖는 동시에 3차원적 입체구조를 갖는 항원결정기를 서로 다른 3종의 플라비바이러스를 구별하기 위한 항원 결정기로 최종 선정하였다.
3종 플라비바이러스 구별을 위한 최적의 항원결정기를 외피단백질로부터 1종, 비구조단백질 1로부터 1종을 선정하였으며, 최종 항원결정기는 각각의 플라비바이러스별로 2종을 제시하였다. 최종 선정은 양(+)의 면역원성을 갖는 동시에 3차원 구조를 형성할 것으로 예측되는 항원결정기에 우선순위를 두었다. 이 때, 실제 단일클론항체 생산과 같은 생물학적 실험으로의 적용 가능성을 고려하여 3차원 구조 형성여부를 우선적으로 고려하였으며, 차순으로 양(+)의 면역원성 중 높은 값을 갖는 항원결정기를 고려하였다.
대상 데이터
또한 각 플라비바이러스의 데이터별로도 주요 단백질을 구성하는 아미노산의 수와 아미노산 서열에도 차이가 있다. 3종의 플라비바이러스와 관련된 여러 데이터들 중에서도 주석 점수(annotation score)가 5점 만점 중 5점인 데이터를 선별하였다. UniProt 데이터베이스에서 주석 점수 1점은 특정되지 않은 단백질, 2점은 예상되는 단백질, 3점은 상동성(homology)이 높은 단백질로부터 추론된 단백질, 4점은 전사체(transcript) 수준에서 실험적으로 검증된 데이터, 5점은 단백질 수준에서 실험적으로 검증된 데이터를 의미한다.
3종의 플라비바이러스의 외피단백질과 비구조단백질 1에 대해 각각 항원결정기로 활용 가능한 후보군을 선별하였다. 외피단백질에 대한 11개의 항원결정기 후보 (E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11)의 경우, 적게는 10개에서 많게는 15개의 아미노산으로 구성되어 있었으며, 동일성은 모두 11.
마지막으로 표적 단백질의 3차원 구조 확인(예측)을 통해, 해당 항원결정기가 표적 단백질의 외곽 부위에 존재하는지 확인한 다음 외곽 부위에 존재하는 것이 확인된 경우 최종 항원결정기로 선별하였다. 3차원 구조 확인(예측)은 스위스 생물정보학 연구소(SIB)에서 제공하는 데이터베이스 중의 하나인 Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org)을 이용하였다. 앞선 두 가지 기준을 모두 만족하는 항원결정기라 할지라도, 표적 단백질의 외곽 부위에 존재하지 않는다면 이로부터 생산된 항체를 실제 면역진단에 적용할 수 없을 가능성이 높다.
구체적으로는 항원-항체반응을 기초로 하는 면역진단 분야에서 아직까지 서로 다른 플라비바이러스 구별이 불가능하다는 한계를 극복하기 위해, 여러 생물정보학 관련 데이터베이스(database, DB)를 이용하였다. 생물정보학 데이터베이스에 구축된 정보들 및 생물정보학적 분석기법을 바탕으로, 플라비바이러스를 구성하고 있는 단백질들에 대한 항원결정기(epitope)를 제시하고, 이를 활용한 아시아 국가 내에서 감염빈도가 높은 3종의 플라비바이러스 구별을 위한 면역진단 기술 개발에 대해 논의하고자 한다.
표면에 노출되어 있는 단백질로는 전구체 막단백질, 외피단백질 및 비구조단백질 1이 확인되었다. 그러나 전구체 막단백질은 아미노산 수가 약 160개 내외로 구성되어 있기 때문에, 약 500개 내외로 구성된 외피단백질과 약 350개 내외로 구성된 비구조단백질 1에 비해 상대적으로 크기가 작고, 표면에 노출되어 있지만 외피단백질에 의해 상당 부분이 가려져 있어 연구대상으로는 포함시키지 않았다. 따라서 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스 외피단백질과 비구조단백질 1을 항원결정기 예측 연구를 위한 표적 단백질로 선정하였다.
지카 바이러스는 아프리카형과 유럽형이 있었지만, 아시아형과 상대적으로 상동성이 높은 아프리카형을 선정하였다. 뎅기 바이러스는 아시아 지역에서 특징적으로 나타나는 것으로 알려져 있는 혈청형 2(serotype 2)를 선정하였다[37]. 일본뇌염 바이러스 역시 아시아 지역에서 감염 빈도가 높고 현재 일본뇌염 백신으로 이용되고 있는 SA-14형을 선정하였다[38].
지카 바이러스의 경우, 전체 3,419개의 아미노산 중에서 외피단백질은 291번부 터 790번까지의 아미노산, 비구조단백질 1은 791번부터 1142번까지의 아미노산을 대상으로 하였다. 뎅기 바이러스의 경우, 전체 3,391개의 아미노산 중에서 외피단백 질은 281번부터 775번까지의 아미노산, 비구조단백질 1은 776번부터 1127번까지의 아미노산을 대상으로 하였다. 일본뇌염 바이러스의 경우, 전체 3,432개의 아미노 산 중에서 외피단백질은 295번부터 794번까지의 아미노산, 비구조단백질 1은 795번부터 1146번까지의 아미노산을 대상으로 하였다.
우선 항원-항체반응을 기반으로 하는 면역진단의 경우, 항체가 표적단백질에 접근하여 결합하기 쉬워야 한다. 따라서 ViralZone 데이터베이스로부터 플라비바이러스를 구성하고 있는 여러 가지 단백질 중, 바이러스의 표면에 노출되어 있는 단백질을 선별하였다. 표면에 노출되어 있는 단백질로는 전구체 막단백질, 외피단백질 및 비구조단백질 1이 확인되었다.
4개의 항원결정기 후보 중, 항원결정기 후보 N1은 비구조단백질 1의 3차원 구조 예측 결과에 비추어 보았을 때, 상대적으로 내부에 위치하기 때문에 항체가 접근하기에 어려움이 있을 것으로 판단하였다[그림 3]. 따라서 비구조단백질 1로부터 는 N1을 제외하고, 항체의 접근이 용이한 N2, N3, N4를 면역원성 및 부분적 3차원 구조 예측을 위한 항원결정기 후보로 선별하였다. Swiss-Model 데이터베이스상에서 [그림 2]와 [그림 3]에 나타낸 각각의 단백질에 대한 아미노산 위치(순서)와 해당 서열을 직접 확인할 수 있고, 마우스의 클릭-드래그 과정을 통해 3차원적인 회전이 가능하다.
추가적으로 Swiss-Model 데이터베이스를 이용하여 외피단백질의 3차원적 구조를 예측해 본 결과 11개의 항원결정기 후보 중, 5개의 항원결정기 후보(E1, E3, E5, E7, E9)는 상대적으로 외피단백질의 내부에 위치하기 때문에 항체가 접근하기에 어려움이 있을 것으로 판단 하였다[그림 2]. 따라서 외피단백질로부터는 E1, E3, E5, E7, E9를 제외하고, 항체의 접근이 용이한 E2, E4, E6, E8, E10, E11를 면역원성 및 부분적 3차원 구조 예측을 위한 항원결정기 후보로 선별하였다.
그러나 전구체 막단백질은 아미노산 수가 약 160개 내외로 구성되어 있기 때문에, 약 500개 내외로 구성된 외피단백질과 약 350개 내외로 구성된 비구조단백질 1에 비해 상대적으로 크기가 작고, 표면에 노출되어 있지만 외피단백질에 의해 상당 부분이 가려져 있어 연구대상으로는 포함시키지 않았다. 따라서 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스 외피단백질과 비구조단백질 1을 항원결정기 예측 연구를 위한 표적 단백질로 선정하였다.
여러 가지의 데이터 중 실험적으로 검증된 데이터를 선별하였다. 지카 바이러스의 엔트리(entry)는 Q32ZE1, 뎅기 바이러스와 일본뇌염 바이러스의 엔트리는 각각 P29990와 P27395를 선정하였으며, 이로부터 각 단백질별 아미노산 서열을 확인하였다.
org)의 ViralZone 데이터베이스로부터 플라비바이러스를 구성하는 여러 종류의 단백질을 확인하였다. 여러 종류의 단백질 중에서도, 면역진단에 적용하기 위해 바이러스의 외부에 노출되어 있어 항체의 접근 및 결합이 유리한 단백질인 외피단백질 및 비구조단백질 1을 3종의 플라비바이러스 구별을 위한 표적 단백질로 선정하였다.
연구는 아시아 국가 내에서 감염빈도가 높은 3종의 플라비바이러스인 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스를 대상으로 하였다. 생물정보학 연구 분야의 유명 포털 중 하나인, 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics, SIB)에서 제공하는 ExPASy(http://www.
뎅기 바이러스는 아시아 지역에서 특징적으로 나타나는 것으로 알려져 있는 혈청형 2(serotype 2)를 선정하였다[37]. 일본뇌염 바이러스 역시 아시아 지역에서 감염 빈도가 높고 현재 일본뇌염 백신으로 이용되고 있는 SA-14형을 선정하였다[38]. 본 연구에 활용된 플라비바이러스의 UniProt 엔트리 및 각 엔트리의 표적 단백질 정보는 [표 1]에 나타내었다.
여러 가지의 데이터 중 실험적으로 검증된 데이터를 선별하였다. 지카 바이러스의 엔트리(entry)는 Q32ZE1, 뎅기 바이러스와 일본뇌염 바이러스의 엔트리는 각각 P29990와 P27395를 선정하였으며, 이로부터 각 단백질별 아미노산 서열을 확인하였다. 지카 바이러스의 경우, 전체 3,419개의 아미노산 중에서 외피단백질은 291번부 터 790번까지의 아미노산, 비구조단백질 1은 791번부터 1142번까지의 아미노산을 대상으로 하였다.
표적 단백질별 아미노산 서열의 상동성 분석으로부터, 항원결정기는 (1) 9개~15개의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(peptide), (2) 11.11% 이하의 동일성을 갖는 펩타이드, (3) 3차원 구조 확인(예측)을 통한 외곽 부분에 존재 여부 등의 세 가지 기준을 동시에 충족하는 후보군을 선별하였다.
플라비바이러스 3종에 대한 아미노산 서열은 유럽 생물정보학 연구소(The European Bioinformatics Institute, EMBL-EBI), 미국 단백질 정보 자원(Protein Information Resource, PIR) 및 스위스 생물정보학 연구소(SIB)에 구축되어 있는 정보들을 바탕으로 구성된 UniProt (Universal Protein Resource) 데이터베이스(http:// www.uniprot.org)를 이용해 확인하였다.
선별된 항원결정기들 중에서 실제 생물학적 실험에 이용되었을 경우 그 성공 가능성이 높은 항원결정기를 선별하기 위해 면역원성과 3차원 구조를 예측하였다. 항원결정기의 생체 내 면역원성은 미국 국립 알레르기 및 감염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID)에서 제공하는 Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB) 데이터베이스(http://www.iedb.org)를 이용하여 예측하였다. 이 때, 면역원성 예측은 'BepiPred Linear Epitope Prediction' 모드에서 수행하였다.
데이터처리
또한 펩타이드 항원결정기는 모두 연속적인 아미노산으로 구성된 형태이기 때문에, 해당 항원결정기의 면역원성 분석에 적합한 'BepiPred' 모드에서 분석을 수행하였다.
이론/모형
3종의 플라비바이러스의 구별을 위한 표적 단백질인 외피단백질과 비구조단백질 1에 대한 상동성 분석을 위해 UniProt에서 제공되는 다중 서열 분석도구를 이용하였다. [표 2]에 나타낸 바와 같이, 동일한 위치에 동일한 아미노산이 위치하는 경우가 외피단백질은 39.
펩타이드로 구성된 항원결정기의 경우, 단순한 선형(linear) 구조보다는 헬릭스(helix), 시트(sheet) 및 루프(loop) 등과 같이 3차원적인 입체 구조를 가질 경우 면역원성이 높은 것으로 알려져 있다[35]. 따라서 항원결정기의 3차원 구조 형성 여부를 파악하기 위해 PEP-FOLD 3.5를 이용하였다. PEP-FOLD는 화학 및 생명과학 연구자들이 펩타이드의 아미노산 서열로부터 구조를 온라인 상에서 손쉽게 예측할 수 있도록 설계된 데이터베이스로, 특히 9개~23개의 아미노산으로 구성된 펩타이드의 구조를 예측하는데 매우 유용하다[41].
지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스의 외피단백질 및 비구조단백질 1 모두 UniProt 데이터 베이스에서 제공되는 다중 서열 분석도구(multiple sequence alignment)를 이용하였다. 다중 서열 분석을 통해 각각의 표적 단백질간 동일성(identity)과 유사성(similarity)을 바탕으로 상동성을 분석하였다.
항원결정기의 3차원 구조 예측에는, 펩타이드 3차원 구조 예측을 위한 분석도구인 Mobyle@RPBS 데이터 베이스에서 제공하는 PEP-FOLD 3.5를 이용하였다. 이를 종합하여 면역원성 점수(score)가 양(+)의 점수를 갖는 동시에 3차원적 입체구조를 갖는 항원결정기를 서로 다른 3종의 플라비바이러스를 구별하기 위한 항원 결정기로 최종 선정하였다.
성능/효과
3종 플라비바이러스 구별을 위한 항원결정기 선정을 위해 [그림 1]에 나타낸 바와 같이 다중 서열 분석 결과를 도식화하였으며, 외피단백질로부터는 11개, 비구조단백질 1로부터는 4개의 선정 가능한 항원결정기 후보가 있음을 확인할 수 있었다.
또한 이황화 결합(disulfide bond)과 같은 정보를 포함하거나, 분석 가능한 아미노산 수를 증가시키는 등 지속적인 업그레이드가 이루어지고 있다[42]. PEP-FOLD 3.5를 이용하여 항원결정기의 3차원 구조를 예측해본 결과, 외피단백질의 항원결정기에서는 지카 바이러스의 경우 E4, E6, E10, E11, 뎅기 바이러스의 경우 E4 및 E6, 일본뇌염 바이러스의 경우 E2, E6, E8, E10이 3차원 구조를 갖는 것으로 분석되었다[표 5]. 비구조단백질 1의 항원결정기에서는 지카 바이러스의 경우 N2 및 N4, 뎅기 바이러스의 경우 N2 및 N3, 일본뇌염 바이러스의 경우 N2가 3차원 구조를 갖는 것으로 분석되었다[표 6].
비구조단백질로부터 선정된 항원결정기를 보면, 지카 바이러스의 경우에는 3차원 구조를 가질 것으로 예측되는 항원결정기는 N2와 N4가 있었지만, 이 중에서 N2이 면역원성이 가장 높은 것으로 분석되어 최종 선정하였다. 뎅기 바이러스의 경우의 경우에는 N2와 N3이 3차원 구조를 가질 것으로 예측되었지만, N2가 면역원성이 가장 높은 것으로 분석되어 최종 선정하였다. 일본뇌염 바이러스의 경우에는 N2만이 3차원 구조를 가질 것으로 예측되어 선정하였다.
299)이 양(+)의 값을 가졌기 때문에 항원결정기로 적합한 것으 로 분석되었다[표 5]. 또한 비구조단백질 1(NS1)의 항원결정기인 N2, N3, N4의 면역원성을 분석한 결과, 지카 바이러스에서는 N2(+0.901) 및 N3(+0.033), 뎅기 바이러스에서는 N2(+1.209) 및 N3(+0.373), 일본뇌염 바이러스에서는 N2(+0.323)가 양(+)의 값을 가졌기 때문에 항원결정기로 적합한 것으로 분석되었다[표 6]. 특징적인 것은 외피단백질의 경우에는 E6, 비구조단백질 1의 경우에는 N2가 3종의 플라비바이러스에서 모두 가장 면역원성이 높으면서 3차원 구조를 이루는 항원결정기로 예측되었다.
일본뇌염 바이러스의 경우 E2, E6, E8, E10이 3차원 구조를 가질 것으로 예측되었지만, 다른 플라비바이러스들과 마찬가지로 E6이 면역원성이 가장 높은 것으로 분석되어 최종 선정하였다. 물론 면역원성이 가장 높은 항원결정기만을 최종 선정하였지만, 지카 바이러스의 E4, 뎅기 바이러스의 E4 및 일본뇌염 바이러스의 E10의 경우에도 상대적으로 높은 양(+)의 면역원성을 갖는 동시에, 3차원 구조를 가지는 것으로 분석되었다. 따라서 이들을 이용한 항원결정기로의 활용가능성을 간과해서는 안 될 것으로 판단된다.
5를 이용하여 항원결정기의 3차원 구조를 예측해본 결과, 외피단백질의 항원결정기에서는 지카 바이러스의 경우 E4, E6, E10, E11, 뎅기 바이러스의 경우 E4 및 E6, 일본뇌염 바이러스의 경우 E2, E6, E8, E10이 3차원 구조를 갖는 것으로 분석되었다[표 5]. 비구조단백질 1의 항원결정기에서는 지카 바이러스의 경우 N2 및 N4, 뎅기 바이러스의 경우 N2 및 N3, 일본뇌염 바이러스의 경우 N2가 3차원 구조를 갖는 것으로 분석되었다[표 6].
비구조단백질로부터 선정된 항원결정기를 보면, 지카 바이러스의 경우에는 3차원 구조를 가질 것으로 예측되는 항원결정기는 N2와 N4가 있었지만, 이 중에서 N2이 면역원성이 가장 높은 것으로 분석되어 최종 선정하였다. 뎅기 바이러스의 경우의 경우에는 N2와 N3이 3차원 구조를 가질 것으로 예측되었지만, N2가 면역원성이 가장 높은 것으로 분석되어 최종 선정하였다.
3종의 플라비바이러스 모두 외피단백질로부터는 E6 항원결정기를, 비구조단백질 1로부터는 N2 항원결정기를 최종 선정하였다. 외피단백질로부터 선정된 항원결정기를 보면, 지카 바이러스의 경우 3차원 구조를 가질 것으로 예측되는 항원결정기는 E4, E6, E10, E11의 4종이 있었지만, 이 중에서 E6이 면역원성이 가장 높은 것으로 분석되어 최종 선정하였다. 뎅기 바이러스의 경우 E4와 E6이 3차원 구조를 가질 것으로 예측되었지만, E6이 면역원성이 가장 높은 것으로 분석되어 최종 선정하였다.
외피단백질의 항원결정기인 E2, E4, E6, E8, E10, E11의 면역원성을 분석한 결과, 지카 바이러스에서는 E4(+0.560), E6(+1.452), E10(+0.111), 뎅기 바이러스에서는 E2(+0.471), E4(+0.788), E6(+1.051), 일본뇌염 바이러스에서는 E2(+0.037), E6(+1.086), E10(+0.299)이 양(+)의 값을 가졌기 때문에 항원결정기로 적합한 것으 로 분석되었다[표 5]. 또한 비구조단백질 1(NS1)의 항원결정기인 N2, N3, N4의 면역원성을 분석한 결과, 지카 바이러스에서는 N2(+0.
53%로 나타났다. 이로부터 3종 플라비바이러스의 외피단백질은 73.89%, 비구조단백질 1은 74.71%가 동일한 위치에 같은 아미노산이나 유사한 아미노산이 위 치하는 것을 확인할 수 있었다.
주석 점수가 5점인 데이터는 지카 바이러스의 경우 2개, 뎅기 바이러스의 경우 26개, 일본뇌염 바이러스의 경우에는 9개가 포함되어 있었다. 지카 바이러스는 아프리카형과 유럽형이 있었지만, 아시아형과 상대적으로 상동성이 높은 아프리카형을 선정하였다. 뎅기 바이러스는 아시아 지역에서 특징적으로 나타나는 것으로 알려져 있는 혈청형 2(serotype 2)를 선정하였다[37].
최종 선정된 항원결정기의 3차원 구조를 심층적으로 살펴보면, 지카 바이러스의 E6는 부분적으로 시트형태를 나타내고 있었으며, 이 외의 모든 항원결정기는 헬릭스 형태의 3차원 구조를 갖는 것으로 예측되었다[그림 4]. 지카 바이러스 N2의 경우 다른 헬릭스 구조에 비해 상대적으로 가느다란 헬릭스 형태를 보이는데, 이는 뎅기 바이러스나 일본뇌염 바이러스의 N2에 비해 상대적으로 불안정한 헬릭스 형태를 나타내기 때문이다.
추가적으로 Swiss-Model 데이터베이스를 이용하여 외피단백질의 3차원적 구조를 예측해 본 결과 11개의 항원결정기 후보 중, 5개의 항원결정기 후보(E1, E3, E5, E7, E9)는 상대적으로 외피단백질의 내부에 위치하기 때문에 항체가 접근하기에 어려움이 있을 것으로 판단 하였다[그림 2].
후속연구
본 연구를 통해 도출된 항원결정기를 바탕으로 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스 등과 같은 3종의 플라비바이러스 각각에 특이적인 단일클론항체를 개발하여 면역진단 기술에 활용한다면, 기후변화에 따른 신·변종 바이러스 출현에 대응하기 위한 도구로 사회·경제적, 보건·의료적 가치가 매우 클 것으로 기대된다.
어디까지나 예측결과이기 때문에 선형으로 존재할 가능성도 있지만, 지카 바이러스의 비구조단백질 1에서 도출 가능한 유일한 항원결정기이기 때문에 이러한 점도 고려되어야 할 것으로 생각된다. 실제 항원결정기로 활용 가능성을 판단하기 위해서는 생물학적 실험을 통해 검증과정을 거쳐야 할 것이다.
특징적인 것은 외피단백질의 경우에는 E6, 비구조단백질 1의 경우에는 N2가 3종의 플라비바이러스에서 모두 가장 면역원성이 높으면서 3차원 구조를 이루는 항원결정기로 예측되었다. 이는 해당 부위가 상동성은 낮지만, 각각의 플라비바이러스에서 면역원성(immunogenicity) 유발에 있어 중심적인 역할을 하는 부위로 추론해볼 수 있을 것이므로, 해당 부위에 대한 생물학적 검증과 관련하여 심층적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이러한 항원결정기들은 항원을 검출하는 항원진단에 활용할 수 있는 동시에, 현재 주요 플라비바이러스 구별을 위해 활발히 연구되고 있는 항체 검출을 통한 진단기술에서 발생하는 플라비바이러스간 교차반응 (cross-reactivity)의 한계를 극복할 수 있을 것으로 생각된다[43][44]. 즉, 제안된 생물정보학적 접근방법 및 결과들을 바탕으로, 면역진단 기술 분야에서 플라비바이러스 구별이라는 난제를 해결하는데 핵심적인 실마리를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
각 플라비바이러스의 외피단백질과 비구조단백질로부터 최종 선정된 6종의 항원결정기는 각각의 플라비바이러스를 구성하는 단백질의 일부분으로, 면역원성이 양(+)의 값을 갖는 동시에 3차원 구조를 갖는다는 공통의 특징이 있다. 하지만 아미노산 서열이 모두 다르기 때문에, 각각의 바이러스를 구별하기 위한 면역진단기술 개발을 위한 항원결정기 설계에 있어 중요한 지표로 활용이 가능할 것이다.
향후에는 지구온난화로 인한 열대·온대·아열대 지역이 더욱더 확대될 것으로 예상된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
플라비바이러스는 무엇인가?
플라비바이러스(Flavivirus)는 플라비비리데 과 (Flaviviridae family)의 하위 생물학적 분류인 속 (genus)을 지칭한다. 플라비바이러스의 대표적인 종 (species)으로는 지카 바이러스(Zika virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 황열 바이러스(Yellow fever virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus) 및 세인트루이스 뇌염 바이러스(St.
플라비바이러스 중 아시아 국가 내에서 상대적으로 감염빈도가 높은 것은 무엇인가?
최근 지구온난화로 인해 모기의 서식지가 넓어짐에 따라, 모기가 매개하는 감염병의 감염기회가 높아지고 있다. 플라비바이러스는 대표적인 모기매개 바이러스로, 아시아 국가 내에서 상대적으로 감염빈도가 높은 플라비바이러스로는 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 및 일본뇌염 바이러스가 있다. 이들은 감염증상 및 치료방법이 다르기 때문에 정확한 구별진단이 요구되고 있지만, 아직까지 정확하게 구별 가능한 진단기술이 없다.
플라비바이러스의 공통된 특징은 무엇이가?
플라비바이러스들은 모두 공통의 특징을 갖는다. 이들은 모두 40~65 나노미터(nm)의 크기로 구형 (spherical)의 형태이며, 전자현미경을 이용하여 관찰이 가능하다. 또한 플라비바이러스의 유전자는 (+)단일가닥의 리보핵산(RNA)으로, 약 10,000~11,000개의 염기 (base)로 구성되어있다.
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