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문제 정의
- 본 실험은 DGE의 MRSA에 대한 항균효과와 기존 항생제와의 상승작용 및 세포의 구조적 특성과 에너지대사에 기인하여 항균활성의 작용기작을 조사하였다. 大黃과 牽 牛子의 두 약물로 이루어진 DGE는 디스크 확산법을 통해 MRSA ATCC 33591, CCARM 3091, DPS-2에 유효한 항균활성을 나타냈다.
- 이에 저자는 大黃牽牛散의 Disc 확산 실험을 통해 MRSA 에 대한 항균활성을 검증하였으며, 최소억제농도(MIC)를 측정하여 기존 항생제와 大黃牽牛散 추출물을 병행처리 하였을 때 synergy effect 및 partial synergy effect를 조사하였고, 大黃牽牛散의 항균활성이 세포막 투과성과 ATPase 억제에 연관성이 있는가를 실험하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- . 임상에서 항균 및 항암치료 효과를 상승시키기 위해 교체 내성(cross-re-sistance)이 없고, 작용 기전이 서로 다른 약제를 사용하는 복합요법이 주로 이용되고 있음에 따라 본 연구에서는 이러한 항생제 내성문제를 낮추어주기 위한 천연물 유래 항균물질의 가능성을 알아보고자 한다6-8).
제안 방법
- DGE를 액체배지에 농도별로 희석하여, 여기에 탁도 0.5 McFarland 1.5 × 108 CFU/mL을 기준으로 10 μl씩 접종하여 최종적으로 1.5 × 105 CFU/well이 되게 하였다.
- DGE와 항생제의 병용효과를 보기위해 checkerboard dilution test를 실시하였다. 상용 항생제는 oxacillin (OX), ampicillin (AP), gentamicin (GT).
- DGE의 항균활성과 막 투과성 증진제 및 ATP synthase 억제제 효과를 조사하기 위해, 7.8 μg/mL DGE와 0.0001% TX 및 62.5 μg/mL Tris를 각각 병용하였다.
- DGE의 항균활성과 막 투과성 증진제의 효과를 조사하기 위해, 7.8 μg/mL DGE와 0.0001% TX 및 62.5 μ g/mL Tris를 각각 병용하였다.
- DGE의 항균활성은 최소억제농도(MIC)를 통해 확인하였다. MRSA 8균주에 대한 DGE의 최소억제농도는 125∼250 μg/mL이었다(Table II).
- N,N-Dicyclohexylcarbodiimide(DCCD)와 sodium azide (NaN3)는 F0-F1-ATP synthase(F0F1)를 저해함으로써 ATP의 대사를 억제하는 것으로28), DGE의 항균활성이 MRSA의 ATP-dependent transport systems에 관여하는지 보기 위해 사용하였다.
- 상용 항생제는 oxacillin (OX), ampicillin (AP), gentamicin (GT). ciprofloxacin (CP)이며 상기 액체배지 희석법과 동일한 방법으로 항생제를 병합하였을 때 MIC를 측정하였다.
- 大黃牽牛散 에탄올추출물(DGE)의 Methicillin 내성 Staphylococcus aureus(MRSA)에 대한 항균활성을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 다음으로 37°C 항온기에서 24시간 배양 후미생물이 증식되지 않는 가장 낮은 약물의 농도를 MIC로 측정하였다21,22).
- 다음으로 멸균 된 paper disc(6 mm)에 DGE(25 μg, 50 μg, 100 μg, 200 μg)와 AP 10 μg을 각각 20 μL씩 주입하여 완전히 흡수시킨 후 37℃ incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc 주위에 형성된 억제직경을 측정하였다.
대상 데이터
- DGE의 항균활성이 세포막 투과성 강화제와 ATP syn-thase 저해제를 병합하였을 때 활성의 변화를 보기 위해 detergent인 Triton X-100(TX)과 Tris-(hydroxymethyl) aminomethane (Tris)및 ATP synthase inhibitor를 사용하였다.
- Mueller-Hinton agar(MHA)와 Mueller-Hinton broth(MHB) 는 Difco™ (Baltimore, MD, USA)에서, Tris-(hydroxymethyl) aminomethane은 AMRESCO(San Francisco, CA)에서, Sodium azide(NaN3)는 Fluka (Neu-Ulm, Germany)에서, 항생제 oxacillin & ampicillin & gentamacin & cipro-floxacin과 Triton X-100, N,N-dicyclohexylcarbodimide(DCC) 는 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 균주는 -79°C 냉동고에서 30% glycerol에 보관하다가, Mueller-Hinton agar(MHA)에 접종한 후 37°C 항온기 (incubator)에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 표준균주(type strain) ATCC 33591은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA) 에서 구입하였고, CCARM 3090, 3091, 3095, 3102는 서울여대 항생제 내성 균주은행으로부터, DPS-1,2,3은 원광대학교 병원 성형외과에서 분양받아 임상균주로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차 (SEM)를 구하여 그 유의성은 Student’s t-test 분석법을 이용하여 신뢰수준 95% (p < 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
- DGE와 항생제 OX, AP, GT, CP를 병용했을 때 MRSA 증식 변화를 보기위해 시간에 따른 MRSA의 생장곡선을 흡광도법(optical density, OD 600 )으로 측정하였다24,25).
- MRSA ATCC 33591, CCARM 3091, DPS-2에 대한 DGE의 항균효과는 디스크 확산법을 통해 나타냈다. DGE의 100 μg/20 μL 및 200 μg/20 μL에서 유효한 항균활성을 나타냈다(Fig.
- 大黃牽牛散 에탄올추출물(DGE)의 항균효과는 디스크 확산법을 통해 MRSA에 대한 항균활성을 측정하였다17-19). 고압 멸균된 MHA에 24시간 배양된 균 100 μl를 골고루 도말하여 최종적으로 1.
- 최소억제농도(MIC)는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2000) 방법에 따라 액체배지 희석법을 통해 측정하였다20). DGE를 액체배지에 농도별로 희석하여, 여기에 탁도 0.
성능/효과
- 1. DGE는 디스크 확산법을 통해 MRSA 세 균주에 대해 100 μg/20 μL 및 200 μg/20 μL에서 항균효 과를 나타냈다.
- 2. DGE의 MRSA 최소억제농도는(MIC)는 125∼250 μ g/mL 이었다.
- 3. DGE와 항생제 OX, AP, GT, CP의 병용결과, 大黃牽牛散 1.95∼125 μg/mL에서 상승효과를 나타냈으며, 항생제의 농도를 2배∼64배 낮추어주었다.
- 4. DGE는 TX와 Tris가 막투과성을 증가시켜 항균활성의 침투력을 증가시켰다.
- 5. DGE는 DCCD와 NaN3가 ATP 대사를 저해하여 항균활성이 증진되었다.
- ATP synthase를 감소시키는 대사억제제로써, DCCD와 NaN3을 7.8 μg/mL DGE와 각각 병용한 결과, 각각 82%와 47%의 억제율을 나타냈다(Fig. 10, 11).
- DGE를 항생제와 병용처리 하였을 때 MRSA에 대한 상승효과를 확인하기 위해 베타락탐계(OX & AP), 아미노글리코사이드계(GT) 및 퀴놀론계(CP) 항생제를 병합한 결과, 대부분 상승효과를 나타내었으며, DGE와 항생제 OX, AP, GT, CP를 병용하였을 때 MRSA의 생장곡선을분석한 결과, 병용한 군에서는 확연하게 억제된 MRSA의 증식을 보여주었다.
- DGE와 AP의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에 비해 AP와 DGE 군은 약물활성에 의해 저해되었으나 동일한 양상을 나타냈다. 반면에 DGE와 AP를 병용한 군에서는 완전히 억제된 MRSA의 증식을 보여주었다(Fig.
- DGE와 CP의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에 비해 CP군은 비교적 정상적인 증식상태를 나타냈으며 DGE군은 약물활성에 의해 증식이 억제되었으나 8시간 이후부터 MRSA 증식이 점차 증가하는 양상을 나타냈다. DGE와 CP를 병용한 군에서는 확연하게 억제되다가 8시간 이후 점차 증가하는 MRSA의 증식을 보여주었다(Fig. 7).
- DGE와 CP의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에 비해 CP군은 비교적 정상적인 증식상태를 나타냈으며 DGE군은 약물활성에 의해 증식이 억제되었으나 8시간 이후부터 MRSA 증식이 점차 증가하는 양상을 나타냈다. DGE와 CP를 병용한 군에서는 확연하게 억제되다가 8시간 이후 점차 증가하는 MRSA의 증식을 보여주었다(Fig.
- DGE와 GT의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군과 GT군은 비슷한 증식양상을 나타냈으나 DGE군과 DGE와 GT병용군은 약물활성에 의해 확연하게 억제된 MRSA의 증식을 보여주었다(Fig. 6).
- DGE와 OX의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에 비해 OX군은 비교적 정상적인 증식상태를 나타냈으며 DGE군은 약물활성에 의해 증식이 억제되었으나 8시간 이후부터 MRSA 증식이 점차 증가하는 양상을 나타냈다. 반면에 DGE와 OX를병용한 군에서는 확연하게 억제된 MRSA의 증식을 보여주 었다(Fig.
- DGE와 베타락탐계(β-lactams) 항생제의 상승효과를 조사하기 위해 베타락탐계 항생제인 OX를 병용한 결과, MRSA 4균주에서 synergy effect및 partial synergy effect 를 나타냈다(Table III).
- DGE와 베타락탐계(β-lactams) 항생제인 AP를 병용한 결과, MRSA 6균주에서 synergy effect및 partial synergy effect를 나타냈다(Table IV).
- DGE와 아미노글리코사이드계(aminoglysides) 항생제의 상승효과를 조사하기 위해 GT를 병용한 결과, 실시한 MRSA 7균주 중 5균주에서 synergy effect및 partial synergy effect를 나타냈다(Table V). 7.
- DGE와 퀴놀론계(quinolons) 항생제의 상승효과를 조사하기 위해 CP를 병용한 결과, 실시한 MRSA 6균주에서 synergy effect및 partial synergy effect를 나타냈다(TableVI). 1.
- 8 μg/mL DGE와 각각 병용한 결과, 억제율을 나타냈다. DGE의 항균활성은 세포막의 구조적 특성과 에너지대사 기능에 있어서 침투력이 상승했다. 세포벽 안쪽에서 세포질을 둘러싸고 있는 세포막(cytoplasmic membrane)은 세포 내외로 물질의 선택적 투과성을 부여 한다.
- 본 실험은 DGE의 MRSA에 대한 항균효과와 기존 항생제와의 상승작용 및 세포의 구조적 특성과 에너지대사에 기인하여 항균활성의 작용기작을 조사하였다. 大黃과 牽 牛子의 두 약물로 이루어진 DGE는 디스크 확산법을 통해 MRSA ATCC 33591, CCARM 3091, DPS-2에 유효한 항균활성을 나타냈다. 또한 MRSA 표준균주와 임상균주를 포함한 8균주에서 우수한 항균효과를 나타냈다.
- 5 μ g/mL Tris를 각각 병용하였다. 그 결과, 병용처리한 약물에서 MRSA(ATCC 33591)의 생존력을 각각 70%와 85%로 감소시켰다(Fig. 8, 9).
- 그 결과, 병용처리한 약물에서 MRSA(ATCC 33591)의 생존력을 감소 시켰으며, ATP synthase를 감소시키는 대사억제제로써, DCCD와 NaN3을 7.8 μg/mL DGE와 각각 병용한 결과, 억제율을 나타냈다.
- 大黃과 牽 牛子의 두 약물로 이루어진 DGE는 디스크 확산법을 통해 MRSA ATCC 33591, CCARM 3091, DPS-2에 유효한 항균활성을 나타냈다. 또한 MRSA 표준균주와 임상균주를 포함한 8균주에서 우수한 항균효과를 나타냈다.
- 위 실험들로 보아 大黃牽牛散 에탄올 추출물에는 MRSA를 저해할 수 있는 강한 항균효과가 있음을 확인하였고, 또한 기존의 항생제와 병용하였을 때 약물 상승효과를 볼 수 있어 MRSA에 대한 항생제 후보물질 중 하나로 大黃 牽牛散 또는 大黃牽牛散과 항생제의 병용요법이 충분한 가치가 있음을, 더 나아가 기존 항생제의 사용을 감소시킬 수 있는 후보물질임을 기대할 수 있을 것으로 사료된 다. 그러나 임상에서 실제 치료에 응용하기 위하여 향후 임상시험을 통한 항균효과 및 항생제 병용 효과에 대한추가적인 연구가 필요할 것이라 사료된다.
후속연구
- 위 실험들로 보아 大黃牽牛散 에탄올 추출물에는 MRSA를 저해할 수 있는 강한 항균효과가 있음을 확인하였고, 또한 기존의 항생제와 병용하였을 때 약물 상승효과를 볼 수 있어 MRSA에 대한 항생제 후보물질 중 하나로 大黃 牽牛散 또는 大黃牽牛散과 항생제의 병용요법이 충분한 가치가 있음을, 더 나아가 기존 항생제의 사용을 감소시킬 수 있는 후보물질임을 기대할 수 있을 것으로 사료된 다. 그러나 임상에서 실제 치료에 응용하기 위하여 향후 임상시험을 통한 항균효과 및 항생제 병용 효과에 대한추가적인 연구가 필요할 것이라 사료된다.
- 이상 실험 결과, 大黃牽牛散 에탄올추출물이 MRSA에 유효함과, 기존 항생제와의 상승효과로 항생제 농도를 낮추어줄 수 있어 다제내성 MRSA에 대한 항생제 후보물질로써 가능성을 시사하는 바이다.
- 牽牛 子에 대한 실험적 연구로는 고 등15), 윤 등58)이 소염 및 해열작용에 미치는 영향을 보고하였고, 김 등59)이 조골세포 분화에 미치는 영향을 연구하였고, MRSA에 대한 항균작용에 대한 보고는 없었다. 현재까지 大黃牽牛散에 대한 연구는 보고되지 않았으며, 항균활성 연구가 보고된 大黃 에 瀉下祛積, 殺蟲의 효능을 가진 牽牛子가 처방되어 보다 높은 항균효과를 높일 수 있기를 기대하는 大黃牽牛散 에 대한 연구가 필요하리라 사료된다.
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