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문제 정의
- 또한, 클로탈라리아와 태광콩에서 병원성이 확인되었으며, 국내에서 이 균의 분포가 처음으로 확인되었다. 따라서 본 결과를 바탕으로 Fusarium udum Butler에 의한 클로탈라리아 시들음병을 국내에서 처음으로 보고하고자 한다.
- 클로탈라리아와 두 품종의 콩을 대상으로 포자현탁액을 토양에 관주 접종하여 병원성 검정을 수행한 결과, 접종 14~21일 이내에 접종한 클로탈라리아와 태광콩에서 병징이 관찰되었다. 따라서 이 병을 F. udum에 의한 클로탈라리아 시들음병으로 명명하고자 제안하며, 국내에서 처음으로 보고한다.
- 본 연구에서는 국내에서 처음으로 클로탈라리아 시들음병균을 분리하였고, 균학적 특성과 DNA 염기서열분석을 이용하여 동정하였으며, 클로탈라리아를 비롯한 국내 재배 콩 품종을 대상으로 병원성 검정을 수행한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- DNA 염기서열 분석은 O’Donnell 등[11]의 방법을 참고하여 translation elongation factor 1 alpha (TEF), calmodulin (CAL), histone H3 (HIS3) 유전자를 대상으로 실시하였다.
- 클로탈라리아와 콩 뿌리 주변에 포자현탁액 100 mL를 관주하였고, 대조구는 같은 양의 멸균수를 관주하였다. 각 7개 식물체를 접종하였고, 접종 2~3주 후 시들음 및 황화 증상을 관찰하면서 병 발생 정도를 조사하였다. 또한 병든 식물체 지제부로부터 병원균의 재분리 여부를 조사하였다.
- DNA 염기서열 분석은 O’Donnell 등[11]의 방법을 참고하여 translation elongation factor 1 alpha (TEF), calmodulin (CAL), histone H3 (HIS3) 유전자를 대상으로 실시하였다. 각 유전자의 PCR 증폭을 위하여 TEF 유전자는 EF1/EF2, CAL 유전자는 CL1/CL2A, HIS3 유전자는 H3-1a/H3-1b 프라이머쌍을 사용하였다[11, 12]. PCR 반응액은 100 ng/µL의 template DNA를 포함하여 10×Taq buffer, 2 mM dNTPs, 10 pmole/µL의 프라이머쌍, 0.
- 균학적 특성에 의해 F. udum으로 확인된 클로탈라리아 분리균의 정확한 동정을 위하여 TEF, CAL, HIS3 유전자 염기서열을 분석하였다. 이들 TEF, CAL, HIS3 유전자는 Fusarium속 균의 계통학적 분류 연구에 널리 사용되는 marker로서 이미 여러 Fusarium종 복합체(species complex)를 대상으로 연구된 바 있으며[11, 16, 17], 특히 최근에는 이들 유전자 외에 largest subunit of RNA polymerase (RPB1)와 second largest subunit of RNA polymerase (RPB2) 영역이 Fusarium 계통학적 연구에 사용되고 있다[18, 19].
- 이들 TEF, CAL, HIS3 유전자는 Fusarium속 균의 계통학적 분류 연구에 널리 사용되는 marker로서 이미 여러 Fusarium종 복합체(species complex)를 대상으로 연구된 바 있으며[11, 16, 17], 특히 최근에는 이들 유전자 외에 largest subunit of RNA polymerase (RPB1)와 second largest subunit of RNA polymerase (RPB2) 영역이 Fusarium 계통학적 연구에 사용되고 있다[18, 19]. 그러나 F. udum의 경우, RPB1과 RPB2의 염기서열 정보가 NCBI에 등록되어 있지 않아서 본 연구에서는 TEF, CAL, HIS3 유전자를 대상으로 염기서열 분석을 수행하였다.
- 단포자 분리한 균주의 genomic DNA를 추출하기 위하여 총 6개 균주를 선발하여 각각 potato dextrose broth (PDB) 배지에 접종하고, 25°C에서 7일간 정치배양 하였다.
- 채집한 클로탈라리아 줄기에 형성된 자낭각을 직접 현미경으로 관찰하면서 자낭포자의 크기와 모양을 조사하였다. 또한 Fusarium균의 균학적 특성은 단포자 분리한 후 PDA 배지와 carnation leaf agar (CLA) 배지에 배양하여 조사하였다. 대형 분생포자의 모양과 크기, 소형 분생포자의 형성 유무, 모양 및 크기, 후막포자의 형성 유무, 경자(phialide)의 형태 등 형태적 특성은 이전 연구자들의 기준에 따라 조사하였다[8, 9].
- 각 7개 식물체를 접종하였고, 접종 2~3주 후 시들음 및 황화 증상을 관찰하면서 병 발생 정도를 조사하였다. 또한 병든 식물체 지제부로부터 병원균의 재분리 여부를 조사하였다.
- 밴드가 확인된 PCR 산물은 Wizard SV Gel & PCR Clean-up System kit (Promega, San Luis Obispo, CA, USA)를 사용하여 정제한 후, direct sequencing을 통해 염기서열을 분석하였다.
- 분리 균주의 병원성을 확인하기 위하여 클로탈라리아 종자를 파종하고 7일 후에 포자현탁액을 관주 처리하였다. 접종 7일 후, 유묘가 시드는 증상이 나타났고, 심한 경우 유묘가 완전히 시들어 고사하였다.
- 접종원으로 선발된 NC266-5 균주를 PDA에 7일간 배양한 후, 멸균수를 붓고 포자를 긁어 2겹의 miracloth로 걸러내었으며, 포자현탁액의 농도는 hemocytometer를 이용하여 3 × 106 spores/mL로 조정하였다.
- 각 유전자의 annealing 온도의 경우, TEF 유전자는 60°C, CAL 유전자는 56°C, HIS3 유전자는 68°C에서 PCR 증폭하였다. 증폭된 밴드는 1% agarose gel에 전기 영동한 후 염색하여 관찰하였다. 밴드가 확인된 PCR 산물은 Wizard SV Gel & PCR Clean-up System kit (Promega, San Luis Obispo, CA, USA)를 사용하여 정제한 후, direct sequencing을 통해 염기서열을 분석하였다.
- 2014년 8월, 클로탈라리아를 풋거름작물로 재배하는 전북 완주군 소재 시험포장에서 병든 시료를 채집하였다. 채집한 클로탈라리아 줄기에 형성된 자낭각을 수거하여 멸균수에 넣고, 자낭각을 파쇄하여 자낭포자를 현탁시키고, 물한천배지(water agar, WA)를 이용하여 단포자 분리하였다. 순수 분리된 균주는 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA) 사면배지에 이식하여 배양하였고, 10°C에 보존하면서 실험에 사용하였다.
- 채집한 클로탈라리아 줄기에 형성된 자낭각을 직접 현미경으로 관찰하면서 자낭포자의 크기와 모양을 조사하였다. 또한 Fusarium균의 균학적 특성은 단포자 분리한 후 PDA 배지와 carnation leaf agar (CLA) 배지에 배양하여 조사하였다.
- 또한 약 3주간 키운 클로탈라리아 유묘에 포자현탁액을 관주 처리한 결과, 접종 2주 후부터 하엽이 시드는 증상을 관찰할 수 있었고, 3주 후에는 완전히 고사하는 개체가 나타났으며, 고사된 식물체 줄기에 흰색 또는 연분홍색의 포자가 형성되기도 하였다. 클로탈라리아는 콩과식물이며, 분리 균주인 F. udum은 pigeonpea에도 병을 일으키므로, 국내에서 재배되는 우람콩과 태광콩을 대상으로 병원성 검정을 수행하였다. 파종 2주 후, 포자현탁액을 관주 처리하여 접종한 결과, 태광콩은 일부 식물체에서 생육이 억제되고, 약하게 시드는 증상을 관찰할 수 있었으나 우람콩은 하엽의 엽맥 사이만 갈색으로 변색되었고, 시드는 증상은 나타나지 않았다(Table 3).
- 접종원으로 선발된 NC266-5 균주를 PDA에 7일간 배양한 후, 멸균수를 붓고 포자를 긁어 2겹의 miracloth로 걸러내었으며, 포자현탁액의 농도는 hemocytometer를 이용하여 3 × 106 spores/mL로 조정하였다. 클로탈라리아와 콩 뿌리 주변에 포자현탁액 100 mL를 관주하였고, 대조구는 같은 양의 멸균수를 관주하였다. 각 7개 식물체를 접종하였고, 접종 2~3주 후 시들음 및 황화 증상을 관찰하면서 병 발생 정도를 조사하였다.
- 클로탈라리아와 우람콩, 태광콩 등 3개 식물을 대상으로 병원성 검정을 수행하였다. 플라스틱 포트에 클로탈라리아와 콩 종자를 파종하여 온실에서 1~3주간 재배하였다. 접종원으로 선발된 NC266-5 균주를 PDA에 7일간 배양한 후, 멸균수를 붓고 포자를 긁어 2겹의 miracloth로 걸러내었으며, 포자현탁액의 농도는 hemocytometer를 이용하여 3 × 106 spores/mL로 조정하였다.
대상 데이터
- 2014년 8월, 클로탈라리아를 풋거름작물로 재배하는 전북 완주군 소재 시험포장에서 병든 시료를 채집하였다. 채집한 클로탈라리아 줄기에 형성된 자낭각을 수거하여 멸균수에 넣고, 자낭각을 파쇄하여 자낭포자를 현탁시키고, 물한천배지(water agar, WA)를 이용하여 단포자 분리하였다.
- 그러나 국내에는 클로탈라리아를 풋거름작물로 이용하기 때문에 이 작물에 발생하는 병에 대한 연구는 전무한 실정이다. 2014년 8월경, 클로탈라리아를 풋거름작물로 재배하는 시험 포장에 발생한 시들음 증상으로부터 F. udum균을 분리하였다. Fusarium udum은 국내에 나무콩으로 알려진 pigeonpea에 심각한 병원균으로 알려져 있는데 특히 인도, 아프리카 등 열대 및 아열대 지역에서 그 피해가 크다[6, 7].
- 감염된 식물체의 잎은 아래잎부터 황화 되면서 시들기 시작하였고, 위쪽 잎도 황화 되었으며, 결국 식물체는 완전히 고사하였다. 감염된 식물체 줄기에서 어두운 색의 자낭각이 다수 관찰되었고, 이 자낭각으로부터 자낭포자를 단포자 분리하여 6개 균주를 분리하였다. 균학적 특성에 의해 분리균은 Fusarium udum(완전세대:Gibberella indica)로 동정되었다.
- 0 프로그램을 이용하여 neighbor-joining법으로 계통수를 작성하였다. 계통수 작성을 위해 사용된 reference 균주와 유전자 정보는 Table 1에 기재하였으며, 계통분석을 위한 outgroup으로 TEF와 CAL 유전자는 F. oxysporum과 F. inflexum, HIS3 유전자는 F. fujikuroi를 사용하였다.
- graminearum 균주의 전체 유전자 염기서열을 비교 분석한 결과, 약24만여개의 변이형(SNP, InDels)을 가진 다형성이 있음을 밝히면서 이는 기주-병원균 상호작용에 관여하는 유전자의 다양화 및 염색체 구조의 진화적 결과로 추정한다고 하였는데, 본 연구에서 분리된 균주도 이러한 진화 과정의 결과일 것으로 생각되며, 향후 이에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다. 본 연구에서 분석된 균주의 HIS3, TEF, CAL 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 KU599899~KU599916의 accession number로 등록하였다.
- 따라서 본 연구에서 완전세대를 형성하는 것으로 확인된 국내 균주에 대해서도 교배형(mating type) 조사에 의한 다양성 분석이 필요할 것으로 생각된다. 분리된 6개 균주 중 NC266-5 균주는 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection)에 등록번호 KACC48401로 기탁되었다.
- 순수 분리된 균주는 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA) 사면배지에 이식하여 배양하였고, 10°C에 보존하면서 실험에 사용하였다.
- 클로탈라리아와 우람콩, 태광콩 등 3개 식물을 대상으로 병원성 검정을 수행하였다. 플라스틱 포트에 클로탈라리아와 콩 종자를 파종하여 온실에서 1~3주간 재배하였다.
데이터처리
- 밴드가 확인된 PCR 산물은 Wizard SV Gel & PCR Clean-up System kit (Promega, San Luis Obispo, CA, USA)를 사용하여 정제한 후, direct sequencing을 통해 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 Clustal W 소프트웨어를 이용하여 정렬하였고, nucleotide의 유사도를 계산하여 MEGA 6.0 프로그램을 이용하여 neighbor-joining법으로 계통수를 작성하였다. 계통수 작성을 위해 사용된 reference 균주와 유전자 정보는 Table 1에 기재하였으며, 계통분석을 위한 outgroup으로 TEF와 CAL 유전자는 F.
이론/모형
- Sequence data were obtained from the NCBI GenBank database. The trees were generated using neighbor-joining analysis and Kimura 2-parameter model. The numbers in parentheses represent the sequence accession number in Genbank.
- 균사체를 miracloth로 회수하고 동결 건조시킨 후, 곱게 마쇄하여 Choi 등[10]의 방법으로 genomic DNA를 추출하고, ‒20°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 3A). CAL 유전자 염기서열의 경우, F. udum NRRL22949, NRRL22540과는 각각 99.7%의 상동성을 보였고, F. phyllophilum NRRL13617과는 99.2%의 상동성을 나타내었으며(Fig. 3B), HIS3 유전자는 F. udum NRRL22540과 99.6~99.8%, F. phyllophilum NRRL13617과는 97.6~97.8%의 상동성을 나타내었다(Fig. 3C).
- TEF 유전자 염기서열 분석 결과, 클로탈라리아 분리균주는 F. phyllophilum NRRL13617과 95.9~96.4%의 상동성을 나타내었고, F. udum NRRL22949, NRRL52707, NRRL22540과는 각각 95.9~96.2%, 94.4~94.7%, 94.0~94.4%의상동성을 나타내었다(Fig. 3A). CAL 유전자 염기서열의 경우, F.
- aIsolates of the GenBank accession number KM231544, DQ282179, AF150855, GU737442, AF150869, and DQ662837 were F. circinatum CBS 405.97, F. guttiforme MRC7539, F. nygamai MRC7549, F. sterilihyphosum NRRL54011, F. subglutinans MRC3478, and F. verticillioides CBS 122159, respectively.
- 감염된 식물체 줄기에서 어두운 색의 자낭각이 다수 관찰되었고, 이 자낭각으로부터 자낭포자를 단포자 분리하여 6개 균주를 분리하였다. 균학적 특성에 의해 분리균은 Fusarium udum(완전세대:Gibberella indica)로 동정되었다. 대형포자의 정단세포는 대부분 갈고리 모양으로 굽어 있고, 소형포자는 단경자에서 false head 상으로 형성되었다.
- 이와 같은 동정 결과는 translation elongation factor 1 alpha(TEF), calmodulin (CAL), histone 3 (HIS3) 유전자 염기서열 분석으로 재확인되었다. 그 결과, 분리 균주는 NCBI GanBank에 등록된 F. udum과 TEF 유전자는 94.4~96.2%, CAL 유전자는 99.7%, HIS3 유전자는 99.6~99.8%의 상동성을 보였다. 클로탈라리아와 두 품종의 콩을 대상으로 포자현탁액을 토양에 관주 접종하여 병원성 검정을 수행한 결과, 접종 14~21일 이내에 접종한 클로탈라리아와 태광콩에서 병징이 관찰되었다.
- 접종 7일 후, 유묘가 시드는 증상이 나타났고, 심한 경우 유묘가 완전히 시들어 고사하였다. 또한 약 3주간 키운 클로탈라리아 유묘에 포자현탁액을 관주 처리한 결과, 접종 2주 후부터 하엽이 시드는 증상을 관찰할 수 있었고, 3주 후에는 완전히 고사하는 개체가 나타났으며, 고사된 식물체 줄기에 흰색 또는 연분홍색의 포자가 형성되기도 하였다. 클로탈라리아는 콩과식물이며, 분리 균주인 F.
- udum으로 동정되었으며, 완전세대를 형성하는 것으로 확인되었다. 또한, 클로탈라리아와 태광콩에서 병원성이 확인되었으며, 국내에서 이 균의 분포가 처음으로 확인되었다. 따라서 본 결과를 바탕으로 Fusarium udum Butler에 의한 클로탈라리아 시들음병을 국내에서 처음으로 보고하고자 한다.
- 이상과 같이 국내 클로탈라리아 시들음 증상에서 분리한 균은 형태적, 배양적 특성과 DNA 염기서열 분석에 의해 F. udum으로 동정되었으며, 완전세대를 형성하는 것으로 확인되었다. 또한, 클로탈라리아와 태광콩에서 병원성이 확인되었으며, 국내에서 이 균의 분포가 처음으로 확인되었다.
- 2A, Table 2). 자낭포자를 단포자 분리하여 PDA 배지에 배양한 결과, 생육속도는 9 mm/day로 빠른 편이며, 기중균사는 드물게 형성하고, 황색 내지 분홍색의 색소를 형성하였다(Table 2). CLA 배지상에서 소형포자는 단경자(monophialides)에서 false heads 형태로 형성되며, 난형(oval) 혹은 신장형(reniform)으로 크기는 5.
- 8%의 상동성을 보였다. 클로탈라리아와 두 품종의 콩을 대상으로 포자현탁액을 토양에 관주 접종하여 병원성 검정을 수행한 결과, 접종 14~21일 이내에 접종한 클로탈라리아와 태광콩에서 병징이 관찰되었다. 따라서 이 병을 F.
- 따라서 Fusarium균의 정확한 동정을 위해서는 여러 개 유전자를 사용하는 multilocus sequence typing (MLST)뿐 아니라 형태적 특성에 대한 조사가 반드시 필요할 것으로 판단된다. 특히 TEF 유전자의 분석 결과, Fig. 4에서 보는 바와 같이 국내 균주의 intron 부위에 10~27개의 nucleotide가 삽입된 것을 볼 수 있었고, 이로 인해 계통수에서 F.phyllophilum과 근연종으로 나타난 것으로 판단된다. Laurent 등[20]은 6개 F.
- udum은 pigeonpea에도 병을 일으키므로, 국내에서 재배되는 우람콩과 태광콩을 대상으로 병원성 검정을 수행하였다. 파종 2주 후, 포자현탁액을 관주 처리하여 접종한 결과, 태광콩은 일부 식물체에서 생육이 억제되고, 약하게 시드는 증상을 관찰할 수 있었으나 우람콩은 하엽의 엽맥 사이만 갈색으로 변색되었고, 시드는 증상은 나타나지 않았다(Table 3). 인도에서는 시들음병 저항성 pigeonpea를 스크리닝하기 위하여 다양한 방법으로 F.
- udum을 접종하였는데, 토양접종이나 수경재배 접종법 보다 포자현탁액 관주 접종이 가장 효율적이라고 하였다[21]. 현재까지 F. udum은 pigeonpea와 클로탈라리아 등에 병을 일으키는 것으로 보고되어 있으나, 본 연구에서는 콩에도 약하게 병을 일으킬 수 있음이 확인되었다. 인도에서는 32개 F.
후속연구
- phyllophilum과 근연종으로 나타난 것으로 판단된다. Laurent 등[20]은 6개 F. graminearum 균주의 전체 유전자 염기서열을 비교 분석한 결과, 약24만여개의 변이형(SNP, InDels)을 가진 다형성이 있음을 밝히면서 이는 기주-병원균 상호작용에 관여하는 유전자의 다양화 및 염색체 구조의 진화적 결과로 추정한다고 하였는데, 본 연구에서 분리된 균주도 이러한 진화 과정의 결과일 것으로 생각되며, 향후 이에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다. 본 연구에서 분석된 균주의 HIS3, TEF, CAL 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 KU599899~KU599916의 accession number로 등록하였다.
- 풋거름작물 재배는 후작물에 비료 및 유기물을 공급하고, 토양 특성을 개선하거나 병해충 억제하는 등의 효과를 얻을 수 있으나, 경우에 따라 토양 서식 병원균의 기주 식물이 될 가능성이 존재한다. 그러므로 국내에서 풋거름작물로 활용되는 여러 작물을 대상으로 병 발생 모니터링과 병원균 동정, 기주범위 조사 등의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- udum과 큰 차이가 있어 구분이 가능하다[9]. 따라서 Fusarium균의 정확한 동정을 위해서는 여러 개 유전자를 사용하는 multilocus sequence typing (MLST)뿐 아니라 형태적 특성에 대한 조사가 반드시 필요할 것으로 판단된다. 특히 TEF 유전자의 분석 결과, Fig.
- udum의 완전세대로 밝혀지면서 Gibberella indica로 기술되었으며, 서로 다른교배형이 필요한 자웅이체성(heterothallic)으로 알려져 있다[14]. 따라서 본 연구에서 완전세대를 형성하는 것으로 확인된 국내 균주에 대해서도 교배형(mating type) 조사에 의한 다양성 분석이 필요할 것으로 생각된다. 분리된 6개 균주 중 NC266-5 균주는 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection)에 등록번호 KACC48401로 기탁되었다.
- udum을 7개 pigeonpea 품종에 접종한 결과 5개 병원형으로 그룹화하였다[6]. 이와 같이 F. udum은 다양한 병원성 변이를 나타낼 수 있고, 국내에서도 이 병원균의 분포가 확인된 만큼 다른 콩과 작물에 대한 지속적인 병 발생 모니터링이 필요할 것이다.
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