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문제 정의
- 이에 본 연구는 동절기에 온천천의 적조를 유발시키는 주요 원인 생물을 규명하고, 그 발생 특성을 파악함으로써, 향후 이들의 제어 대책 마련에 있어 기초자료로 삼고자 하였다. 이를 위하여, 적조가 발생된 지역의 시료로부터 적조 원인생물을 형태학적으로 현미경 관찰을 한 후, 분자생물학적 기반의 유전자의 염기서열분석을 통해 계통분석 및 분류·동정에 활용하였다.
제안 방법
- 2015년과 2016년 겨울시기에 일주간 단위로 총 28회 채수된 물은 아래 각 수질 항목에 대하여 수질오염공정시험기준에 따라 수질분석에 사용하였다. 수온, pH, 용존산소량(dissolved oxygen, DO), 전기전도도(electronical conductivity, EC), 염분(salinity)의 농도는 현장측정기(YSI-556MPS, USA)를 이용하여 현장에서 채수 즉시 측정하였다.
- 이 때, blast search를 통해 chimera를 형성한 PCR산물은 제거되었으며, 나머지 결과로 얻어진 유전자들의 염기서열은 Mothur program을 통해 clustering(염기서열 상동성 99 %)을 하여 OTU(operational taxonomic unit)를 얻었다. OTU의 염기서열을 이용하여 NCBI에서 blast search를 통해 가장 근연도가 높은 염기서열을 찾고, 이들의 염기서열과 OTU의 염기서열을 함께 Clustal W를 통해 align을 한 후, Mega 7 프로그램을 이용하여 계통도를 작성하였다. 이 때, 분석에 사용한 OTU의 염기서열은 GenBank에 accession number로서 LC259099와 LC259100으로 보관되었다.
- PCR반응에서 증폭된 DNA는 정제된 후, T-blunt PCR cloning kit(BIOFACT, Korea)를 사용하여 각 유전자별 clone library를 구축하였다. 각각의 유전자 clones 중 20개 이상의 clones이 임의로 선정되었고, T-blunt 벡터에 삽입된 DNA부위는 염기서열분석을 의뢰(마크로젠, www.
- PCR반응에서 증폭된 DNA는 정제된 후, T-blunt PCR cloning kit(BIOFACT, Korea)를 사용하여 각 유전자별 clone library를 구축하였다. 각각의 유전자 clones 중 20개 이상의 clones이 임의로 선정되었고, T-blunt 벡터에 삽입된 DNA부위는 염기서열분석을 의뢰(마크로젠, www.macrogen.co.kr)하여 유전자 염기서열을 얻어 그 결과를 분석하였다. 이 때, blast search를 통해 chimera를 형성한 PCR산물은 제거되었으며, 나머지 결과로 얻어진 유전자들의 염기서열은 Mothur program을 통해 clustering(염기서열 상동성 99 %)을 하여 OTU(operational taxonomic unit)를 얻었다.
- 수온, pH, 용존산소량(dissolved oxygen, DO), 전기전도도(electronical conductivity, EC), 염분(salinity)의 농도는 현장측정기(YSI-556MPS, USA)를 이용하여 현장에서 채수 즉시 측정하였다. 그리고 생물학적 산소요구량(biological oxygen demand, BOD), 화학적 산소요구량(chemical oxygen demand, COD) 및 총부유물질량(suspended solid, SS)은 수질오염공정시험기준에 의해 분석하였으며, 총유기탄소(total oxygen carbon, TOC)는 TOC 분석기(TOC-L CPH, Shimadzu, Japan), 총질소(total nitrogen, T-N)와 총인(total phosphorus, T-P)는 총인총질소분석기(JP/AACS, Germany/ Bltec), 그리고 chl-a는 분광광도기(UV/spectrometry, Cary100, USA/Varian)를 이용하여 각각의 농도를 측정하였다.
- 본 연구기간 중 현미경 관찰을 통해 관찰된 우점종은 형태적으로 동일한 종으로 판단되었으며, 분자생물학적 동정을 위하여 2016년 3월과 4월에 채수한 시료 4개를 농축한 바이오매스(약 500 mg)로부터 DNA추출 kit(FastDNA SPIN Kit for soil, MP bio)를 이용하여 genomic DNA를 각각 추출하고 이들을 혼합하였다.
- 2015년과 2016년 겨울시기에 일주간 단위로 총 28회 채수된 물은 아래 각 수질 항목에 대하여 수질오염공정시험기준에 따라 수질분석에 사용하였다. 수온, pH, 용존산소량(dissolved oxygen, DO), 전기전도도(electronical conductivity, EC), 염분(salinity)의 농도는 현장측정기(YSI-556MPS, USA)를 이용하여 현장에서 채수 즉시 측정하였다. 그리고 생물학적 산소요구량(biological oxygen demand, BOD), 화학적 산소요구량(chemical oxygen demand, COD) 및 총부유물질량(suspended solid, SS)은 수질오염공정시험기준에 의해 분석하였으며, 총유기탄소(total oxygen carbon, TOC)는 TOC 분석기(TOC-L CPH, Shimadzu, Japan), 총질소(total nitrogen, T-N)와 총인(total phosphorus, T-P)는 총인총질소분석기(JP/AACS, Germany/ Bltec), 그리고 chl-a는 분광광도기(UV/spectrometry, Cary100, USA/Varian)를 이용하여 각각의 농도를 측정하였다.
- 적조 원인생물의 동정 및 계수를 위하여 현장에서 채수한 시료 2 L 중 1 L를 별도의 용기에 옮겨 Lugol 용액으로 고정한 후, 실험실로 운반하였다. 시료 내 세포수에 따라 희석 혹은 원수 그대로 48시간 이상 자연 침강의 방식으로 농축하여 세포의 수가 검경을 통해 개수에 적절한 농도(10 ~ 40 cells/현미경 시야)가 되도록 조절한 후, 시료 1 mL를 취하여 Sedgwick-Rafter chamber에 골고루 분산시킨 다음, 현미경(CARL ZEISS, DE/Axio Imager)을 이용하여 200배에서 1,600배의 배율로 검경하여 형태적 관찰 및 계수의 결과를 도출하였다. 이 때, 관찰된 식물플랑크톤의 형태학적 동정은 담수조류도감 등을 참고하였다(Graham et al.
- 시료는 연구기간인 2015년 2월 2일에서 2015년 4월 30일까지, 그리고 2015년 12월에서 2016년 5월 초까지의 기간 중 매주 1회(총 28회) 실시하였으며, 2 L의 채수기를 통해 표층수를 채수하였다.
- 연구기간 총 28회 채수한 시료로서 cryptomonads의 세포 수 및 다양한 물리·화학적 수질항목(수온, pH, DO, BOD, COD, SS, EC, TOC, T-N, T-P, chl-a의 농도)에 대한 수질을 분석한 후, 각 항목 당 최저, 최대값 및 평균값을 정리하여 Table 2에 제시하였다.
- 이를 위하여, 적조가 발생된 지역의 시료로부터 적조 원인생물을 형태학적으로 현미경 관찰을 한 후, 분자생물학적 기반의 유전자의 염기서열분석을 통해 계통분석 및 분류·동정에 활용하였다.
- 상기의 결과에 의하면, 온천천의 적조 유발종이 해수 유래임을 알 수 있었다. 이를 재확인하고자 조위자료와 또 조위의 세력을 약화시킬 수 있는 강우의 영향을 고찰하였는데, St 1지점에 기 설치된 chl-a 농도의 자동모니터링 자료와 그 일대의 강우와 조위자료를 비교분석하였고, 그 결과는 Fig. 5에 제시하였다. Fig.
- 적조발생에 대한 강우 및 조위의 영향을 파악하고자, 부산광역시 보건환경연구원에서 채수지점 St 1의 위치에 설치하여 운영 중인 chl-a 실시간자동모니터링 결과자료(Busan Metropolitan City Institute of Health and Environment, 2016)와 St 1지점의 동일시기의 강우자료 및 조석자료와 함께 비교분석하였다. 이 때 사용한 조사기간 내 강수량의 자료는 기상청 홈페이지(Korea Meteorological Administration, 2016)로부터, 그리고 조위자료는 국립해양조사원 제공(Korea Hydrographic and Oceanographic Agency, 2016)자료로부터 얻어졌다.
대상 데이터
- 5에 제시하였다. Fig. 5에 제시한 자료는 2015년 11월에서 2016년 1월까지의 자료를 바탕으로 하였다.
- 온천천 하류에서 특히 적조가 많이 발생하는 구간 중에서 상대적으로 상류부위인 이섭교 지점(St 1, 35o 11' 35.98'' N/129o 5' 31.82'' E, 하천 폭 24 m)과 2 km정도 아래인 수영강과 합류하는 지점(St 2, 35o 11' 21.24'' N/129o 6' 51.28'' E, 하천폭 72 m)을 조사 대상지점으로 선정하였다(Fig. 1).
- 적조발생에 대한 강우 및 조위의 영향을 파악하고자, 부산광역시 보건환경연구원에서 채수지점 St 1의 위치에 설치하여 운영 중인 chl-a 실시간자동모니터링 결과자료(Busan Metropolitan City Institute of Health and Environment, 2016)와 St 1지점의 동일시기의 강우자료 및 조석자료와 함께 비교분석하였다. 이 때 사용한 조사기간 내 강수량의 자료는 기상청 홈페이지(Korea Meteorological Administration, 2016)로부터, 그리고 조위자료는 국립해양조사원 제공(Korea Hydrographic and Oceanographic Agency, 2016)자료로부터 얻어졌다.
데이터처리
- 연구지점에 대한 물리·화학적 환경요인이 cryptomonads 개체수에 미치는 영향을 파악하고자 통계분석 프로그램 SPSS를 이용하여 항목간의 상관 분석을 실시하고, 그 결과를 Table 3에 제시하였다.
- 이상의 모든 수질분석 결과의 통계처리와 crytomonads 세포수와 물리·화학적 환경요인간의 상관성은 SPSS(ver. 10.0 for Eindow)를 사용하여 분석하였다.
이론/모형
- 채수지점의 부영양 정도를 평가하기 위하여 COD, T-P, chl-a의 수질 결과를 이용하여 한국형 호소부영양화평가지수(TSIko)를 산출하였다(Ahn et al., 2013).
성능/효과
- 결과에 의하면, cryptomonads의 개체수는 수질항목과 비교하였을 때, St 1지점의 경우에는 chl-a, pH, DO 항목과, St 2지점은 chl-a, TOC, BOD, T-N, COD, SS, pH, DO 항목과 순차적으로 낮아지는 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 그 중 cryptomonads의 개체수와 chl-a 농도, pH 그리고 salinity의 변화정도를 Fig.
- 결과에 의하면, 적조가 대량으로 발생한 시기를 제외하고는 조위변화와 조류의 간접적인 지표가 되는 chl-a농도의 변화추이가 비슷한 것으로 나타나 적조 원인생물이 조석의 영향을 받고 있는 것을 알 수 있었다(Fig. 5b and 5c). 이것은 온천천에 대량발생한 조류는 해양 유래종임을 시사하며, 상기의 조류동정에서 밝혀진 Teleaulax가 해양유래종인 것과 잘 일치하는 결과이다.
- 두 지점 모두에서 공통적으로 cryptomonads의 개체수는 chl-a 농도 및 pH와 양의 상관관계를 가지는 것으로 나타났다. 이것은 cryptomonads가 chl-a를 광합성색소로 가지고 있음을 의미하며, 광합성을 할 때, 수중에 용해되어 있는 무기탄산 성분이 이용됨에 따라 수중의 pH는 상승하는 것으로 판단된다(Axelsson, 1988).
- 또한, chl-a의 농도의 경우 채수기간 중 St 1지점에서는 0.8 ~ 188.3 mg/m2, St 2 지점은 1.3 ~ 281.0 mg/m2의 범위로 나타났으며, 채수일별 변동 추이는 cryptomonads의 개체수와 비슷한 경향을 보여줌으로써, chl-a농도의 측정이 cryptomonads에 기인한 적조생물수의 간접적인 모니터링 인자로서의 사용할 수 있음을 시사하였다(Fig. 4).
- 상기의 결과에 의하면, 온천천의 적조 유발종이 해수 유래임을 알 수 있었다. 이를 재확인하고자 조위자료와 또 조위의 세력을 약화시킬 수 있는 강우의 영향을 고찰하였는데, St 1지점에 기 설치된 chl-a 농도의 자동모니터링 자료와 그 일대의 강우와 조위자료를 비교분석하였고, 그 결과는 Fig.
- 아울러 본 연구결과를 통해서 살펴본다면 cryptophyta아문의 적조생물종의 분자생물학적 분류에 있어 보다 더 구체적인 정보를 제공해 주는 유전자군으로는, ITS2유전자 암호부위나 LSU 유전자 암호 부위보다는 psbA 유전자 부위가 더 유용한 것으로 나타났다.
- 아울러 전기전도도는 두 지점 간에 상당히 유의할만한 차이를 보였는데 전기전도도를 바탕으로 계산된 염분의 경우, St 1 지점의 평균염분은 0.48 ~ 9.13(psu), St 2 지점은 7.19~ 21.88(psu)로 수영강 합류지점인 St 2지점이 해수의 영향을 더 강하게 받아 약 3배가량 높은 것으로 나타났다.
- 연구기간 동안 St 1 지점의 경우 적조생물은 0 ~ 188,000 cells/mL(평균개체수 15,598 cells/mL), 그리고 St 2 지점의 경우에는 0 ~ 212,000 cells/mL(평균개체수 28,711 cell/mL)의 개체수로 St 1보다 St 2지점에서 약 2배가량 높은 수로 관찰되었다.
- 연구기간 중 수온은 St 1지점이 2.9 ~ 12.8 ℃, St 2지점은 7.3 ~ 16.7 ℃의 범위로 측정되었으며, 17 ℃ 이상이 되는 봄철에는 적조가 점차 소멸되는 점으로 보아 저온에 잘 적응하는 종에 의해 발생한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 사실은 본 연구에서 우점종으로 동정되었던 Teleaulax속이 15℃를 최적배양온도를 가지며 15 ℃ 이상에서는 온도가 상승할수록 생물량이 감소한다는 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affair (MAFRA, 2012)의 연구내용과 잘 일치하는 결과이다.
- St 1과 St 2 지점간에는 평균온도로서 2 ℃ 이상의 온도차가 있었는데, 이것은 St 2지점이 St 1보다 하상의 폭이 넓고 주변에 다른 건물이나 가로수 등에 가려지지 않아 햇볕에 노출되는 시간이 더 많다는 점과 수영강으로 합류되는 지점이 수영하수처리장의 건설과 함께 물의 흐름이 직선화되어 조석의 영향을 강하게 받기 때문에 동절기에 상대적으로 수온이 높은 것으로 판단된다(Table 2). 용존산소의 경우에는 St 1 지점이 수온도 낮고 염분의 농도도 낮으며 유기물의 농도도 낮아 상대적으로 더 높은 것으로 나타났다.
- 우선, ITS2유전자 clones들로부터 얻은 유전자 염기서열을 기존에 등록된 유전자 pool과의 blast search한 결과에 의하면, 자낭균류에 속하는 곰팡이류 1종과는 높은 coverage와 유사성을 보여주는 것이 있었으나, 조류의 염기서열과는 유의한 결과를 보여주지 않았다.
- 유기물(BOD, COD)의 농도 경우 St 1보다 St 2에서 높게 나타난 반면 두 지점에서 영양염류의 농도는 거의 비슷한 수준으로 분석되었는데, 이것은 St 2 지점에서 chl-a 및 부유물질의 양이 약간 증가하였다는 점과 함께 미루어 볼 때, 조류의 성장이 St 2가 더 활발하여 광합성 생물이 자랄 때 유기물은 사용되어지지 않고 영양염류가 소비됨에 따라 상기의 결과가 나타났을 것으로 판단된다.
- kr)하여 유전자 염기서열을 얻어 그 결과를 분석하였다. 이 때, blast search를 통해 chimera를 형성한 PCR산물은 제거되었으며, 나머지 결과로 얻어진 유전자들의 염기서열은 Mothur program을 통해 clustering(염기서열 상동성 99 %)을 하여 OTU(operational taxonomic unit)를 얻었다. OTU의 염기서열을 이용하여 NCBI에서 blast search를 통해 가장 근연도가 높은 염기서열을 찾고, 이들의 염기서열과 OTU의 염기서열을 함께 Clustal W를 통해 align을 한 후, Mega 7 프로그램을 이용하여 계통도를 작성하였다.
- 이를 위하여, 적조가 발생된 지역의 시료로부터 적조 원인생물을 형태학적으로 현미경 관찰을 한 후, 분자생물학적 기반의 유전자의 염기서열분석을 통해 계통분석 및 분류·동정에 활용하였다. 이러한 분자생물학적 접근은 그동안의 현미경 검경을 통한 조류의 동정이나 분류에 비해 실험자간의 차이를 줄일 수 있고, 출현시기와 환경조건에 따라 형태적으로 동일한 형태를 가지지 않는 조류에 대해서 동일한 결과를 도출할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 그러나 세균과는 달리 조류의 경우 분자생물학적 기존 데이터 베이스가 빈약한 데, 본 연구의 동정 결과는 이들 출현환경의 물리·화학적 환경인자와의 상관성을 검토함으로써 적조유발생물에 대한 수생태적 특성에 대한 정보를 제공하여 줄 것으로 판단된다.
- 아울러 17 ℃하의 생육온도조건에서 잘 자라는 종으로 수온이 상승하는 봄철부터는 적조가 관찰되지 않는 결과와도 일치하였다. 이외의 이화학적 수질항목과의 상관관계분석 결과에 의하면, 위치적으로 볼 때 상대적으로 해수의 영향을 덜 받는 상류지역인 St 1지점에서는 chl-a, pH, DO 항목과, 그리고 상대적으로 하류지역인 St 2지점은 chl-a, TOC, BOD, T-N, COD, SS, pH, DO 항목에 대하여 순차적으로 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
- 한편, 리보솜의 28S rRNA 유전자 부위(LSU 부분유전자)를 가진 clones의 경우에는 chirmera를 형성한 clones을 제외하고는 총 9개의 clones을 얻어졌으며, psbA유전자의 PCR산물로부터는 총 16개의 유효 clones을 얻을 수 있었다. 이들 두 유전자군으로부터 얻은 유효 clone들은 99 %의 염기서열 homology를 cut-off범위로 clustering하였을 때, 각각의 유전자에서 1개의 OTU(A13과 C1으로 Fig.
- 한편, 평균값으로 볼 때 St 1의 유기물의 농도는 St 2 지점의 약 60 %에 해당하는 수치로서, 상대적으로 낮은 유기물 오염농도이었으며, 한국형 부영양화지수(TSIko)를 산출한 결과에 의하면 St 1지점이 40 ~ 90(평균과 표준편차, 61 ± 13), St 2지점은 48 ~ 95(평균과 표준편차, 66 ± 14)의 값으로서 조사기간 동안의 총 23회 중 St 1의 경우에는 15회 이상, 그리고 St 2의 경우에는 21회 이상이 부영양 혹은 과영양상태임을 나타내었다.
후속연구
- 그러나 세균과는 달리 조류의 경우 분자생물학적 기존 데이터 베이스가 빈약한 데, 본 연구의 동정 결과는 이들 출현환경의 물리·화학적 환경인자와의 상관성을 검토함으로써 적조유발생물에 대한 수생태적 특성에 대한 정보를 제공하여 줄 것으로 판단된다.
- 이들은 해수종으로 알려져 있는데 적조의 간접지표가 되는 chl-a의 농도가 조석의 영향을 받고 있는 점이 이를 잘 뒷받침하는 결과라고 하겠다. 그러나 이러한 무독성의 조류라고 할지라도 먹이망에 의해 Mesodinium ruburum과 더불어 설사성 패독을 유발하는 Dinophysis acuminata의 번성을 수반할 수 있기 때문에, 예방적 차원에서 이러한 무독성의 조류의 bloom도 제어할 수 있는 수관리가 필요할 것으로 보인다. 한편, 넓은 범위에서 대발생한 조류세포가 해양 유래종임에도 불구하고 염분의 농도와 chl-a농도사이에는 직접적인 양의 상관관계를 보여주지 않았는데, 이것은 Teleaulax sp.
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