[논문]구리이온(II)이 존재할 때 Salvianolic acid B에 의한 DNA 절단

이평재; 문철; 최윤선; 손현규

doi:10.15324/kjcls.2018.50.2.205

구리이온(II)이 존재할 때 Salvianolic acid B에 의한 DNA 절단
DNA Breakage by Salvianolic acid B in the Presence of Cu (II) 원문보기

Korean journal of clinical laboratory science : KJCLS = 대한임상검사과학회지, v.50 no.2, 2018년, pp.205 - 210

이평재 (세명대학교 바이오제약산업학부) , 문철 (세명대학교 임상병리학과) , 최윤선 (세명대학교 화장품과학과) , 손현규 (세명대학교 자연약재과학과)

초록
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단삼의 성분인 salvianolic acid B는 다양한 생리활성이 알려져 있다. 특히 항산화 효과는 간세포, 신경세포를 포함한 다양한 세포유형에서 보호효과가 있다고 보고되었다. 하지만 ferulic acid와 같이 항산화제로 여겨지는 몇몇 페놀성 물질은 특정 전이 금속이 있으면 산화작용을 하며 이것이 항암 효능을 설명하기도 한다. 본 실험에서 salvianolic acid B가 $Cu^{2+}$ 환경에서 산화작용을 하는지 알아보았다. salvianolic acid B와 $Cu^{2+}$를 동시 처리하면 supercoilded 형태의 DNA가 open circular 혹은 linear 형태로 바뀌었으나 salvianolic acid B 혹은 $Cu^{2+}$를 단독 처리 했을 때는 그렇지 않았다. $Cu^+$에만 특정적인 킬레이터 neocuproine을 이용하여 salvianolic acid B가 $Cu^{2+}$를 $Cu^+$로 환원시킴을 알았으며 $H_2O_2$를 물과 산소로 분해하는 catalase를 처리하면 DNA 분해가 일어나지 않았다. 활성산소종 중 하나인 $H_2O_2$는 생체분자 특히 DNA를 공격하여 정상기능을 수행하지 못하게 한다. 정리하면 salvianolic acid B에 의한 $Cu^{2+}$의 환원은 $H_2O_2$를 생성하며 $H_2O_2$는 DNA 분해를 일으킨다. 이런 결과는 salvianolic aicd B의 항암효과가 salvianolic acid의 $H_2O_2$ 생성 때문일 수 있다는 작은 단서를 줄 수 있으며 이는 좀 더 실험이 이뤄져야 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Salvianolic acid B, which is a compound in the Salvia miltiorrhiza, has diverse biological activities, In particular, the antioxidative effects were reported to be involved in the protection of hepatocytes, neurons, and various cell types. On the other hand, some phenolic compounds, such as ferulic acid, which is regarded as an antioxidant, plays a pro-oxidative role in the specific transitional metal environment, which could explain the anticancer effect. This study examined the pro-oxidative effects of salvianolic acid B in the presence of $Cu^{2+}$. Treatment with both salvianolic acid B and $Cu^{2+}$ induced the transition of supercoiled DNA to the open circular or linear form but not in the sole salvianolic acid B or $Cu^{2+}$ treatments. Salvianolic acid B reduced the $Cu^{2+}$ to $Cu^+$ using neocuproine, a $Cu^+$ specific chelator. In addition, catalase, an enzyme that breaks down the $H_2O_2$ to water and molecular oxygen, inhibited the DNA breakage. $H_2O_2$, a reactive oxygen species, has detrimental effects on biological molecules, particularly DNA. Overall, the reduction of $Cu^{2+}$ by salvianolic acid B could lead to the production of $H_2O_2$ followed by DNA breakage. These results suggest that the pro-oxidative effects could be the one of the anti-cancer mechanisms of salvianolic acid B, which remains to be explained.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

위에서 설명했듯이 phenolic compounds 들이 pro-oxidant로 작용하여 ROS 중 특히 hydroxyl radical을 생성한다고 보고가 있으며 이를 phenolic compound의 항암 작용의 하나의 기전으로 설명하기도 한다. 본 실험에서는 단삼의 주요한 생리활성 물질이며 항산화 효과가 있다고 알려진 salvianolic acid B를 대상으로 pro-oxidant로서의 기능하는지 확인하는 실험을 진행하였다.

제안 방법

4 mg/mL in phosphate buffer), FeSO₄(2 mM), salvianolic acid B (200 μM, 10 μM,100 μM, 200 μM)을 혼합 한 후 H2O를 이용하여 총부피를 40 μL로 맞추었다. Heating block을 이용하여 37 °C에서 60분간 반응시킨 후 TAE buffer (1X)로 만든 1% agarose gel을 만들어 전기영동 시킨 후 gel image analysis system을 사용하여 결과를 확인하였다.
Salvianolic acid B에 의해 Cu²⁺가 Cu⁺로 변환되는지를 확인하기 위해 Cu⁺과 특이적으로 결합하는 neocuproine를 이용하였다. CuSO₄ (100 μM), neocuproine (400 μM), salvianolicacid B (1, 5, 10, 100, 200 μM)를 혼합한 후 phosphate buffer(pH 7.
FeSO₄ (200 μM), ferrozine(200 μM), salvianolic acid B (10 μM, 100 μM, 200 μM)를 혼합한 후 H₂O를 이용하여 총부피를 400 μL로 맞추었다. 실온에서 10분간 반응 시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 3-(2-Pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-triazine-4`,4``-disulfonic acid sodium salt (Ferrozine), neocuproine, salvianolic acid B, Calf DNA는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입한 제품을 사용하였고, pBR322(Plasmid)는 New England Biolabs (NEB)에서, FeSO₄와 CuSO₄는 Samchun Chemical에서 구입한 제품을 사용하였다.

데이터처리

실험은 독립적으로 3회 반복하였다. 분석한 실험 결과 값의 통계처리는 평균값±표준편차로 나타내었으며, 실험 결과 값의 통계적 유의성은 대조군과 각각의 시료처리 군의 실험 결과값으로부터 Student’s t-test를 통하여 검증하였다. P-value＜0.

성능/효과

본 실험에서 환원형태의 Fe²⁺는 DNA 절단을 일으키지만 salvianolic acid B는 플라스미드와 Calf DNA에서 절단을 억제하였고 산화형태의 Cu²⁺는 단독으로 DNA 절단을 일으키지 않으나 salvianolic acid B를 첨가함으로서 DNA의 절단을 확인하였다. Catalase 및 EDTA 처리는 플라스미드의 절단을 억제하였고 neocuproine를 처리했을 때 흡광도가 증가함을 확인하였다.
이를 종합해 보면 Cu²⁺가 DNA와 결합하고 salvianolic acidB와의 산화환원 반응을 통해 Cu⁺로 변환된 후 산소와의 일련의 반응을 통해 H₂O₂를 거쳐 hydroxyl radical을 생성한다고 볼 수 있다. 즉 산화형의 금속이 존재할 때 전자를 부여하는 능력이산화형의 금속을 환원시키면 hydroxyl radical의 생성을 늘리며 이것이 DNA을 절단한다고 생각되어진다. 이는 항산화능력이 있다고 여겨지는 물질도 주위 금속 이온의 환경에 따라 pro-oxidant로서 기능을 수행함을 의미한다.

후속연구

다만 이런 결과는 salvianolic acid B의 항암효과를 설명하는 하나의 기전으로 ROS 생성을 고려해 볼 수 있다고 생각한다. 앞으로 다양한 암세포에 대한 salvianolic acid B의 독성효과와 그 기전을 설명하는데 있어 전이 금속상태와 ROS 생성 관계를면밀히 살펴볼 필요가 있다고 생각한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)이란?	단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 중앙ㆍ서아메리카, 중앙ㆍ동 아시아에 분포하는 꿀풀과에 속하는 다년생 초본식물로서 뿌리를 약용으로 사용한다. 단삼에 포함되어있는 주요 성분은 diterpene 화합물에 포함되는 tanshinone I, IIA, IIB 등 과 phenolic 화합물에 포함되는 danshensu, protocatechuicaldehyde, salvianolic acid B 등이 알려져 있다[9].
	활성산소종이 세포 기능에 미치는 영향은?	미토콘드리아에서 전자전달계를 거친 전자는 최종적으로 산소가 수용하는데 전자전달계를 이탈한 전자는 산소와 반응하여 superoxide radical (-O2–), hydrogen peroxide(H2O2), hydroxyl radical (-OH) 등 반응성이 강한 활성산소종(Reactive Oxygen Species: ROS)을 생성하게 된다. 때로는 이와 다른 화학적 반응을 통해 ROS를 생성하기도 하는데 이렇게 생성된 활성산소종은 세포를 구성하는 핵산, 단백질, 지질의 구조를 변화시키고 이는 세포의 기능에 심각한 손상을 줄 수 있다. 이를 oxidative stress (OS) 라 부르며 퇴행성질환 및 노화에 있어 주요한 원인으로 여겨지고 있다.
	단삼의 성분인 salvianolic acid B의 생리활성 중 항산화 효과는 어떤 보호 효과가 있는가?	단삼의 성분인 salvianolic acid B는 다양한 생리활성이 알려져 있다. 특히 항산화 효과는 간세포, 신경세포를 포함한 다양한 세포유형에서 보호효과가 있다고 보고되었다. 하지만 ferulicacid와 같이 항산화제로 여겨지는 몇몇 페놀성 물질은 특정 전이 금속이 있으면 산화작용을 하며 이것이 항암 효능을 설명하기도 한다.

참고문헌 (19)

Halliwell B. Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning). Free Radic Res. 1999;31:261-272.

상세보기
Deponte M. Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes. Biochim Biophys Acta. 2013;1830:3217-3266.

상세보기
Rajendran P, Nandakumar N, Rengarajan T, Palaniswami R, Gnanadhas EN, Lakshminarasaiah U, et al. Antioxidants and human diseases. Clin Chim Acta. 2014;436: 332-347.

상세보기
Murakami K, Haneda M, Qiao S, Naruse M, Yoshino M. Prooxidant action of rosmarinic acid: transition metal-dependent generation of reactive oxygen species. Toxicol In Vitro. 2007;21: 613-617.

상세보기
Yoshino M, Haneda M, Naruse M, Htay HH, Iwata S, Tsubouchi R, et al. Prooxidant action of gallic acid compoounds: copper-dependent strand breaks and the formation of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in DNA. Toxicol In Vitro. 2002;16:705-709.

상세보기
Sarwar T, Zafaryab M, Husain MA, Ishqi HM, Rehman SU, Rizvi MM, et al. Redox cycling of endogenous copper by ferulic acid leads to cellular DNA breakage and consequent cell death: A putative cancer chemotherapy mechanism. Toxicol Appl Pharmacol. 2015;289:251-261.

상세보기
Quassinti L, Ortenzi F, Marcantoni E, Ricciutelli M, Lupidi G, Ortenzi C, Buonanno F, et al. DNA binding and oxidative DNA damage induced by climacostol-copper(II) complexes: implications for anticancer properties. Chem Biol Interact. 2013;206:109-116.

상세보기
Bhat SH, Azmi AS, Hadi SM. Prooxidant DNA breakage induced by caffeic acid in human peripheral lymphocytes: involvement of endogenous copper and a putative mechanism for anticancer properties. Toxicol Appl Pharmacol. 2007;218:249-255.

상세보기
Pang H, Wu L, Tang Y, Zhou G, Qu C, Duan JA. Chemical Analysis of the Herbal Medicine Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma (Danshen). Molecules. 2016;21:51.

상세보기
Tian LL, Wang XJ, Sun YN, Li CR, Xing YL, Zhao HB, et al. Salvianolic acid B, an antioxidant from Salvia miltiorrhiza, prevents 6-hydroxydopamine induced apoptosis in SH-SY5Y cells. Int J Biochem Cell Biol. 2008;40:409-422.

상세보기
Liu CS, Chen NH, Zhang JT. Protection of PC12 cells from hydrogen peroxide-induced cytotoxicity by salvianolic acid B, a new compound isolated form Radix Salviae miltiorrhizae. Phytomedicine. 2007;14:492-497.

상세보기
Zeng W, Shan W, Gao L, Gao D, Hu Y, Wang G, et al. Inhibition of HMGB1 release via salvianolic acid B-mediated SIRT1 up-regulation protects rats against non-alcoholic fatty liver disease. Sci Rep. 2015; 5:16013.

상세보기
Wu HL, Li YH, Lin YH, Wang R, Li YB, Tie L, et al. Salvianolic acid B protects human endothelial cells from oxidative stress damage: a possible protective role of glucose-regulated protein 78 induction. Cardiovasc Res. 2009; 81:148-158.

상세보기
Zhao GR, Zhang HM, Ye TX, Xiang ZJ, Yuan YJ, Guo ZX, et al. Characterization of the radical scavenging and antioxidant activities of danshensu and salvianolic acid B. Food Chem Toxicol. 2008;46:73-81.

상세보기
Biaglow JE, Manevich Y, Uckun F, Held KD. Quantitation of hydroxyl radicals produced by radiation and copper-linked oxidation of ascorbate by 2-deoxy-D-ribose method. Free Radic Biol Med. 1997;22:1129-1138.

상세보기
Lloyd DR, Phillips DH. Oxidative DNA damage mediated copper(II), iron(II) and nickel(II) fenton reactions: evidence for site-specific mechanisms in the formation of double-strand breaks, 8-hydroxydeoxyguanosine and putative intrastrand cross-links. Mutat Res. 1999;424:23-36.

상세보기
Gupte A, Mumper RJ. Elevated copper and oxidative stress in cancer cells as a target for cancer treatment. Cancer Treat Rev. 2009;35:32-46.

상세보기
Wu CF, Karioti A, Rohr D, Bilia AR, Efferth T. Production of rosmarinic acid and salvianolic acid B from callus culture of Salvia miltiorrhiza with cytotoxicity towards acute lymphoblastic leukemia cells. Food Chem. 2016;201:292-297.

상세보기
Guo P, Wang S, Liang W, Wang W, Wang H, Zhao M, et al. Salvianolic acid B reverses multidrug resistance in HCT-8/VCR human colorectal cancer cells by increasing ROS levels. Mol Med Rep. 2017;15:724-730.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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