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제안 방법
- DEAE-Sepharose에 결합된 프로테아제의 용출을 통하여 정제된 효소의 활성은 70−120 mM 농도의 NaCl을 이용하여 용출한 분획 8−13 사이에서 확인하였다(Fig. 2).
- 따라서, 배양액으로부터 프로테아제의 일차적인 정제를 위한 침전 조건을 70%의 암모늄 설페이트로 설정하고, 침전되어 얻어진 프로테아제의 고순도 정제를 위한 크로마토그래프를 수행하였다. 침전으로부터 얻어진 프로테아제 용액을 DEAE-Sepharose 컬럼의 단백질 결합을 최적화 하기 위하여 실험을 수행한 결과, pH 7.
- 로부터 생산된 프로테아제의 최적 침적 범위를 확인하기 위하여 30−80% 범위의 암모늄 설페이트를 이용하여 gradient precipitation을 수행하였다.
- Janthinobacterium sp.로부터 세포외로 분비된 프로테아제를 분리하기 위하여 먼저 gradient precipitation을 수행하였다. 발효 후 얻어진 여액에 암모늄 설페이트를 0−100% 농도 범위로 처리한 후 4℃, 22,000 ×g으로 30분간 원심분리하였다.
- 미생물의 성장은 ELISA Reader (Molecular Devices, VersaMaxTM and SpetraMax® 340PC384, USA)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 이러한 방법을 통해서 최적의 암모늄 설페이트 농도를 설정하였고, 이후 정제 단계의 최적화를 진행하였다. 발효 후 얻어진 여액에 암모늄 설페이트를 70%의 농도로 처리한 후 4℃, 22,000 ×g으로 30분간 원심분리 하였다.
- 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제의 최적화를 위하여 다양한 조건의 pH (6.5−8.5)와 유속(1.5−3 ml/min)에서 정제를 수행하고 분석하였다.
- 5)로 녹인 후 같은 용액으로 투석을 진행하였다. 투석 용액은 적어도 2번 교체하였고, 침전을 위해 사용된 암모늄 설페이트 농도에 대한 상대적인 프로테아제의 활성을 투석 후 측정하였다.
- 투석 후 원심분리 하여 분리된 상층액을 DEAE-Sepharose column (1.5 × 5 cm, Sigma-Aldrich)에 가하였고 0−0.5 M 농도의 NaCl을 30 ml/h의 유속으로 10 ml씩 용출하였고 각각의 분획의 효소 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 Janthinobacterium sp. PAMC 25641은 극지연구소(Korea Polar Research Institute, Korea)로부터 분양받았다. 이전 연구에 따르면 Janthinobacterium sp.
이론/모형
- 따라서, 본 논문에서는 이전 연구에서 선별된 극지 미생물들 중 프로테아제의 활성이 높은 Janthinobacterium sp. PAMC 25641로부터 분비된 프로테아제의 정제 연구를 수행하였다[12].
- 단백질의 농도는 Bradford assay 방법을 이용하여 측정하 였다[13].
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