남북극 유래 저온성 박테리아 Culture Collection에서 저온활성 프로테아제 생산균주의 스크리닝과 효소 특성 Screening for Cold-Active Protease-Producing Bacteria from the Culture Collection of Polar Microorganisms and Characterization of Proteolytic Activities원문보기
극지연구소(KOPRI)는 국내외적으로 유일하게 남북극 지역에서 분리한 저온적응성 박테리아 균주를 대상으로 culture collection(약 6,300균주)을 구축하여 운영하고 있다. 보유 중인 프로테아제(protease) 생산 균주들(총 874균주) 중에서 활성이 높은 프로테아제를 생산하는 78개의 균주들을 1차 선발한 후, 1% skim milk가 포함된 0.1${\times}$ ZoBell 고체배지에 접종하고 다양한 온도($5-30^{\circ}C$)에서 배양하면서 세포외분비성 프로테아제의 활성을 비교하였다. 위의 신속하고 직접적인 균주 스크리닝 방법을 통해서, 최종적으로 저온활성 프로테아제를 생산하는 15개의 저온적응성 균주들을 선발하였다. 최종 선발된 균주들은 16S rRNA 유전자의 분석결과 Pseudoalteromonas (13균주)와 Flavobacterium (2균주) 속(genus)으로 분류되었고, $5-15^{\circ}C$ 저온에서도 활성을 나타내는 저온성 프로테아제를 생산하였다. 15개 균주들이 생산하는 각각의 프로테아제는 특이적 화합물에 의한 효소활성 억제 정도에 따라 5개의 그룹(serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metalloprotease, 그리고 미분류 프로테아제)으로 분류되었다. 본 실험을 통해서 선발한 남북극 유래 박테리아 균주들은 새로운 저온활성 프로테아제를 발굴하기 위한 유용한 생물자원으로서의 가치를 가지고 있다.
극지연구소(KOPRI)는 국내외적으로 유일하게 남북극 지역에서 분리한 저온적응성 박테리아 균주를 대상으로 culture collection(약 6,300균주)을 구축하여 운영하고 있다. 보유 중인 프로테아제(protease) 생산 균주들(총 874균주) 중에서 활성이 높은 프로테아제를 생산하는 78개의 균주들을 1차 선발한 후, 1% skim milk가 포함된 0.1${\times}$ ZoBell 고체배지에 접종하고 다양한 온도($5-30^{\circ}C$)에서 배양하면서 세포외분비성 프로테아제의 활성을 비교하였다. 위의 신속하고 직접적인 균주 스크리닝 방법을 통해서, 최종적으로 저온활성 프로테아제를 생산하는 15개의 저온적응성 균주들을 선발하였다. 최종 선발된 균주들은 16S rRNA 유전자의 분석결과 Pseudoalteromonas (13균주)와 Flavobacterium (2균주) 속(genus)으로 분류되었고, $5-15^{\circ}C$ 저온에서도 활성을 나타내는 저온성 프로테아제를 생산하였다. 15개 균주들이 생산하는 각각의 프로테아제는 특이적 화합물에 의한 효소활성 억제 정도에 따라 5개의 그룹(serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metalloprotease, 그리고 미분류 프로테아제)으로 분류되었다. 본 실험을 통해서 선발한 남북극 유래 박테리아 균주들은 새로운 저온활성 프로테아제를 발굴하기 위한 유용한 생물자원으로서의 가치를 가지고 있다.
The Korea Polar Research Institute (KOPRI) has assembled a culture collection of cold-adapted bacterial strains from both the Arctic and Antarctic. To identify excellent protease-producers among the proteolytic bacterial collection (874 strains), 78 strains were selected in advance according to thei...
The Korea Polar Research Institute (KOPRI) has assembled a culture collection of cold-adapted bacterial strains from both the Arctic and Antarctic. To identify excellent protease-producers among the proteolytic bacterial collection (874 strains), 78 strains were selected in advance according to their relative activities and were subsequently re-examined for their extracellular protease activity on $0.1{\times}$ ZoBell plates supplemented with 1% skim milk at various temperatures. This rapid and direct screening method permitted the selection of a small group of 15 cold-adapted bacterial strains, belonging to either the genus Pseudoalteromonas (13 strains) or Flavobacterium (2 strains), that showed proteolytic activities at temperatures ranging between $5-15^{\circ}C$. The cold-active proteases from these strains were classified into four categories (serine protease, aspartic protease, cysteine protease, and metalloprotease) according to the extent of enzymatic inhibition by a class-specific protease inhibitor. Since highly active and/or cold-adapted proteases have the potential for industrial or commercial enzyme development, the protease-producing bacteria selected in this work will be studied as a valuable natural source of new proteases. Our results also highlight the relevance of the Antarctic for the isolation of protease-producing bacteria active at low temperatures.
The Korea Polar Research Institute (KOPRI) has assembled a culture collection of cold-adapted bacterial strains from both the Arctic and Antarctic. To identify excellent protease-producers among the proteolytic bacterial collection (874 strains), 78 strains were selected in advance according to their relative activities and were subsequently re-examined for their extracellular protease activity on $0.1{\times}$ ZoBell plates supplemented with 1% skim milk at various temperatures. This rapid and direct screening method permitted the selection of a small group of 15 cold-adapted bacterial strains, belonging to either the genus Pseudoalteromonas (13 strains) or Flavobacterium (2 strains), that showed proteolytic activities at temperatures ranging between $5-15^{\circ}C$. The cold-active proteases from these strains were classified into four categories (serine protease, aspartic protease, cysteine protease, and metalloprotease) according to the extent of enzymatic inhibition by a class-specific protease inhibitor. Since highly active and/or cold-adapted proteases have the potential for industrial or commercial enzyme development, the protease-producing bacteria selected in this work will be studied as a valuable natural source of new proteases. Our results also highlight the relevance of the Antarctic for the isolation of protease-producing bacteria active at low temperatures.
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제안 방법
1시간 반응 후, 6.5% azocasein 용액(90 μl)을 첨가하고 25°C에서 1시간 동안 효소-기질 반응을 수행하였다.
각 박테리아 균주를 대상으로 박테리아 universal primer인 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)와 1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)를 이용하여 단일 콜로니로부터 16S rRNA 유전자를 증폭시켰다(12).
다양한 배양온도에서 고체 배지에 형성하는 투명환의 크기에 따라 효소 활성을 0-4점으로 기록하였는데, 10°C에서 3점 이상의 활성을 나타내는 78개의 균주들을 저온활성의 산업공정용 효소 개발을 위해 1차 선발하였고, 이들 선발된 균주들을 SZB 고체 배지를 이용하여 동일한 조건에서 다양한 온도(5-30°C)에 따른 활성을 재평가하였다(Fig. 1).
반응종결 상층액 (0.5 ml)에 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma, 0.25 ml)과 0.5 M Na2CO3 (1.25 ml)를 혼합하고 25°C에서 30분 반응 시키면서 발색 변화를 660 nm 흡광도에서 측정하였다.
보유 중인 프로테아제(protease) 생산 균주들(총 874균주) 중에서 활성이 높은 프로테아제를 생산하는 78개의 균주들을 1차 선발한 후, 1% skim milk가 포함된 0.1× ZoBell 고체배지에 접종하고 다양한 온도(5-30°C)에서 배양하면서 세포외분비성 프로테아제의 활성을 비교하였다.
7%(874개 균주)는 1% skim milk가 포함된 고체배지에서 성장할 때, skim milk의 가수분해로 생기는 투명환을 형성하므로 프로테아제 생산균주로 분류되었다. 본 논문에서는 적합한 고체배지에서 균주를 배양하면서 투명환 형성을 유도하는 간단하고 빠른 방법을 적용하여 저온활성 프로테아제 생산균주를 선발한 후, 이들이 생산하는 세포외분비 프로테아제의 최적 온도를 조사하였고, 반응특이적 화합물에 의한 효소활성 억제 정도에 따라 5개의 그룹으로 분류하였다.
본 실험에 사용된 균주들이 생산하는 저온활성 프로테아제는 효소 활성을 특이적으로 억제하는 화합물과 반응 후에, 프로테아제 활성의 억제 정도에 따라 아래에 기술한 대로 분류하였다. 다양한 프로테아제 활성 억제제[1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM HgCl2, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 또는 0.
또한 프로테아제는 반응 최적 pH에 따라 산성, 중성, 또는 염기성 프로테아제로 분류되기도 한다(15). 본 연구에서는 첫 번째의 분류체계를 따라, 각 효소형의 프로테아제 특이적 화학물에 의한 활성 억제 정도를 평가하여 15개의 저온활성 프로테아제를 분류하였다. 활성 억제제를 처리하지 않은 대조군(100%)과 비교하여 50% 이상의 활성이 감소되었다면 대상 프로테아제에 대한 효소활성 억제 효과가 있는 것으로 간주하였다.
이들 프로테아제의 저온에서의 활성을 정량화하기 위해서 15°C에서 배양한 각 균주의 배양액 내에 존재하는 프로테아제의 활성을 5-30°C 범위에서 측정하였다.
이를 균주로부터 5-15°C 저온에서도 높은 활성을 유지하는 15종류의 저온활성 프로테아제를 확보하였으며, 이들 중에서 7종류의 프로테아제를 산업적으로 유용한 serine-type 효소 형으로 분류하였다.
5% azocasein 용액(90 μl)을 첨가하고 25°C에서 1시간 동안 효소-기질 반응을 수행하였다. 잔존 프로테아제 활성은 억제제를 첨가하지 않은 효소의 활성(100%)과 비교하여 산출하였으며, 위에 언급한 방법에 따라 효소 활성을 측정하였다.
저온(5-15°C)에서 넓은 투명환을 형성하는 균주들을 저온적응성 균주로 판단하고, 이들이 생산하는 프로테아제를 저온활성 효소로 판단하여, 최종적으로 15개의 균주들을 저온활성 프로테아제를 생산하는 저온적응성 균주로 선정하였다(Fig. 1 and Table 1).
3 mM pepstatin A]가 포함된 standard buffer (810 μl)에 효소현탁액(200 μl)을 혼합한 후, 0°C에서 1시간 반응시켰다. 추가적으로, 금속 이온(1 mM ZnSO4)에 의한 프로테아제 활성 영향을 함께 조사하였다. 1시간 반응 후, 6.
프로테아제 생산과 활성에 대한 온도의 영향을 평가하기 위하여, 세포 현탁액을 96-well microplate로부터 96-pin replicator (VP-408B, V&P Scientific, USA)를 이용하여 SZB 고체배지에 접종한 후, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30°C에서 48시간 배양하였다.
25 ml)를 혼합하고 25°C에서 30분 반응 시키면서 발색 변화를 660 nm 흡광도에서 측정하였다. 효소와 기질 반응의 결과 azocasein으로부터 분해되어 유리되는 아미노산의 양은 L-tyrosine의 표준곡선과 비교함으로써 산출하였다. 프로테아제 활성 1 unit은 1 mg 효소단백질이 25°C에서 1분간 반응할 경우, 1 nmole의 아미노산을 생산할 수 있는 활성으로 정의하였다.
대상 데이터
콜로니 직경보다 투명환 직경이 더 큰 경우 4점, 투명환 직경이 콜로니 반경보다 크지만 직경보다 작을 경우 3점, 뚜렷한 투명환이 관찰되나 콜로니 반경보다 투명환 직경이 작을 경우 2점, 뚜렷한 투명환이 아닐 경우 1점, 그리고 투명환을 형성하지 못할 경우에는 0점으로 기록되었다. 강한 (저온)활성의 프로테아제 생산균주를 선발하기 위해, 874균주들 중에서 상대적 활성이 높은 78개의 균주를 1차 선발하였다. 글리세롤 세포현탁액으로 보관 중이던 균주들은 1% skim milk가 포함된 0.
본 연구에서 우리는 극지 미생물의 KOPRI culture collection로부터 세포외분비 프로테아제를 생산하는 저온적응성 박테리아 균주들을 간단하고 빠른 방법을 이용하여 선발하였다. 이를 균주로부터 5-15°C 저온에서도 높은 활성을 유지하는 15종류의 저온활성 프로테아제를 확보하였으며, 이들 중에서 7종류의 프로테아제를 산업적으로 유용한 serine-type 효소 형으로 분류하였다.
1× ZoBell 고체배지에 접종하고 다양한 온도(5-30°C)에서 배양하면서 세포외분비성 프로테아제의 활성을 비교하였다. 위의 신속하고 직접적인 균주 스크리닝 방법을 통해서, 최종적으로 저온활성 프로테아제를 생산하는 15개의 저온적응성 균주들을 선발하였다. 최종 선발된 균주들은 16S rRNA 유전자의 분석결과 Pseudoalteromonas (13균주)와 Flavobacterium (2균주) 속(genus)으로 분류되었고, 5-15°C 저온에서도 활성을 나타내는 저온성 프로테아제를 생산하였다.
이론/모형
각 균주의 분류 및 동정을 위해, 확보한 16S rRNA 유전자의 full-length 염기서열과 EzTaxon database (5)에 등록되어 있는 박테리아 16S rRNA 염기서열과의 유사성을 비교하였고, Kimura’s 2-parameter evolutionary model (11)에 의해 계산된 distance matrix를 기초로 한 neighbor-joining analysis (16) 방법을 이용하여 유연관계가 높은 균주들 사이의 계통발생적 연관성을 분석하였다.
성능/효과
과거 10년 동안, 많은 저온적응 또는 저온활성 프로테아제가 남극 호냉성 박테리아에서 분리되어 그들의 분자적, 생화학적 특성이 연구되어 왔다(1, 18, 19, 20). 13개의 남극 균주에서 생산되며 효소 기능에 대해 연구가 진행된 저온활성 프로테아제들 중에서 약 54%(7개의 프로테아제)는 serine protease로, 15%(2개의 프로테아제)는 serine-type metalloprotease로 분류되었다. Rao와 공동 연구자들은 미생물 serine protease는 바이러스, 박테리아, 그리고 진핵생물 사이에서 광범위하게 많이 존재하며, 이 효소가 각 생명체의 기능유지에 중요하다고 보고하였다(15).
최종 선발된 균주들은 16S rRNA 유전자의 분석결과 Pseudoalteromonas (13균주)와 Flavobacterium (2균주) 속(genus)으로 분류되었고, 5-15°C 저온에서도 활성을 나타내는 저온성 프로테아제를 생산하였다. 15개 균주들이 생산하는 각각의 프로테아제는 특이적 화합물에 의한 효소활성 억제 정도에 따라 5개의 그룹(serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metalloprotease, 그리고 미분류 프로테아제)으로 분류되었다. 본 실험을 통해서 선발한 남북극 유래 박테리아 균주들은 새로운 저온활성 프로테아제를 발굴하기 위한 유용한 생물자원으로서의 가치를 가지고 있다.
5°C에서 30°C로 효소반응 온도가 증가할수록, 모든 프로테아제 활성은 서서히 증가하여 30°C에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
로 분류할 수 있다. KOPRI 21146과 26323은 각각 P. arctica A 37-1-2T(99.6%)과 P. elyakovii KMM 162T(99.9%)와 가장 높은 유사성을 보였는데, 염기서열의 계통 분석(phylogenetic analysis) 결과, 참고 염기서열(reference sequences) 중 특정 종과의 연관성은 명확하지 않았다. KOPRI 26332와 26336은 Flavobacterium 속에 속하며, F.
9%)와 가장 높은 유사성을 보였는데, 염기서열의 계통 분석(phylogenetic analysis) 결과, 참고 염기서열(reference sequences) 중 특정 종과의 연관성은 명확하지 않았다. KOPRI 26332와 26336은 Flavobacterium 속에 속하며, F. frigidarium ATCC 700810T와 99.4%이상의 높은 유사성을 나타내었다.
2 and Table 2). Pseudoalteromonas 속에 포함되는 균주들은 P. arctica, P. nigrifaciens, P. haloplanktis, P. antarctica 혹은 P. translucida와 99.4% 이상의 높은 염기서열 유사도를 보여주었다. KOPRI 21138은 Alteromonas fuliginea와 밀접하게 연관되는 것으로 분석되었으나, 이전에 발표된 논문(9)에서 A.
북극 샘플에서 분리된 KOPRI 25467을 제외한 14개의 박테리아 균주들은 모두 남극의 토양 혹은 해양의 다양한 환경시료에서 분리되었다. 각 균주에서 확보한 16S rRNA 유전자 정보를 염기서열의 유사성과 계통 발생적 연관성에 대해 평가했을 때, 15개의 균주는 Pseudoalteromonas (13 균주) 속 또는 Flavobacterium (2 균주) 속으로 분류되었다(Fig. 2 and Table 2). Pseudoalteromonas 속에 포함되는 균주들은 P.
KOPRI 21138 프로테아제는 cysteine protease의 활성 억제제인 Hg2+(HgCl2)에 의해 50%이상 활성이 억제되었다(17). 종합적으로, 15개의 프로테아제 중에서 7개가 serine protease (47%)이며, 이 중에서 2개는 metalloprotease의 특성도 함께 가지고 있는 것으로 확인되었다.
최종 선발된 균주들은 16S rRNA 유전자의 분석결과 Pseudoalteromonas (13균주)와 Flavobacterium (2균주) 속(genus)으로 분류되었고, 5-15°C 저온에서도 활성을 나타내는 저온성 프로테아제를 생산하였다.
극지연구소에서 보존 중인 약 6,300개의 저온적응성 박테리아 균주들 중에서 프로테아제를 생산할 수 있는 874개의 균주들은 분리 초기에 개별 연구자에 의해 1% skim milk가 포함된 적당한 고체배지에서 투명환을 나타내는 활성 정도(0-4점)에 따라 이미 등급 별로 분류되어 기록되었다. 콜로니 직경보다 투명환 직경이 더 큰 경우 4점, 투명환 직경이 콜로니 반경보다 크지만 직경보다 작을 경우 3점, 뚜렷한 투명환이 관찰되나 콜로니 반경보다 투명환 직경이 작을 경우 2점, 뚜렷한 투명환이 아닐 경우 1점, 그리고 투명환을 형성하지 못할 경우에는 0점으로 기록되었다. 강한 (저온)활성의 프로테아제 생산균주를 선발하기 위해, 874균주들 중에서 상대적 활성이 높은 78개의 균주를 1차 선발하였다.
특히, SZB 고체 배지에서 배양한 대부분의 균주들이 생산하는 세포외분비 프로테아제는 5-10°C보다는 15-30°C에서 뚜렷한 투명환을 형성하였으나, 두 균주(KOPRI 26332와 26336)는 20°C 부근에서 가장 뚜렷한 투명환을 형성하며 30°C에서는 투명환을 형성하지 않았다.
후속연구
이를 균주로부터 5-15°C 저온에서도 높은 활성을 유지하는 15종류의 저온활성 프로테아제를 확보하였으며, 이들 중에서 7종류의 프로테아제를 산업적으로 유용한 serine-type 효소 형으로 분류하였다. 의류 세탁과정에서 단백질 얼룩을 제거하기 위해서 프로테아제를 첨가하는 것은 가장 좋은 방법이며, 산업적으로 사용되는 모든 세제 첨가용 프로테아제는 박테리아 유래의 serine 프로테아제이기 때문에, 본 연구에서 확보한 저온활성 serine 프로테아제는 세탁용 세제의 효소첨가물처럼 산업적으로 유용하게 활용될 수 있으리라 기대한다.
이러한 이유로 극지연구소는 남북극 저온적응성 미생물로 구성된 KOPRI culture collection을 운영해오고 있다. 향후 산업적으로 유용한 저온활성 효소를 개발하기 위해서는 추가적인 극지 미생물의 확보와 이들이 생산하는 효소에 대한 산업적 중요성을 인식할 필요가 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
저온활성 프로테아제는 어디에 사용되고 있나?
프로테아제는 총 산업 효소 시장의 약 60%를 차지하고 있는데(6), 세제 산업, 식품 산업, 정육 및 가죽 산업, 그리고 인간과 동물의 소화 보조제 등의 다양한 영역에 사용되는 효소이다(15). 예를 들어, 저온활성 프로테아제는 세탁온도를 낮춤으로써 에너지 소비를 감소시키기 위하여 세제첨가물로 사용되고 있으며, 식품 산업에서는 치즈 성숙, 유제품 생산, 냉장육류의 맛 개선에 사용된다(4, 7, 8).
프로테아제는 무엇인가?
프로테아제는 총 산업 효소 시장의 약 60%를 차지하고 있는데(6), 세제 산업, 식품 산업, 정육 및 가죽 산업, 그리고 인간과 동물의 소화 보조제 등의 다양한 영역에 사용되는 효소이다(15). 예를 들어, 저온활성 프로테아제는 세탁온도를 낮춤으로써 에너지 소비를 감소시키기 위하여 세제첨가물로 사용되고 있으며, 식품 산업에서는 치즈 성숙, 유제품 생산, 냉장육류의 맛 개선에 사용된다(4, 7, 8).
극지연구소(KOPRI) 극지바이오센타에서 수집, 보존하고 있는 균주의 수는?
2003년 이래로, 극지연구소(KOPRI) 극지바이오센타는 산업적으로 유용한 효소를 발굴하고 개발하기 위해 저온적응성 박테리아를 수집해 왔다. 이에 따라, 다양한 속(genus)과 종(species)으로 구성되는 6,300개 이상의 균주를 수집 및 보존하고 있다. 이 균주들은 북극(Svalbard 군도 내 Ny-Ålesund 지역, Siberia 북쪽에 위치한 북극해인 Kara Sea, 그리고 Norway와 Russia 북쪽의 북극해인 Barents Sea)과 남극(King George 섬 내에 위치한 Barton 반도와 Weaver 반도) 지역의 육지(토양, 담수, 빙하, 눈, 식물체 부스러기 등)와 바다(해수와 퇴적물) 샘플로부터 분리되었으며, 프로테아제, 키티나아제(chitinase), 그리고 리파아제(lipase)를 생산하는 능력을 가지는 균주가 다수 포함되어 있다.
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