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문제 정의
- 또한 RegnaultRoger (1997)은 α-terpinene과 terpinen-4-ol을 혼합하여 처리할 경우 담배거세미나방(Spodoptera litura)에 대한 살충활성이 현저하게 향상된다고 보고하였다. Camphor와caryophyllen oxide가 협력효과를 통해 살충활성을 향상시킨다는 결과는 본 연구에서 처음으로 보고한다.
- 하지만 녹나무 추출물을 활용한 진딧물 방제와 관련된 연구는 수행되어 있지 않다. 본 연구에서는 녹나무 추출물을 진딧물 살충활성 식물소재로 선발하고 이를 중심으로 추가적인 연구를 수행하였다.
- 따라서 농산물의 잔류농약에 대한 안전성을 갖기 위해 재배과정 중 농약의 사용을 줄일 수 있는 대안으로 국내에서 쉽게 공급이 가능한 식물추출물의 다양한 살충성분을 탐색하는 연구가 필요하다. 본 연구에서는 상기와 같은 배경을 기반으로 복숭아혹진딧물을 방제하기 위해 사용될 수 있는 천연식물 추출물을 탐색하기 위해 국내에서 자생하는 식물추출물을 대상으로 살충효능을 시험하여 향후 새로운 살충제 개발을 위한 선도물질을 제시하고자 하였다.
- 농축액은 상기와 같이 진딧물 살충효능 시험에 이용하였다. 살충효능 시험에서 살충활성이 우수한 추출액을 대상으로 살충활성물질을 구명하기 위한 시료로 이용하였다. 이를 위해 농축액을 소량의 n-hexane으로 용해한 다음 20 g의 silica gel (230-400 mesh, Merck)이 충진된 유리컬럼(20 mm i.
- 상기의 결과에서 서술한 바와 같이 camphor가 caryophyllenoxide의 살충활성에 협력제로서 작용할 수 있다는 가능성을 알고 이를 구명하고자 하였다. 활성물질이 살충활성을 갖기 위해서는 해충의 표피층을 투과한 후 작용점에 일정농도 이상으로 이르러야 한다(Tak & Isman, 2015).
가설 설정
- 1) The data are means±SD of triplicate.
- 2) Identification; RI, retention index; MS, mass spectrum; Ref, reference materials, retention time identical to authentic compounds.
제안 방법
- 상징액은 유기용매용 membrane filter에 통과시킨 후 일부를 취해 GC/MS 분석에 이용하였다. GC/MS 분석은 선택이온 검출법(selective ion monitoring, SIM mode)으로 수행하였으며 주성분의 선택이온 값을 기준으로 작성된 표준검량곡선을 기준으로 진딧물 체내에 잔류하는 살충성분을 정량하였다.
- 녹나무 추출물이 정유성 성분으로 구성되어 있다는 것을 결과를 참조하여 추출물의 성분을 조사하기 위해 GC/MS 분석을 수행하였다. GC/MS 분석결과 11개 성분이 대표적으로 검출되었으며 이들의 linear retention index (LRI)값을 Kovats index (Senatore et al.
- 따라서 녹나무 추출물의 주요 살충성분은 LC50 값을 기준으로 볼 때 caryophyllene oxide로 판단되었다. 또한 녹나무 추출물에서 가장 높은 검출비율을 보인 camphor는 다른 성분들의 살충효능에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료되어 camphor와 다른 성분과의 혼합처리에 따른 살충효능을 시험하였다.
- 살충활성물질의 분석은 질량분석기(gas chromatography mass spectrometer, GC/MS)를 이용하여 수행하였다. GC/MS는 Shimadzu QP2010 (Tohyo, Japan) 모델이었으며 분석컬럼은 DB-5 capillary 칼럼(0.
- 균질액은 10분 동안 초음파세척기에서 추출한 다음 8,000 rpm에서 원심분리 후 상징액을 얻었다. 상징액은 유기용매용 membrane filter에 통과시킨 후 일부를 취해 GC/MS 분석에 이용하였다. GC/MS 분석은 선택이온 검출법(selective ion monitoring, SIM mode)으로 수행하였으며 주성분의 선택이온 값을 기준으로 작성된 표준검량곡선을 기준으로 진딧물 체내에 잔류하는 살충성분을 정량하였다.
- 수분이 함유된 여과지가 깔린 plate(100×90 mm)에 3주 동안 재배한 배추 잎(30× 30 mm)을 배치한 다음 2령 크기의 유충을 옮긴 후 12시간 동안 곤충생육용 플라스틱 용기에서 순치시켰다. 순치 후 상기의 혼합용매에 용해한 식물추출물을 증류수로 10배 희석하여 1,000 ㎍/mL의 수준으로 진딧물에 국소적으로 처리하였다. 이때 대조구는 상기의 혼합용매를 증류수로 10배 희석한 용액이었다.
- 식물추출물의 주요 살충성분과 다른 성분 사이에 살충작용의 연관성을 알아보기 위해 단일 성분을 처리하였을 경우와 다른 성분과 혼합하여 처리하였을 경우에 진딧물 반수치사 농도를 조사하였다. 혼합처리의 경우 주요 살충성분의 진딧물에 대한 무영향농도(NOEC, no observed effect concentration)를 산출한 다음 NOEC 수준에 다른 성분의 농도를 다양하게 혼합하여 수행하였다.
- 이러한 결과는 녹나무 추출물의 진딧물에 대한 살충활성이 camphor를 포함한 7가지 성분과 깊은 연관성이 있다는 것을 의미하였다. 이를 구명하기 위해 추출물을 대상으로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 성분을 분리하였다.
- 혼합처리에 따른 주요 살충성분의 살충작용은 진딧물에 대한 살충성분의 농도를 조사하여 구명하였다. 이를 위해 주요 살충성분만 단독으로 처리하거나 다른 성분과 혼합하여 처리한 진딧물 100 마리를 대상으로 진딧물 체내에 잔류하는 살충성분의 농도를 조사하였다. 진딧물 체내에 잔류하는 살충성분의 분석을 위해 n-hexane으로 진딧물의 표피를 세정한 다음 진딧물(100 마리)을 n-hexane과 함께 tissue homogenizer를 이용하여 균질화시켰다.
- 이를 위해 주요 살충성분만 단독으로 처리하거나 다른 성분과 혼합하여 처리한 진딧물 100 마리를 대상으로 진딧물 체내에 잔류하는 살충성분의 농도를 조사하였다. 진딧물 체내에 잔류하는 살충성분의 분석을 위해 n-hexane으로 진딧물의 표피를 세정한 다음 진딧물(100 마리)을 n-hexane과 함께 tissue homogenizer를 이용하여 균질화시켰다. 균질액은 10분 동안 초음파세척기에서 추출한 다음 8,000 rpm에서 원심분리 후 상징액을 얻었다.
- 혼합처리의 경우 주요 살충성분의 진딧물에 대한 무영향농도(NOEC, no observed effect concentration)를 산출한 다음 NOEC 수준에 다른 성분의 농도를 다양하게 혼합하여 수행하였다. 혼합처리에 따른 주요 살충성분의 살충작용은 진딧물에 대한 살충성분의 농도를 조사하여 구명하였다. 이를 위해 주요 살충성분만 단독으로 처리하거나 다른 성분과 혼합하여 처리한 진딧물 100 마리를 대상으로 진딧물 체내에 잔류하는 살충성분의 농도를 조사하였다.
- 식물추출물의 주요 살충성분과 다른 성분 사이에 살충작용의 연관성을 알아보기 위해 단일 성분을 처리하였을 경우와 다른 성분과 혼합하여 처리하였을 경우에 진딧물 반수치사 농도를 조사하였다. 혼합처리의 경우 주요 살충성분의 진딧물에 대한 무영향농도(NOEC, no observed effect concentration)를 산출한 다음 NOEC 수준에 다른 성분의 농도를 다양하게 혼합하여 수행하였다. 혼합처리에 따른 주요 살충성분의 살충작용은 진딧물에 대한 살충성분의 농도를 조사하여 구명하였다.
대상 데이터
- GC/MS는 Shimadzu QP2010 (Tohyo, Japan) 모델이었으며 분석컬럼은 DB-5 capillary 칼럼(0.25 mm i.d.×30 m)을 사용하였다.
- 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)은 전라남도 농업기술원에서 분양받아 배추 잎에 사육하여 사용하였으며, 사육조건은 온도 25 ± 2℃, 광주기 16L : 8D, 상대습도 65 ± 5%이었다.
- 본 연구에서 사용한 천연식물 추출물은 총 298개로서 한국식물추출물은행에서 분양받아 사용하였다. 식물추출물의 살충효능 시험을 위해 추출물을 dimethyl sulfoxie:methanol (4:1, v/v) 혼합용매에 10,000 ㎍/mL 수준으로 용해하여 사용하였다.
- 용매는 HPLC급(Fisher Scientific, USA)을 사용하였으며 silica gel은 Keiselgel 60 (230~400 mesh)은 Merck(Germany) 제품을 사용하였다. 분석용 표준품은 SigmaAldrich (USA)에서 구입하여 사용하였으며 기타 시약은 EP급(Juicei Chemical Co., Japan)을 사용하였다.
- 식물추출물의 살충효능 시험에서 살충활성이 우수한 추출물을 먼저 선발하였다. 추출은 80% (v/v) ethanol 수용액을 이용한 용매침지법과 수증기증류법(Liu et al.
- 용매는 HPLC급(Fisher Scientific, USA)을 사용하였으며 silica gel은 Keiselgel 60 (230~400 mesh)은 Merck(Germany) 제품을 사용하였다. 분석용 표준품은 SigmaAldrich (USA)에서 구입하여 사용하였으며 기타 시약은 EP급(Juicei Chemical Co.
- 9%로서 Table 2에서 보여 준 결과와 유사하게 camphor가 가장 높게 검출되었다(Table 5). 이들 5가지 성분별로 진딧물에 대한 살충효능을 조사하기 위해 상업적으로 시판되고 있는 표준화합물을 이용하여 시험하였다. 상기 5가지 성분의 표준화합물을 이용하여 진딧물에 대한 LC50값을 처리 24시간 후에 조사한 결과 borneol, 4-terpineol, α-terpineol, caryophyllene oxide의 경우 각각 551, 915, 551, 237 μg/mL 수준이었으며 처리 48시간 후에 각각 498, 681, 484, 241 μg/mL 수준이었다(Table 6).
- , 50 cm length)에서 정제하였다. 정제용 용출용매는 n-hexane (Hex)과 ethyl acetate (EtOAc)로 구성된 혼합용매이었으며 시료의 용출은 EtOAC의 농도를 증가시키면서 수행하였고 농도별 용출부피는 칼럼 충진물의 2배 bed volume이었다.
데이터처리
- 2) Means with different superscripts within a column are significantly different at the 5% level by Duncan’s multiple range test.
- Means with different superscripts within a column are significantly different at the 5% level by Duncan’s multiple range test.
이론/모형
- 이동상은 헬륨 가스로서 유속은 1 mL/min 이었고 시료 주입방법은 split mode로서 비율은 20:1이었다. 구성성분 중 탄화수소 물질의 분석은 C6-C26 계열 alkane 화합물의 Kovats index를 참조하여 수행하였다(Libbey, 1991).
- 이때 대조구는 상기의 혼합용매를 증류수로 10배 희석한 용액이었다. 시험은 3반복으로 수행하였으며 살충효능은 Abbott 법(1925)으로 조사하였다.
- 진딧물에 대한 식물추출물의 살충효능 시험은 Kim 등(2007)의 방법에 준하여 실시하였다. 수분이 함유된 여과지가 깔린 plate(100×90 mm)에 3주 동안 재배한 배추 잎(30× 30 mm)을 배치한 다음 2령 크기의 유충을 옮긴 후 12시간 동안 곤충생육용 플라스틱 용기에서 순치시켰다.
- 식물추출물의 살충효능 시험에서 살충활성이 우수한 추출물을 먼저 선발하였다. 추출은 80% (v/v) ethanol 수용액을 이용한 용매침지법과 수증기증류법(Liu et al., 2012)으로 수행하였다. 용매침지법의 경우 음건된 시료(99 g)를 4배 부피의 ethanol수용액에 24시간 동안 2회 침지시킨 후 40℃ 조건에서 감압농축한 다음 농축액을 진딧물 살충효능 시험에 이용하였다.
성능/효과
- GC/MS 분석에서 상대적인 검출비율이 1% 이상을 보인 성분으로서 camphor가 74.79%, β-caryophyllen이 8.93%, caryophyllene oxid이 4.29%, α-terpineol이 4.08%, 4-terpineol이 2.24%, borneol이 1.53%, 그리고 humulene이 1.46% 수준으로서 camphor가 가장 높았다.
- 녹나무 추출물을 silica gel 칼럼에서 정제하면서 용출된 분획별로 진딧물에 대한 살충효능을 조사한 결과 30% ethyl acetate를 함유한 n-hexane 혼합용매로 용출하였을 경우 살충효능은 90% 이상의 수준이었으며 나머지 용출분획에서는 40% 미만의 수준이었다(Table 4). 살충효능이 90% 이상을 보인 혼합용매의 용출액을 GC/MS로 분석한 결과 검출된 성분과 검출비율은 camphor가 60.
- 녹나무 추출액에 함유된 camphor와 다른 성분을 혼합하여 진딧물에 처리한 다음 LC50 값을 조사한 결과 혼합처리 24시간 후 borneol, 4-terpineol, α-terpineol, caryophyllene oxide의 LC50 값이 각각 440, 717, 523, 162 μg/mL 수준이었다(Table 7).
- ) 식물에서 40~60% 수준의 살충효능이 관찰되었으며 다른 식물추출물들의 경우 20% 이하의 살충효능이 관찰되었다. 녹나무과(Cinnamomum camphora) 식물추출물은 살충효능이 62.1%로서 가장 높았으며 40~60% 수준의 살충효능을 보인 다른 식물추출물 대비 통계적 유의차를 보였다(Table 2).
- 식물추출물의 살충효능 시험에서 녹나무 추출물이 가장 우수한 살충활성을 보였으며 이에 녹나무를 대상으로 살충활성물질을 구명하였다. 녹나무의 진딧물에 대한 살충활성은 수증기증류법에 의한 추출물이 용매침지법에 의한 추출물 보다 현저히 높았다(Fig. 1). 수증기증류법에 의한 추출물 경우 1,000 μg/mL 수준에서 96.
- 활성물질이 살충활성을 갖기 위해서는 해충의 표피층을 투과한 후 작용점에 일정농도 이상으로 이르러야 한다(Tak & Isman, 2015). 따라서 camphor가 caryophyllene oxide의 협력제로 작용할 경우 진딧물 체내로 caryophyllene oxide의 투과성을 향상시킬 것이라고생각하였다. Camphor를 500 μg/mL 수준으로 단독처리할 경우 진딧물 체내에서 camphor는 검출한계 미만의 수준으로 분석되었다.
- 한편, camphor는 녹나무 추출물에 약 70%를 구성하고 있는 주요 성분이며 silica gel 칼럼을 이용한 정제에서 용출액의 성분 중 약 60%를 차지하고 있으나(Table 5) 진딧물에 대한 LC50 값은 1,000 μg/mL 이상으로 살충활성이 매우 낮았다(Table 7). 따라서 녹나무 추출물의 주요 살충성분은 LC50 값을 기준으로 볼 때 caryophyllene oxide로 판단되었다. 또한 녹나무 추출물에서 가장 높은 검출비율을 보인 camphor는 다른 성분들의 살충효능에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료되어 camphor와 다른 성분과의 혼합처리에 따른 살충효능을 시험하였다.
- 7배 높은 868 ng/adult와 477 ng/adult 수준으로 분석되었다. 또한 단독처리할 경우에 검출되지 않은 camphor는 caryophyllene oxide와 혼합처리할 경우 575 ng/adult와 377 ng/adult 수준으로 검출되었다. 이러한 결과는 camphor와 caryophyllene oxide가 상호간에 진딧물 체내로의 침투효과에 영향을 준다는 것을 의미하였다.
- 또한 혼합처리 48시간 후 borneol, 4-terpineol, α-terpineol, caryophyllene oxide의 LC50 값은 각각 556, 796, 492, 112 μg/mL 수준이었으며 각각의 화합물을 단독으로 처리하였을 경우의 LC50 값(Table 6)에 대비한 협력효과율은 화합물별로 각각 0.89, 0.85, 0.98, 2.15이었다(Table 7).
- 이는 단독 및 혼합처리에 따른 Table 6과 Table 7에서 보여준 결과와 높은 상관성을 가졌다. 본연구를 통해 camphor와 caryophyllene oxide는 상호간에 진딧물 체내로의 침투효과에 영향을 주고 있으며 진딧물에 대한 살충활성이 낮은 camphor는 caryophyllene oxide의 진딧물 체내에서 농도를 증가시켜 살충효능에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
- ×30 m)을 사용하였다. 분석조건은 injecter 온도가 250℃, interface 온도가 250℃, 이온화법은 전자충격법(electron impact, EI)로서 이온화 에너지는 70 eV이었다. Column 온도는 초기 40℃에서 2분간 유지한 다음 최종온도 250℃까지 분당 10℃씩 승온시키는 조건이었다.
- 살충효능이 90% 이상을 보인 혼합용매의 용출액을 GC/MS로 분석한 결과 검출된 성분과 검출비율은 camphor가 60.4%, borneol이 5.7%, 4-terpineol이 8.0%, α-terpineol이 11.0%, 그리고 caryophyllene oxide가 14.9%로서 Table 2에서 보여 준 결과와 유사하게 camphor가 가장 높게 검출되었다(Table 5).
- 상기 5가지 성분의 표준화합물을 이용하여 진딧물에 대한 LC50값을 처리 24시간 후에 조사한 결과 borneol, 4-terpineol, α-terpineol, caryophyllene oxide의 경우 각각 551, 915, 551, 237 μg/mL 수준이었으며 처리 48시간 후에 각각 498, 681, 484, 241 μg/mL 수준이었다(Table 6).
- 수증기증류법에 의한 추출물 경우 1,000 μg/mL 수준에서 96.1%의 살충효능을 보였으며 250μg/mL 수준에서 82.7%의 살충효능을 보였다.
- 진딧물에 대한 살충활성을 지닌 식물추출물을 선발하기 위해 분양받은 298개 시료를 대상으로 조사한 결과 Table 1과 같았다. 식물추출물 중 참나무과(Castanopsise chidnocarpa), 감나무과(Diospyros ehretioides), 원지과(Polygala oligosperma),천남성과(Amydrium hainanense), 그리고 국화과(Inula helenium L.) 식물에서 40~60% 수준의 살충효능이 관찰되었으며 다른 식물추출물들의 경우 20% 이하의 살충효능이 관찰되었다. 녹나무과(Cinnamomum camphora) 식물추출물은 살충효능이 62.
- 식물추출물의 살충효능 시험에서 녹나무 추출물이 가장 우수한 살충활성을 보였으며 이에 녹나무를 대상으로 살충활성물질을 구명하였다. 녹나무의 진딧물에 대한 살충활성은 수증기증류법에 의한 추출물이 용매침지법에 의한 추출물 보다 현저히 높았다(Fig.
- Caryophyllene oxide의 경우 camphor와 혼합하여 처리하였을 때 LC50 값이 2배 이상 감소하였다. 이러한 결과는 camphor가 다른 성분의 살충효능에 영향을 준다는 것을 의미하고 있으며, 특히 caryophyllene oxide의 협력제로서 작용한다는 것을 의미하였다. 식물추출물에 함유된 정유성분의 협력작용에 대한 연구로서 Wu (2017)등은 타임(Thyme) 잎에서 추출한 정유성분인 thymol과 terpinene, linalool 등을 혼합하여 처리하면 카민잎응애(Tetranychus cinnabarinus)에 대해 살충활성이 향상된다고 보고하였다.
- 또한 단독처리할 경우에 검출되지 않은 camphor는 caryophyllene oxide와 혼합처리할 경우 575 ng/adult와 377 ng/adult 수준으로 검출되었다. 이러한 결과는 camphor와 caryophyllene oxide가 상호간에 진딧물 체내로의 침투효과에 영향을 준다는 것을 의미하였다. Tak(2015) 등은 로즈마리 에센셜 오일을 이용한 살충효능 시험에서 함량비율이 높은 1,8-cineole이 camphor의 협력제로 작용하여 밤무늬나방 유충에 대해 살충효능을 향상시킨다고 보고하였다(Table 8).
- 46% 수준으로서 camphor가 가장 높았다. 이러한 결과는 녹나무 추출물의 진딧물에 대한 살충활성이 camphor를 포함한 7가지 성분과 깊은 연관성이 있다는 것을 의미하였다. 이를 구명하기 위해 추출물을 대상으로 칼럼크로마토그래피를 수행하여 성분을 분리하였다.
- , 1993). 이러한 결과를 통해 녹나무 추출물의 복숭아혹진딧물에 대한 살충효능은 주로 caryophyllene oxide에 의해 결정되는 것으로 판단되었다. 한편, camphor는 녹나무 추출물에 약 70%를 구성하고 있는 주요 성분이며 silica gel 칼럼을 이용한 정제에서 용출액의 성분 중 약 60%를 차지하고 있으나(Table 5) 진딧물에 대한 LC50 값은 1,000 μg/mL 이상으로 살충활성이 매우 낮았다(Table 7).
- 상기 5가지 성분의 표준화합물을 이용하여 진딧물에 대한 LC50값을 처리 24시간 후에 조사한 결과 borneol, 4-terpineol, α-terpineol, caryophyllene oxide의 경우 각각 551, 915, 551, 237 μg/mL 수준이었으며 처리 48시간 후에 각각 498, 681, 484, 241 μg/mL 수준이었다(Table 6). 화합물 중 caryophyllene oxide는 다른 화합물에 비해 약 2~3배 높은 살충활성을 보였다. Caryophyllene oxide는 bicyclic sesquiterpene류 화합물로 허브식물에 주로 함유되어 있으며 해충의 sodium channel modulator로서 신경독성을 갖는다고 알려져 있으며 쌀바구미(sitophilu zeamais)와 쌀도둑거저리(tribolium castaneum) 등의 해충에 대한 살충효능이 있다고 알려져 있다(Bettarini et al.
후속연구
- 이와 같이 잔류농약의 기준이 강화됨에 따라 향후 농민들은 농산물의 재배와 생산과정에서 농약을 사용하고자 할 때 잔류농약에 대한 안전성을 더욱 신중하게 고려해야 하며, 이에 따라 합성농약의 사용을 절제해야 할 필요성을 더욱 강하게 인식할 것으로 생각된다. 그러므로 농산물 중 잔류농약의 안전성을 확보하기 위해서는 합성농약의 사용을 줄이는 기술을 개발하기 위한 다양한 연구가 필요하다.
- 또한 상기 식물추출물 제제는 국내에서 생산이 되지 않아 해외에서 수입된 원료를 사용하고 있어 농가에 경제적 측면에서 부담이 되고 있다. 따라서 농산물의 잔류농약에 대한 안전성을 갖기 위해 재배과정 중 농약의 사용을 줄일 수 있는 대안으로 국내에서 쉽게 공급이 가능한 식물추출물의 다양한 살충성분을 탐색하는 연구가 필요하다. 본 연구에서는 상기와 같은 배경을 기반으로 복숭아혹진딧물을 방제하기 위해 사용될 수 있는 천연식물 추출물을 탐색하기 위해 국내에서 자생하는 식물추출물을 대상으로 살충효능을 시험하여 향후 새로운 살충제 개발을 위한 선도물질을 제시하고자 하였다.
- , 2016). 따라서 친환경농업에서 안전한 농산물을 생산하기 위해 합성농약의 대안으로 사용할 수 있는 병해충 방제용 농자재의 개발에 관한 연구가 필요하다.
- , 1998). 따라서 화학농약의 사용을 줄이면서 진딧물을 효율적으로 방제할 수 있는 다양한 살충소재를 탐색하고 이를 기반으로 진딧물 방제용 제제를 개발하는 연구가 필요하다.
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