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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 선복화, 작약 열수 추출물 복합물인 HT074와 그 구성 약재의 항산화능을 확인하고, 염산/에탄올의 투여로 인한 위점막 손상에 대한 HT074의 위점막 보호 효과와 항산화 효소의 활성, 위점액 분비 관련 유전자 발현을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 분석기기는 Waters 1525 binary pump, Waters 2707 autosampler, Waters 2998 PDA detector가 장착된 Waters instrument (Milford, MA, USA)를 사용하였으며 Sunfire™ C18 column (5 mm; 250 x 4.6 mm; Waters, USA)으로 분석을 실시하였다.
- britannica)는 대우약업사(Seoul, Korea), 제성약업사(Seoul, Korea)에서 구입하여 경희대학교 한의과대학 본초학교실에서 검증하여 제조에 사용하였다. 각각의 약재를 10배수의 증류수로 100℃에서 3시간 동안 2회 환류 추출하고, 여과를 용이하게 하기 위해 작약추출액에 amylase 효소를 처리한 후 효소 실활시켰다. 그 후 각각의 추출액을 여과하고 감압농축한 후 dextrin을 혼합해 분무 건조하였다.
- 그 후 각각의 추출액을 여과하고 감압농축한 후 dextrin을 혼합해 분무 건조하였다. 분무 건조가 끝난 작약, 선복화 추출물을 dextrin을 제외한 중량비가 1:1이 되도록 53:47의 중량비로 혼합하여 HT074를 제조하였다. 본 실험에 사용된 HT074는 MSC (Yangsan, Korea)에서 제조하였으며, paeoniflorin 21.
- HT074의 지표성분인 paeoniflorin과 1-O - acetylbritannilactone의 함량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석기기는 Waters 1525 binary pump, Waters 2707 autosampler, Waters 2998 PDA detector가 장착된 Waters instrument (Milford, MA, USA)를 사용하였으며 Sunfire™ C18 column (5 mm; 250 x 4.
- 1% 인산 수용액(phosphoric acid,A)과 아세토나이트릴(acetonitrile, B)이었다. 용매의 기울기는 0-15-40-45-50-55분, 용매 B 20-20-70-70-20-20%, 유속 1.0 ml/min으로 분석하였으며, paeoniflorin과 1-O - acerylbritannilactone 각각 235 nm, 210 nm에서 측정하였다.
- 시료를 증류수에 녹여 농도별로 희석한 후 시료 10 µl와 working solution 190 µl를 첨가하여 암실에서 5분간 반응시킨 후 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- paraffin에 포매된 조직은 microtome (Leica RM2235, Leica Biosystems, Germany)을이용해 5 µm 두께로 절편을 제작한 후 hematoxyline과 eosin(H&E)으로 염색하여 광학현미경(Nikon ECLipse Ci, Japan)으로 관찰하였다.
- 실험실 환경에서 적응시킨 흰쥐를 무작위로 대조군, 양성대조군(omeprazole (OMP) 20 mg/kg),HT074 100 mg/kg 투여군, HT074 300mgkg 투여군으로 나누었다.
- 각 군당 실험동물의 수는 6-10마리로 하였다. 실험동물은 물 또는 시료를 1일 2회씩 총 14일간 경구투여하였으며 투여액량은 10 ml/kg으로 하였다. 실험은 한의과학연구소(KISTEM)의 동물실험윤리위원회에 의해 승인을 받은 후 규정에 따라 실행되었다(KISTEM-IACUC-005).
- 실험 마지막 날 실험동물을 24시간 동안 절식시켰고, 마지막 시료 투여 1시간 뒤 150 mM HCl을 함유하는 60% ethanol solution (HCl/EtOH) 1.5 ㎖을 경구투여하여 위점막 손상을 유발하였다. HCl/EtOH 투여 1시간 뒤 흰쥐를 아이소플로란으로 마취하여 위를 적출하였고, 적출한 위의 위저부를 따라 절개한 후 식염수로 세척하여 핀으로 고정한 뒤 위의 손상 정도를 촬영하였다.
- 5 ㎖을 경구투여하여 위점막 손상을 유발하였다. HCl/EtOH 투여 1시간 뒤 흰쥐를 아이소플로란으로 마취하여 위를 적출하였고, 적출한 위의 위저부를 따라 절개한 후 식염수로 세척하여 핀으로 고정한 뒤 위의 손상 정도를 촬영하였다. 촬영이 끝난 동물의 위조직은 항산화 효소 활성 및 mucin 5AC (MUC5AC) mRNA 발현 측정을 위해-80℃에서 보관하였다.
- 촬영이 끝난 동물의 위조직은 항산화 효소 활성 및 mucin 5AC (MUC5AC) mRNA 발현 측정을 위해-80℃에서 보관하였다. 촬영한 사진은 Image J(National Institutes of Health, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 위 손상 면적(gastric lesion area, GLA)을 측정하였다. 위 손상지수(gastric lesion index, GLI)와 위점막 보호율(gastric protection rate)은 다음의 식으로 계산하였다.
- 위조직을 광학현미경으로 관찰하기 위해 각 군의 위조직을 10% paraformaldehyde (PFA) solution에 고정한 후 80, 90,95, 100% EtOH에 순차적으로 담궈 탈수하고 xylene으로 헹군 후 paraffin으로 포매하였다. paraffin에 포매된 조직은 microtome (Leica RM2235, Leica Biosystems, Germany)을이용해 5 µm 두께로 절편을 제작한 후 hematoxyline과 eosin(H&E)으로 염색하여 광학현미경(Nikon ECLipse Ci, Japan)으로 관찰하였다.
- 4) 1 ml을 넣어 homogenizer(TissueLyser LT, Qiagen, USA)로 균질화한 후 균질액을 4℃, 4,000 rpm에서 4분간 원심분리한 다음, 상층액을 두 개로나누어 취하였다. 하나는 SOD assay kit (Cayman, USA)를이용하여 제조사의 프로토콜을 따라 SOD 활성을 측정하였고, 다른 하나는 4℃, 10,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상층액을 취한 후 CAT assay kit (Cayman, USA)와 GSH assay kit (Cayman, USA)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 CAT,GSH 농도를 측정하였다.
- 적출한 실험동물의 위조직을 액체질소에서 분쇄한 후 약 100 mg을 QiAzol lysis reagent (Invitrogen Technologies,Waltham, MA, USA)로 제조사의 protocol을 따라 totalRNA을 추출하였다. 추출한 total RNA는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용해 cDNA로 합성한 다음 Step-OnePlus RT-PCR System (Applied Biosystems, USA)으로 MUC5AC mRNA 발현을 측정하였다.
- 본 연구에서는 HT074와 그 구성 약재인 작약 추출물, 선복화 추출물의 항산화 효능을 DPPH, ABTS radical 소거능을 측정하여 평가하고, HT074를 2주간 투여하였을 때 HCl/EtOH로 유도되는 위점막 손상에 대한 보호 효과와 항산화 효소 활성, 위점액 분비 관련 유전자 발현의 변화를 확인하였다.
- 에탄올은 위점막을 직접 자극하고 위점막을 쉽게 통과하여 점막하층에 부종을 유발시킴으로써 일시적 허혈로 인한 세포 괴사를 유발하며34-5), HCl은 위장 운동을 항진시켜36-7) 위염 및 위궤양을 유발하기 때문에 재현성이 뛰어나 항위염, 항위궤양 효능을 확인하기 위한 동물실험에서 일반적으로 사용된다38-9). 본 실험에서 염산 에탄올의 투여군은 점막 상피의 파괴, 점막하층의 부종, 백혈구 침윤 등을 동반한 급성 위점막 손상을 일으켰다. 그러나 HT074 투여군에서는 뚜렷한 조직학적 병변이 관찰되지 않았으며 대조군 대비 위점막 손상이 유의하게 감소되었다.
- 본 연구에서는 HT074의 위점막 보호 효과를 평가하기 위해선복화 추출물, 작약 추출물, HT074의 DPPH, ABTS 항산화 활성을 확인하고, HT074를 2주간 투여 후 HCl/EtOH 유도 흰쥐 위점막 손상 모델에서 위손상면적, 위손상지수와 항산화 효소의 변화, 위점액 관련 유전자 발현을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 추출한 total RNA는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용해 cDNA로 합성한 다음 Step-OnePlus RT-PCR System (Applied Biosystems, USA)으로 MUC5AC mRNA 발현을 측정하였다.
대상 데이터
- 작약(roots of P. lactiflora), 선복화(flowers of I. britannica)는 대우약업사(Seoul, Korea), 제성약업사(Seoul, Korea)에서 구입하여 경희대학교 한의과대학 본초학교실에서 검증하여 제조에 사용하였다. 각각의 약재를 10배수의 증류수로 100℃에서 3시간 동안 2회 환류 추출하고, 여과를 용이하게 하기 위해 작약추출액에 amylase 효소를 처리한 후 효소 실활시켰다.
- 분무 건조가 끝난 작약, 선복화 추출물을 dextrin을 제외한 중량비가 1:1이 되도록 53:47의 중량비로 혼합하여 HT074를 제조하였다. 본 실험에 사용된 HT074는 MSC (Yangsan, Korea)에서 제조하였으며, paeoniflorin 21.0-31.6 mg/g, 1-O -acetylbritannilactone1.50-2.26 mg/g으로 표준화하였다.
- 양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- 체중 180-210g, 6주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 샘타코(Ansan, Korea)에서 공급받아 7일간 적응시켜 사용하였다. 사육 환경은 온도 23±1℃, 상대습도 55±5%, 조명시간 12시간으로 유지하였다.
- 실험실 환경에서 적응시킨 흰쥐를 무작위로 대조군, 양성대조군(omeprazole (OMP) 20 mg/kg),HT074 100 mg/kg 투여군, HT074 300mgkg 투여군으로 나누었다. 각 군당 실험동물의 수는 6-10마리로 하였다. 실험동물은 물 또는 시료를 1일 2회씩 총 14일간 경구투여하였으며 투여액량은 10 ml/kg으로 하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 표시하였으며, 각 군간 평균의 차이는 Graphpad prism 5 (Graphpad Software Inc.,San Diego, CA, USA)을 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 Dunnett's multiple comparison test로 사후검정을 실시하여 p < 0.05 일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- DPPH radical 소거 활성은 Sharma et al.(2009)의 방법을 이용하여 측정하였다29). 시료를 에탄올에 녹여 농도별로 희석한 후 시료 100 µl와 0.
- ABTS radical 소거 활성은 Huang et al.(2005)의 방법을 이용하여 측정하였다29). 7.
- 추출한 total RNA는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용해 cDNA로 합성한 다음 Step-OnePlus RT-PCR System (Applied Biosystems, USA)으로 MUC5AC mRNA 발현을 측정하였다. 반응에 사용한 primer는 Table 2와 같으며 결과는 GAPDH를 이용하여 정규화하였고 delta-delta 방법으로 상대정량 하였다.
성능/효과
- HT074 300군의 gastric lesion area 와 gastric lesion index는 각각 24.19±7.63 mm2, 2.42±0.71이었으며, HCl/EtOH에 의한 위점막 손상을 대조군 대비 66.05% 억제하였다(p < 0.05).
- 대조군의 gastric lesion area와 gastric lesion index는 각각 71.25±13.49 mm2, 7.68±1.5이였으며, 양성대조군인 OMP 20군은 각각 0.82±0.62 mm2, 0.08±0.06으로 HCl/EtOH에 의한 위점막 손상을 대조군 대비 99.85% 억제하였다(p < 0.001).
- 작약 추출물, 선복화 추출물, HT074의 DPPH radical 소거능은 1000 µg/ml에서 각각 89%, 77%, 94%의 억제율을 보였고, ABTS radical 소거능은 2000 µg/ml에서 각각 89%, 97%, 99%의 억제율을 보였다(Figure 2).
- 작약추출물, 선복화 추출물, HT074의 DPPH radical 소거능의 IC50은 각각 95.0 µg/ml, 608.7 μg/ml, 194.4 µg/ml 이었으며, ABTS radical 소거능의 IC50은 422.7 µg/ml, 218.52µg/ml, 353.2 µg/ml로 나타났다.
- 시료들의 항산화 효능을 평가하기 위하여 DPPH와 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 양성대조군인 L-ascorbic acid의 IC50은 각각 7.5 µg/ml, 33.8 µg/ml으로 나타났다.
- HT074의 HPLC 크로마토그램은 Figure 1에 나타내었다. 작약의 지표성분인 paeoniflorin의 함량은 27.55 mg/g, 선복화의 지표성분인 1-O -acetylbritannilactone의 함량은 1.88 mg/g으로 나타났다.
- HT074의 경구투여가 HCl/EtOH 유도 위점막 손상 흰쥐 위조직의 SOD 활성과 CAT, GSH 함량에 미치는 영향을 측정한 결과, SOD 활성은 HT074 300군과 OMP 20군에서 대조군 대비 유의하게 증가하였고(각각, p < 0.05, p < 0.001),GSH 함량은 HT074 100, 300군과 OMP 20군에서 대조군 대비 유의하게 증가하였다(각각, p < 0.01, p < 0.05, p < 0.001).
- 위조직에서 위 점액 분비와 관련된 유전자인 MUC5AC mRNA 발현 변화량을 real-time qPCR을 이용하여 측정한 결과, HT074 100, 300군에서 대조군 대비 유의하게 위조직 MUC5AC mRNA 발현이 유의하게 증가하였다 (p < 0.001, p < 0.01).
- 시료들의 항산화 효능을 평가하기 위하여 DPPH와 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, DPPH radical 소거능은 작약추출물이, ABTS radical 소거능은 선복화 추출물이 높게 나타났으며 HT074는 DPPH, ABTS 모두 높은 radical 소거능을 나타냈다. 위염과 위궤양의 발병과정에 ROS와 free radical에 의한 산화적 스트레스가 중요하게 관계하고 있음은 인체와 동물실험에서 충분히 연구되어 있다30-31).
- 본 실험결과는 작약에 함유되어 있는 paeonol과 그 유도체 성분들이 DPPH radical 소거능을 증가시키고32), 선복화에 함유된 patuletin,luteolin, isorhamnetin 3-glucoside 등의 flavonoid 성분이 DPPH radical 소거능을 증가시킨다33)는 기존 보고와 일치한다. 따라서 HT074가 DPPH, ABTS radical 소거를 통한 항산화 활성이 있음을 확인하였으며, 이러한 항산화 효능은산화적 손상으로 인한 위점막의 손상을 억제하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
- HT074 2주간 경구투여는 HCl/EtOH에 의한 위점막 손상을 농도의존적으로 억제하였으며 300 ㎎/㎏ 투여군에서 유의한 위점막 보호 효과를 나타내었다. 에탄올은 위점막을 직접 자극하고 위점막을 쉽게 통과하여 점막하층에 부종을 유발시킴으로써 일시적 허혈로 인한 세포 괴사를 유발하며34-5), HCl은 위장 운동을 항진시켜36-7) 위염 및 위궤양을 유발하기 때문에 재현성이 뛰어나 항위염, 항위궤양 효능을 확인하기 위한 동물실험에서 일반적으로 사용된다38-9).
- 본 실험에서 염산 에탄올의 투여군은 점막 상피의 파괴, 점막하층의 부종, 백혈구 침윤 등을 동반한 급성 위점막 손상을 일으켰다. 그러나 HT074 투여군에서는 뚜렷한 조직학적 병변이 관찰되지 않았으며 대조군 대비 위점막 손상이 유의하게 감소되었다. 이러한 결과는 HT074 전처리가 HCl/EtOH에 의한 위점막 손상에 대해 보호작용을 하는 것을 의미한다.
- 본 연구에서 HT074 2주간 경구투여는 흰쥐의 위점막 조직에서 SOD 활성과 GSH 함량을 대조군 대비 유의하게 증가시켰다. 에탄올은 인체에서 대사되면서 superoxide anion과 hydroperoxy free radicals 등을 방출시키기 때문에 에탄올에 의한 위점막 손상에 free radical에 의한 산화적 스트레스가 관여한다고 보고되어 있다40).
- GSH는 세포내 ROS와H2O2, 과산화지질 등 독성 물질을 전이, 분해, 이물질의 포합형성 등에 사용되는 물질로 GSH의 함량을 증가시키면 독성물질에 대한 방어 효과가 증강되는 것으로 보고되어 있다47-9). 본 실험의 결과는 HT074 전처리가 항산화 효소 활성과GSH 함량을 증가시켜 HCl/EtOH에 의한 산화적 스트레스로부터 위점막을 보호하는 것을 의미한다.
- MUC5AC 유전자는 점막 상피 표면에 MUC5ACmucin을 합성하여 부착시킨다52). 본 실험의 결과는 HT074가 위점막 상피에서 MUC5AC 유전자 발현을 증가시켜 위점액 분비시킴으로써 위점막을 보호하는 것을 의미한다.
- 1. HT074는 농도의존적으로 DPPH, ABTS radical 소거 능을 나타내었다. 이는 HT074의 항산화 활성이 산화적손상으로부터 조직을 보호하는데 도움을 줄 수 있음을 의미한다.
- 2. HCl/EtOH 유도 위점막 손상 모델에서 HT074는 위손상면적, 위손상지수를 대조군 대비 농도 의존적으로 감소시켰으며, 이는 HT074 투여가 HCl/EtOH에 의한 손상으로부터 위점막을 보호하는 것으로 의미한다.
- 3. HT074는 위점막 조직의 SOD 활성, GSH 함량을 대조군 대비 유의하게 증가시켰으며, 이는 HT074가 HCl/EtOH로 인한 산화적 스트레스로부터 위점막의 손상을 억제하는 것을 의미한다.
- 4. HT074는 위점막 조직에서 mucin 단백질 합성에 관여하는 MUC5AC 유전자 발현을 대조군 대비 유의하게 증가시켰으며, 이는 HT074가 위점막 표면에서 위점액 분비를 증가시켜 위점막을 보호하는 것을 의미한다.
후속연구
- 이상의 결과로 보아 HT074가 위점막에서 항산화 효소와GSH 함량을 증가시키고 MUC5AC 유전자 발현을 증가시켜 위점막의 공격인자인 HCl/EtOH에 의한 산화적 스트레스로부터 위점막을 보호하는데 도움을 주며, 위염 및 위궤양의 예방 및 치료에 효과적인 후보소재로 활용될 수 있다고 생각된다.
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