AtCYP78A7 과발현 환경스트레스 내성 형질전환 벼의 단백질 진단 키트 개발 Development of a Kit for Diagnosing AtCYP78A7 Protein in Abiotic-tolerant Transgenic Rice Overexpressing AtCYP78A7원문보기
본 연구는 시토크롬P450 단백질을 암호화하는 애기장대 유래의 AtCYP78A7을 과발현하는 형질전환 식물체로부터 AtCYP78A7 단백질을 특이적으로 인식하는 단일큰론 항체의 제조와 그 항체를 AtCYP78A7 단백질과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 AtCYP78A7 단백질을 효소면역학적(ELISA) 방법으로 검출하는 진단 키트를 개발하기 위하여 수행하였다. 재조합한 GST-AtCYP78A7 단백질을 항원으로 사용하여 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주를 제조한 후 비오틴화 및 페어링 테스트를 통해 포획항체와 검출항체를 선정하였으며, GST-AtCYP78A7 정제 단백질을 기준으로 일품벼, 화영벼, AtCYP78A7 과발현 벼(10B-5, 18A-4)의 용해물을 검출항원으로 사용하여 product test를 진행하였다. 그 결과 AtCYP78A7 단백질에 특이적으로 결합하는 4개의 단클론 항체(mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8)를 생산하였고, 포획항체 mAb 4C2와 검출항체 mAb 7E8-biotin의 조합으로 ELISA 키트를 개발하였다. 개발된 ELISA 키트를 이용한 벼 시료의 분석 결과 AtCYP78A7 과발현 벼는 전체 단백질 대비 AtCYP78A7 단백질의 비율이 0.1% 이상인 양성으로, 일품벼와 화영벼는 0.1% 미만인 음성으로 나타나 키트를 이용한 AtCYP78A7 단백질의 검출이 가능하였으며, 따라서 본 키트는 향후 AtCYP78A7를 과발현하는 형질전환 작물을 대상으로 하는 환경 모니터링 또는 인체 위해성 평가에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구는 시토크롬 P450 단백질을 암호화하는 애기장대 유래의 AtCYP78A7을 과발현하는 형질전환 식물체로부터 AtCYP78A7 단백질을 특이적으로 인식하는 단일큰론 항체의 제조와 그 항체를 AtCYP78A7 단백질과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 AtCYP78A7 단백질을 효소면역학적(ELISA) 방법으로 검출하는 진단 키트를 개발하기 위하여 수행하였다. 재조합한 GST-AtCYP78A7 단백질을 항원으로 사용하여 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주를 제조한 후 비오틴화 및 페어링 테스트를 통해 포획항체와 검출항체를 선정하였으며, GST-AtCYP78A7 정제 단백질을 기준으로 일품벼, 화영벼, AtCYP78A7 과발현 벼(10B-5, 18A-4)의 용해물을 검출항원으로 사용하여 product test를 진행하였다. 그 결과 AtCYP78A7 단백질에 특이적으로 결합하는 4개의 단클론 항체(mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8)를 생산하였고, 포획항체 mAb 4C2와 검출항체 mAb 7E8-biotin의 조합으로 ELISA 키트를 개발하였다. 개발된 ELISA 키트를 이용한 벼 시료의 분석 결과 AtCYP78A7 과발현 벼는 전체 단백질 대비 AtCYP78A7 단백질의 비율이 0.1% 이상인 양성으로, 일품벼와 화영벼는 0.1% 미만인 음성으로 나타나 키트를 이용한 AtCYP78A7 단백질의 검출이 가능하였으며, 따라서 본 키트는 향후 AtCYP78A7를 과발현하는 형질전환 작물을 대상으로 하는 환경 모니터링 또는 인체 위해성 평가에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
Quantitative determination of the protein expression levels is one of the most important parts in assessment of the safety of foods derived from genetically modified (GM) crops. Overexpression of AtCYP78A7, a gene encoding cytochrome P450 protein, has been reported to improve tolerance to abiotic st...
Quantitative determination of the protein expression levels is one of the most important parts in assessment of the safety of foods derived from genetically modified (GM) crops. Overexpression of AtCYP78A7, a gene encoding cytochrome P450 protein, has been reported to improve tolerance to abiotic stress, such as drought and salt stress, in transgenic rice (Oryza sativa L.). In the present study, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit for diagnosing AtCYP78A7 protein including AtCYP78A7-specific monoclonal antibody was developed. GST-AtCYP78A7 recombinant protein was induced and purified by affinity column. Four monoclonal antibodies (mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, and mAb 7E8) against recombinant protein were also produced and biotinylated with avidin-HRP. After pairing test using GST-AtCYP78A7 protein and lysate of rice samples, mAb 4C2 and mAb 7E8 were selected as a capture antibody and a detecting antibody, respectively, for ELISA kit. Product test using rice samples indicated that percentages of detected protein in total protein were greater than 0.1% in AtCYP78A7-overexpressing transgenic rice (Line 10B-5 and 18A-4), whereas those in negative control non-transgenic rice (Ilpum and Hwayoung) were less than 0.1%. The ELISA kit developed in this study can be useful for the rapid detection and safety assessment of transgenic rice overexpressing AtCYP78A7.
Quantitative determination of the protein expression levels is one of the most important parts in assessment of the safety of foods derived from genetically modified (GM) crops. Overexpression of AtCYP78A7, a gene encoding cytochrome P450 protein, has been reported to improve tolerance to abiotic stress, such as drought and salt stress, in transgenic rice (Oryza sativa L.). In the present study, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit for diagnosing AtCYP78A7 protein including AtCYP78A7-specific monoclonal antibody was developed. GST-AtCYP78A7 recombinant protein was induced and purified by affinity column. Four monoclonal antibodies (mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, and mAb 7E8) against recombinant protein were also produced and biotinylated with avidin-HRP. After pairing test using GST-AtCYP78A7 protein and lysate of rice samples, mAb 4C2 and mAb 7E8 were selected as a capture antibody and a detecting antibody, respectively, for ELISA kit. Product test using rice samples indicated that percentages of detected protein in total protein were greater than 0.1% in AtCYP78A7-overexpressing transgenic rice (Line 10B-5 and 18A-4), whereas those in negative control non-transgenic rice (Ilpum and Hwayoung) were less than 0.1%. The ELISA kit developed in this study can be useful for the rapid detection and safety assessment of transgenic rice overexpressing AtCYP78A7.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구는 시토크롬 P450 CYP78A 유전자의 서브패밀리의 일종인 애기장대 유래의 AtCYP78A7을 과발현하는 형질전환 식물체로부터 AtCYP78A7 단백질을 특이적으로 인식하는 단일큰론 항체의 제조와 그 항체를 AtCYP78A7 단백질과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 AtCYP78A7 단백질을 면역학적으로 검출하는 방법을 개발하는 것을 목적으로 하였다. 새롭게 개발된 GM 작물이 식품으로 승인받기 위해서는 안전성 평가를 거쳐야 하며, 그 중 도입유전자 산물인 재조합 단백질은 잠재적인 알레르기성 및 독성 평가와 함께 발현정도에 대한 분석이 요구되고 있다.
본 연구는 시토크롬 P450을 암호화하는 AtCYP78A7 유전자를 과발현하는 환경스트레스 내성 GM 작물의 검출 및 위해성 평가에 유용하게 사용하고자 AtCYP78A7 특이적 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb)를 포함하는 AtCYP78A7 단백질 진단 키트를 개발하기 위하여 수행하였으며, 키트의 검출 성능은 AtCYP78A7 과발현 벼 2 계통(10B-5, 18A-4)과 그 모본인 화영벼, 그리고 일반 재배품종인 일품벼를 이용하여 검증하였다.
제안 방법
IP 반응이 있는 4개의 클론(#4C2, #6A7, #7E8, #11H6)에대한 클로닝을 진행한 후 ELISA를 진행하여 ELISA 결과가 양성인 well 중에서 세포수가 가장 적거나 하나만 있는 well을 선별하여 클로닝을 진행하였으며 세포가 들어있는 모든 well에서 ELISA 결과가 양성일 때 단일클론이 완성된 것으로 보고 클로닝을 종료하였다.
pGEX-4T-1-AtCYP78A7이 도입된 대장균 600 nm에서 0.6의 Optical Density (OD) value를 얻을 때까지 액체배지에 배양한 후 1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (ITPG)로 5시간 동안 37℃에서 배양함으로써 GST-AtCYP78A7 단백질의 과발현을 유도하였다.
5 μg/ml의 농도로 사용하였고, pAb #1, pAb #2, mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8을 포획항체로, biotylation 된 pAb #1, pAb #2, mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8을 검출항체로 사용하여 조합을 선정하였다. 그 후 AtCYP78A7 과발현 벼 2 계통(10B-5, 18A-4), 화영벼 및 일품벼의 용해물을 PBS 상태로 버퍼 교환하여 항원으로 사용하고, mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6를 포획 항체로 biotylation 된 pAb #2, mAb 7E8을 검출항체로 사용하여 최적 조합을 선정하였다.
6의 Optical Density (OD) value를 얻을 때까지 액체배지에 배양한 후 1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (ITPG)로 5시간 동안 37℃에서 배양함으로써 GST-AtCYP78A7 단백질의 과발현을 유도하였다. 발현이 확인된 세포는 초음파로 파쇄하고 GST affinity column을 사용해 GST-AtCYP78A7 단백질을 분리 정제한 후 12% SDS-PAGE로 분리하여 Coomassie blue 염색으로 그 크기를 확인하였다.
본 연구에서는 AtCYP78A7 단백질에 특이적으로 결합하는 4개의 단클론 항체(mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8)를 생산하였고, 비오틴화 및 페어링 테스트를 통해 선발된 포획항체 mAb 4C2와 검출항체 mAb 7E8-biotin의 조합으로 ELISA 키트를 개발하였다. 개발된 ELISA 키트를 이용한 벼시료의 분석 결과 AtCYP78A7 과발현 벼는 전체 단백질 대비 AtCYP78A7 단백질의 비율이 0.
분리 정제된 단일클론 항체를 이용하여 비오틴화(biotinylation) 및 페어링 테스트(pairing test)를 한 후 포획항체 (capture antibody)와 검출항체(detector antibody)를 선정하였으며, GST-AtCYP78A7 정제 단백질을 기준(standard)으로 일품벼, 화영벼, AtCYP78A7 과발현 벼(10B-5, 18A-4)의 용해물(lysate)을 검출 항원으로 사용하여 product test를 진행하였다.
2회 면역후 항체의 역가(1:5,000)가 적정하게 증가하여 면역된 마우스에서 비장을 떼어내어 B 림프구를 분리한 다음, 배양한 골수종 세포(sp2/0)와 융합시켰다. 융합된 세포를 히포잔틴(hypoxanthin), 아미노프테린(aminopterine) 및 티미딘(thymidine)이 첨가되어 있는 HAT 배지에서 배양한 후 골수종과 B 림프구만이 융합된 융합세포(hybridoma)를 선택적으로 배양하였다. 얻어진 융합세포 중에서 항원과 반응하는 항체를 생산하는 세포를 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다.
융합을 진행한 후 융합된 세포들이 GST-AtCYP78A7 단백질에 반응하는 항체를 분비하는지 확인하기 위하여 ELISA 테스트를 실시하였고, 그 결과 GST-AtCYP78A7 단백질과 반응 하는 19개의 클론을 확인하였다(Table 1).
재조합한 GST-AtCYP78A7 단백질을 항원으로 사용하여 4종의 단클론 항체를 개발하였으며, 개발된 항체의 항원과의 반응을 간접적 ELISA로 확인하였다(Table 2). 또한 각 클론에 대한 Immunoglubin 이소타입(isotype)을 확인한 결과 항-AtCYP78A7 #4C2, #6A7, #7E8, #11H6는 각각 IgG2a, IgG1, IgG2b, IgG2b 이었다(Table 3).
재조합한 GST-AtCYP78A7 단백질을 항원으로 사용하여 항체를 생산하였다. 항원을 마우스(BALD/c)에 보조항원(adjuvant, Sigma)과 혼합하여 주사하고 마우스의 혈액을 채취하여 항체 생성여부를 ELISA 방법으로 확인하였다.
AtCYP78A7 재조합 단백질은 Nam 등(2018)과 동일한 방법으로 제조하였다. 즉 AtCYP78A7 DNA를 pGEX-4T-1 벡터와 접합하여 pGEX-4T-1-AtCYP78A7을 합성한 다음 클로닝된 플라스미드를 대장균 BL-21 (DE3) RIPL에 도입시켰다. pGEX-4T-1-AtCYP78A7이 도입된 대장균 600 nm에서 0.
Product test는 GST-AtCYP78A7 정제 단백질을 standard로 사용하고 일품벼, 화영벼, AtCYP78A7 과발현 벼(10B-5, 18A-4)의 용해물을 검출항원으로 PBS 상태로 버퍼 교환하여 사용하였으며, 포획항체는 1:200으로 희석한 mAb 4C2, 검출 항체는 1:400으로 희석한 biotylation 된 mAb 7E8을 사용하였다. 측정된 OD 값을 기준으로 4 파라미터 피트(four-parameter fit) 방식을 이용하여 기준곡선과 농도를 계산한 후, 각 측정값을 총 단백질에서의 비율로 환산하여 각 시료의 용해물에 존재하는 검출 단백질 양을 확인하였다.
재조합한 GST-AtCYP78A7 단백질을 항원으로 사용하여 항체를 생산하였다. 항원을 마우스(BALD/c)에 보조항원(adjuvant, Sigma)과 혼합하여 주사하고 마우스의 혈액을 채취하여 항체 생성여부를 ELISA 방법으로 확인하였다. 2회 면역후 항체의 역가(1:5,000)가 적정하게 증가하여 면역된 마우스에서 비장을 떼어내어 B 림프구를 분리한 다음, 배양한 골수종 세포(sp2/0)와 융합시켰다.
대상 데이터
Product test는 GST-AtCYP78A7 정제 단백질을 standard로 사용하고 일품벼, 화영벼, AtCYP78A7 과발현 벼(10B-5, 18A-4)의 용해물을 검출항원으로 PBS 상태로 버퍼 교환하여 사용하였으며, 포획항체는 1:200으로 희석한 mAb 4C2, 검출 항체는 1:400으로 희석한 biotylation 된 mAb 7E8을 사용하였다. 측정된 OD 값을 기준으로 4 파라미터 피트(four-parameter fit) 방식을 이용하여 기준곡선과 농도를 계산한 후, 각 측정값을 총 단백질에서의 비율로 환산하여 각 시료의 용해물에 존재하는 검출 단백질 양을 확인하였다.
도입 단백질의 발현 분석은 일반적으로 ELISA 분석법을 통해 정량분석이 수행되며, Western blot과 Immuno-strip 등을 통해 정성분석이 수행 되고 있다[3, 14, 19]. 특히 단백질의 발현량은 환경조건에 따라 다를 수 있기 때문에 단백질의 정량분석을 위한 시료는 복수 년차 및 복수지역에서 재배된 GM 작물을 대상으로 하며, 발현 부위 및 발현시기와 관련하여 식물체의 다양한 부위에서 생장 시기별로 준비한다[7, 18]. 따라서 단시간에 많은 양의 시료를 동시에 분석할 수 있는 ELISA 방법은 단백질의 발현량 분석에서 가장 흔히 사용되고 있는 방법이다.
페어링 테스트의 경우 항원으로는 정제된 GST-AtCYP78A7 단백질을 0.1 μg/ml과 0.5 μg/ml의 농도로 사용하였고, pAb #1, pAb #2, mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8을 포획항체로, biotylation 된 pAb #1, pAb #2, mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8을 검출항체로 사용하여 조합을 선정하였다.
이론/모형
융합된 세포를 히포잔틴(hypoxanthin), 아미노프테린(aminopterine) 및 티미딘(thymidine)이 첨가되어 있는 HAT 배지에서 배양한 후 골수종과 B 림프구만이 융합된 융합세포(hybridoma)를 선택적으로 배양하였다. 얻어진 융합세포 중에서 항원과 반응하는 항체를 생산하는 세포를 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다. 이때 ELISA 양성반응인 세포를 한계희석법(limiting dilution method)을 이용하여 양성세포와 음성세포를 분리하는 과정(cloning)을 반복한 후 항원에 반응하는 항체를 생산하는 단일클론 세포(hybridoma)를 생산하였다.
얻어진 융합세포 중에서 항원과 반응하는 항체를 생산하는 세포를 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다. 이때 ELISA 양성반응인 세포를 한계희석법(limiting dilution method)을 이용하여 양성세포와 음성세포를 분리하는 과정(cloning)을 반복한 후 항원에 반응하는 항체를 생산하는 단일클론 세포(hybridoma)를 생산하였다.
성능/효과
6개의 양성 클론을 대상으로 면역침강(Immunoprecipitia-tion, IP) 분석을 수행한 후 12% SDS-PAGE에 로딩하여 웨스턴 블럿팅(Western blotting)으로 확인한 결과, 화영벼의 용해 물에서는 나타나지 않았던 2개의 밴드가 50 kDa 주위에 관찰되었고, 그 중 위에 위치하는 밴드가 control과 사이즈가 같아 목적 밴드(target band)로 생각되며, AtCYP78A7 과발현 벼인 18A-4의 용해물에서는 4개의 클론(#4C2, #6A7, #7E8, #11H6) 에서 IP 반응이 확인되었다(Fig. 2).
GST-AtCYP78A7 (0.1 μg/ml)을 항원으로 이용한 페어링 테스트 결과 Table 5에서 이탤릭체로 표시된 항체 7쌍을 사용 하는 것이 좋은 결과를 보였으며, 그 중에서도 포획항체 mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6과 검출항체 pAb #2-biotin, mAb7E8-biotin이 좋은 결과를 보였다.
Product test 결과 음성 대조구인 일품벼의 용해물은 측청치가 낮아 확연히 구분되나, 화영벼의 용해물은 일정비율로 검출되는 단백질이 있는 것으로 확인되었다(Fig. 4). 그러나 양성 대조구인 AtCYP78A7 과발현 벼 2계통(10B-5, 18A-4)에 비해서는 낮은 비율로 검출되었다.
또한 벼 시료(일품벼, 화영벼, 10B-5, 18A-4)의 용해물에 대한 실험 결과, 포획항체로는 mAb 6A7과 4C2가 mAb 11H6를 사용하는 것보다 항원 특이 성이 높으며, 검출항체로는 Ab 7E8-biotin이 pAb #2-biotin 보다 항원 특이성이 높은 것을 확인하였다(Table 6). 결과적으로 검출항체로는 mAb 7E8, 포획항체로는 biotylation된 mAb 4C2가 가장 좋은 조합으로 선정되었다.
1 μg/ml)을 항원으로 이용한 페어링 테스트 결과 Table 5에서 이탤릭체로 표시된 항체 7쌍을 사용 하는 것이 좋은 결과를 보였으며, 그 중에서도 포획항체 mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6과 검출항체 pAb #2-biotin, mAb7E8-biotin이 좋은 결과를 보였다. 또한 벼 시료(일품벼, 화영벼, 10B-5, 18A-4)의 용해물에 대한 실험 결과, 포획항체로는 mAb 6A7과 4C2가 mAb 11H6를 사용하는 것보다 항원 특이 성이 높으며, 검출항체로는 Ab 7E8-biotin이 pAb #2-biotin 보다 항원 특이성이 높은 것을 확인하였다(Table 6). 결과적으로 검출항체로는 mAb 7E8, 포획항체로는 biotylation된 mAb 4C2가 가장 좋은 조합으로 선정되었다.
마우스 복수(Mouse Ascites)를 각 10 ml씩 IgG 정제하여 12% SDS-PAGE로 확인한 결과, 항체 크기는 50 kDa, 25 kDa이었으며, 항-AtCYP78A7 #4C2, #6A7, #7E8, #11H6의 농도는 각각 5.8, 3.4, 4.5, 4.0 mg/ml이었다(Fig. 3).
21%의 비율로 검출되었다. 이상의 결과로 일품벼와 화영벼는 검출 단백질비율이 0.1% 미만으로 음성, AtCYP78A7 과발현 벼 2계통 (10B-5, 18A-4)는 0.1% 이상으로 양성으로 확인되었다.
재조합한 GST-AtCYP78A7 단백질을 이용하여 마우스 면역을 실시한 후 혈청을 분리하여 ELISA 테스트를 수행한 결과, 항체 역가는 1:10,000 정도이며 GST 대조구 단백질과의 교차반응은 매우 약한 것으로 관찰되었다(Fig. 1).
그러나 양성 대조구인 AtCYP78A7 과발현 벼 2계통(10B-5, 18A-4)에 비해서는 낮은 비율로 검출되었다. 전체 단백질 대비 측정된 단백질의 비율은 일품벼의 경우 측청치가 0.008% 이하로 나왔으며, 화영벼는 0.05~0.06%의 비율로 검출되었다. 반면 AtCYP 78A7 과발현 벼 2계통(10B-5, 18A-4)는 0.
정제된 각각의 항체 4mg을 이용하여 비오틴 접합(biotin conjugation)을 시킨 후, Avidin-HRP로 binding을 확인한 결과 AtCYP78A7 mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8 항체에 비오틴이 접합되었음을 확인하였다(Table 4).
후속연구
본 연구에서는 AtCYP78A7 단백질에 특이적으로 결합하는 4개의 단클론 항체(mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8)를 생산하였고, 비오틴화 및 페어링 테스트를 통해 선발된 포획항체 mAb 4C2와 검출항체 mAb 7E8-biotin의 조합으로 ELISA 키트를 개발하였다. 개발된 ELISA 키트를 이용한 벼시료의 분석 결과 AtCYP78A7 과발현 벼는 전체 단백질 대비 AtCYP78A7 단백질의 비율이 0.1% 이상인 양성으로, 일품벼와 화영벼는 0.1% 미만인 음성으로 나타나 키트를 이용한 AtCYP78A7 단백질의 검출이 가능하였으며, 본 키트는 향후 AtCYP78A7를 과발현하는 형질전환 작물을 대상으로 하는 환경 모니터링 또는 인체 위해성 평가에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
GM 농산물 검사 방법은?
현재 주로 사용하고 있는 GM 농산물의 검사는 GM 작물에 도입된 유전자에 의해 생산되는 단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 진단하는 효소면역학적(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 방법과 삽입된 유전자를 판별 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법을 이용하고 있다[1, 2]. 특히 ELISA 분석은 GM 작물에 도입된 새로운 단백질의 발현정도를 가장 신속하고 간편하게 파악 하는 방법으로 인체 노출도 검정 및 환경 모니터링 연구에 유용하게 활용되고 있다[4, 15].
환경조건에 따라 도입 단백질의 발현량이 달라질 수 있기 때문에 어떤 단백질 시료로 준비해야하는가?
도입 단백질의 발현 분석은 일반적으로 ELISA 분석법을 통해 정량분석이 수행되며, Western blot과 Immuno-strip 등을 통해 정성분석이 수행 되고 있다[3, 14, 19]. 특히 단백질의 발현량은 환경조건에 따라 다를 수 있기 때문에 단백질의 정량분석을 위한 시료는 복수 년차 및 복수지역에서 재배된 GM 작물을 대상으로 하며, 발현 부위 및 발현시기와 관련하여 식물체의 다양한 부위에서 생장 시기별로 준비한다[7, 18]. 따라서 단시간에 많은 양의 시료를 동시에 분석할 수 있는 ELISA 방법은 단백질의 발현량 분석에서 가장 흔히 사용되고 있는 방법이다.
새롭게 개발된 GM 작물이 식품으로 승인받기 위해 요구되는 것은?
본 연구는 시토크롬 P450 CYP78A 유전자의 서브패밀리의 일종인 애기장대 유래의 AtCYP78A7을 과발현하는 형질전환 식물체로부터 AtCYP78A7 단백질을 특이적으로 인식하는 단일큰론 항체의 제조와 그 항체를 AtCYP78A7 단백질과 접촉 시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 AtCYP78A7 단백질을 면역학적으로 검출하는 방법을 개발하는 것을 목적으로 하였다. 새롭게 개발된 GM 작물이 식품으로 승인받기 위해서는 안전성 평가를 거쳐야 하며, 그 중 도입유전자 산물인 재조합 단백질은 잠재적인 알레르기성 및 독성 평가와 함께 발현정도에 대한 분석이 요구되고 있다. 도입 단백질의 발현 분석은 일반적으로 ELISA 분석법을 통해 정량분석이 수행되며, Western blot과 Immuno-strip 등을 통해 정성분석이 수행 되고 있다[3, 14, 19].
참고문헌 (20)
Ahmed, F. E. 2002. Detection of genetically modified organisms in foods. Trends Biotech. 20, 215-223.
Anklam, E., Gadani, F., Heinze, P., Pijnenburg, H. and Eede, G. V. D. 2002. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products. Eur. Food Res. Technol. 214, 3-26.
Chhapekar, S., Raghavendrarao, S., Pavan, G., Ramakrishna, C., Singh, V. K., Phanindra, M. L. V., Dhandapani, G., Sreevathsa, R. and Kumar, P. A. 2015. Transgenic rice expressing a codon-modified synthetic CP4-EPSPS confers tolerance to broad-spectrum herbicide, glyphosate. Plant Cell Rep. 34, 721-731.
Head, G., Brown, C. R., Groth, M. E. and Duan, J. J. 2001. Cry1Ab protein levels in phytophagous insects feeding on transgenic corn: implications for secondary exposure risk assessment. Entomol. Exp. Appl. 99, 37-45.
Ito, T. and Meyerowitz, E. M. 2000. Overexpression of a gene encoding a cytochrome P450, CYP78A9, induced large and seedless fruit in Arabidopsis. Plant Cell 12, 1541-1550.
Kim, H. B. and Choi, S. B. 2012. Cytochrome P450 gene for increasing seed size or water stress resistance of plant. US Patent 8153862 B2.
Kim, H. J., Lee, S. M., Kim, J. K., Ryu, T. H., Suh, S. C., and Cho, H. S. 2010. Expresseion of PAT and NPTII proteins during the developmental stages of a genetically modified pepper developed in Korea. J. Agric. Food Chem. 58, 10906-10910.
Korea Biosafety Clearing House. 2017. Biosafety White Paper 2017. Korea Biosafety Clearing House, Daejeon.
Marx, U., Embleton, M. J., Fischer, R., Gruber, F. P., Hansson, U., Heuer, J., de Leeuw, W. A., Logtenberg, T., Merz, W., Portetelle, D., Romette, J. and Straughan, D. W. 1997. Monoclonal antibody production. The report and recommendations of ECVAM workshop 23. ATLA 25, 121-137.
Nam, K. H., Kim, D. Y., Shin, H. J., Nam, K. J., An, J. H., Pack, I. S., Park, J. H., Jeong, S. C., Kim, H. B. and Kim, C. G. 2014. Drought stress-induced compositional changes in tolerant transgenic rice and its wild type. Food Chem. 153, 145-150.
Nam, K. H., Kim, D. Y., Shin, H. J., Pack, I. S., Park, J. H., Yoon, W. K., Kim, H. B. and Kim, C. G. 2018. Safety assessment of AtCYP78A7 protein expressed in genetically modified rice tolerant to abiotic stress. Kor. J. Agric. Sci. 45, 248-257.
Nam, K. H., Shin, H. J., Pack, I. S., Park, J. H., Kim, H. B. and Kim, C. G. 2015. Growth stage-based metabolite profiling of drought-tolerant transgenic rice under well-watered and deficit conditions. Plant Omics J. 8, 587-594.
Nam, K. H., Shin, H. J., Pack, I. S., Park, J. H., Kim, H. B. and Kim, C. G. 2016. Metabolomic changes in grains of well-watered and drought-stressed transgenic rice. J. Sci. Food Agri. 96, 807-814.
Rahnama, H., Nikmard, M., Abolhasani, M., Osfoori, R., Sanjarian, F. and Habashi, A. A. 2017. Immune analysis of cry1Ab-genetically modified potato by in-silico analysis and animal model. Food Sci. Biotechnol. 26, 1437-1445.
Rui, Y. K., Yi, G. X., Zhao, J., Wang, B. M., Li, Z. H., Zhai, Z. X., He, Z. P. and Li, Q. X. 2005. Changes of Bt toxin in the rhizosphere of transgenic Bt cotton and its influence on soil functional bacteria. World J. Microb. Biot. 21, 1279-1284.
Su, V. and Hsu, B. D. 2010. Transient expression of the Cytochrome p450 CYP78A2 enhances anthocyanin production in flowers. Plant Mol. Biol. Rep. 28, 302-308.
Wan, P., Zhang, Y., Wu, K. and Huang, M. 2005. Seasonal expression profiles of insecticidal protein and control efficacy against Helicoverpa armigera for Bt cotton in the Yangtze River Valley of China. J. Econ. Entomol. 98, 195-201.
Wang, Y., Ke, K., Li, Y., Han, L., Liu, Y., Hua, H. and Peng, Y. 2016. Comparison of three transgenic Bt rice lines for insecticidal protein expression and resistance against a target pest, Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Insect Sci. 23, 78-87.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.