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문제 정의
- 나리 형질전환 식물체를 개발하기 위하여 나리 인편 절편 체에 유전자총 적용 시 적정조건을 구명하고자 금 입자 크기, 헬륨가스 농도 및 목표 절편체와의 거리 이 3가지 요인에 대해 실험을 수행하였다. 유전자총 실험에서 텅스텐 등 다른 금속 입자를 제외하고 금입자를 사용한 이유는 텅스텐 입자는 금 입자와 비교하여 효율도 낮고(데이터 미 제시),식물과 연구자 모두에게 잠재적 위험성이 있는 것으로 판단되어 본 연구에서는 금 입자를 사용하였는데, Table 1에서 나타난 것처럼 금 입자 크기는 0.
- 따라서 본 연구에서는 유전자총 실험에 중요한 성공요소들인 발사체와의 거리, 압력 및 최적의 금입자 크기를 찾고 또한 유전자 총을 이용한 형질전환 실험 시 삼투압 유지에도음을 주고 일부 작물에서 도입 유전자 발현을 좋아지게 하는 삼투압 조절제의 처리효과를 구명하여 내건성 및 내염성을 유용형질을 나타내는 AtSIZ(복합환경저항성유전자) 유전자를 나리 식물체에 효율적으로 전달할 수 있는 최적의 유전자총 형질전환 체계를 확립하고자 본 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 5배 이상 높은 효율을 보여주었다. 1,100 및 1,350 psi 두 처리구 사이의 유의성있는 차이는 없었지만, 1,350 psi의 경우, 더욱 강한 압력으로 인하여 bombarding 후, 선발 및 형질전환 식물체 분화과정에서 물리적인 피해가 예상되므로 1,100 psi를 최적 압력으로 선정하였다. 본 실험에서 최적 압력으로 선정된 1,100psi는 최초의 유전자총을 이용한 백합연구보고(Watad et al.
- 8주에서 12주 정도 선발과정을 거친 형질전환 나리 소식물체로부터 유엽을 채취해서 DNA 추출 후, 선발유전자인 bar 유전자와 목적유전자인 AtSIZ유전자가 도입되었는지 여부를 PCR 검정으로 확인한 결과, Figure 4A에서처럼 선발과정을 거친 백합식물체 중 무작위로 6계통을 선발하여 검정하였다. 그 결과 그 중 5개체에서 bar (552 bp) 밴드가 관찰되었으며, 이 중 4계통을 다시 선발하여 AtSIZ 유전자(1,794bp)가 도입되었는지를 확인한 결과, Figure 4B처럼 4 계통 중3 계통에서 밴드가 확인되었다.
- AtSIZ 유전자(1,794 bp)의 PCR 분석을 위해서는 forward primer로서 5’-ATGTGCGGTGCAAAGAGCAACC-3’, 그리고 reverse primer로서 5’- TTATGCCACATTCTGCTCAT-3’를 사용하였다.
- 6 µm), 헬륨가스 압력(900, 1100 및 1350 psi) 그리고 목적 절편체까지의 거리(3, 6 및 9 cm)로 조건을 달리하여 실험을 수행하였으며, 유전자 총 챔버 내의 진공 시 압력은 28 in Hg로 통일하였다. Bombardment 실험 후, 인편절편체를 PPT가 첨가되지 않은 MS배지로 옮겨 1주일간 배양 후, 다시 PPT 10 mg/l이 첨가된 선발배지로 옮겨 4주 간격으로 계대배양을 실시하여 총 8주간 선발과정을 수행하였다.
- PCR 조건은 pre-denaturation은 94°C에서 4분, denaturation은 94°C에서 30초, annealing은 58°C에서 30초, extension은 72°C에서 50초로 33 cycles 그리고 last extension은 72°C 에서 10분간 반응시켜 증폭반응을 수행하였다.
- PPT 10 mg/l에서 8주간 생존한 형질전환 인편 조직에서 분화된 신초들로부터 DNA를 추출하여 다음과 같은 PCR 분석을 통해 선발유전자인 bar 유전자의 도입을 확인 후, 유용유전자인 AtSIZ 유전자의 도입 역시 확인하였다. PCR분석을 위해 형질전환 인편에서 분화된 엽조직 0.1 g을 채취 후, 막자사발 및 액체질소를 이용하여 분쇄한 뒤, genomic DNA extraction kit (Real Biotech Corporation, Taiwan)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 본 실험에 사용된 bar 유전자(bar: 552bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5’-TCAAATCTCGGTCGGGGACGGCA-3’, 그리고 reverse primer로서 5’-ATGAGCCCAGAACGCCC-3’를 사용하였다.
- PPT 10 mg/l에서 4주 간격으로 계대배양 후, 8 ~ 12주 이상 선발과정을 거쳐 신초가 다수 형성된 형질전환 나리 인편들을 PPT가 첨가되지 않는 증식 MS 고체배지로 옮겨 발근 및 추가 생육을 유도 하였다. 생육이 우수하고 발근이 우수한 개체들을 기외 상태에서 1~2주간 순화과정을 거쳐 혼합상토가 들어있는 직경 10 cm 화분으로 이식하여 증식 및 활착 하였다.
- PPT 10 mg/l에서 8주간 생존한 형질전환 인편 조직에서 분화된 신초들로부터 DNA를 추출하여 다음과 같은 PCR 분석을 통해 선발유전자인 bar 유전자의 도입을 확인 후, 유용유전자인 AtSIZ 유전자의 도입 역시 확인하였다. PCR분석을 위해 형질전환 인편에서 분화된 엽조직 0.
- 이 삼투압처리제들을 실험 수행 하기 24시간 전에 인편증식용 고체 MS배지에첨가하여 24시간 동안 배양 후, 유전자총 실험을 수행한 후에도 동일한 배지에 24시간 정도 배양한 후, 삼투압 조절제가 들어있지 않은 일반 MS배지로 이식하였다. 그리고 나서위와 동일하게 1주일 후, PPT 10 mg/l이 첨가된 선발배지로옮겨 4주 후 선발배지에서 생존한 인편조직을 조사하였다.또한 선발 8주 후에 PPT 10 mg/l가 첨가된 선발배지에서 신초가 형성된 인편 절편체 비율을 조사하여 형질전환 효율을 간접적으로 조사하였다.
- 그리고 나서위와 동일하게 1주일 후, PPT 10 mg/l이 첨가된 선발배지로옮겨 4주 후 선발배지에서 생존한 인편조직을 조사하였다.또한 선발 8주 후에 PPT 10 mg/l가 첨가된 선발배지에서 신초가 형성된 인편 절편체 비율을 조사하여 형질전환 효율을 간접적으로 조사하였다.
- 모든 처리구는 각 100개씩 백합 인편을 사용하였으며, 유전자총 최적 조건실험은 5반복 그리고 삼투압조절제 효과 검정실험은 4반복 수행하였다. 모든 통계처리는 SPSS (window version)으로 던컨다중검정(DMRT)에 의한 ANOVA 검정을 수행하였다.
- 본 실험에 사용된 bar 유전자(bar: 552bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5’-TCAAATCTCGGTCGGGGACGGCA-3’, 그리고 reverse primer로서 5’-ATGAGCCCAGAACGCCC-3’를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 벡터 내에 선발유전자로 bar 유전자가 포함되어 있는데, 형질전환 개체를 효율적으로 선발하기 위해 선발배지 내에 선발목적으로 첨가되는 제초제 PPT(phosphinothricin)의 최적 농도를 결정하기 위해 PPT를 선발 배지에 0, 5, 10, 15 및 20 mg/l로 농도를 달리하여 첨가한 후, 실험을 수행하였다. 농도에 따른 고사율 데이터는 4주 후 수집하였다.
- 본 연구에서 나리 ‘레드플레임’ 품종의 인편조직에 선발유전자로 제초제저항성 유전자인 bar 유전자 그리고 내염성과 내건성의 복합환경저항성을 나타내는 AtSIZ유전자를 목적유전자로 가지고 있는 플라스미드를 금입자에 코팅해서 유전자총을 이용해서 형질전환 하였다.
- 상기 실험을 거쳐 확립된 유전자총 발사조건(금입자 1.0µm, 1,100 psi 그리고 6 cm 사출거리)을 기본조건으로 형질전환 실험을 수행 시, 삼투압조절제 처리를 통해 유전자 발현율 증가에 효과가 있는지 구명하고자 무처리구, 0.2 Mmannitol, 0.2 M sorbitol, 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol 이렇게4개 처리구로 비교 실험을 진행하였다.
- 상기 형질전환 조건(금 입자 크기 1.0 μm, 압력 1,100 psi 및 목표조직까지 거리 6 cm)으로 삼투압조절제 효과 구명실험을 수행하였는데, 유전자총 발사 후, 4주 후에 생존한 인편의 수는 삼투압조절제 처리와 대조구 간에 거의 차이가 없었으나, 신초 발생율의 경우는 Figure 2에 나타나듯이 대조 구와 비교해서 60%이상 높은 결과를 보여 주었다.
- PPT 10 mg/l에서 4주 간격으로 계대배양 후, 8 ~ 12주 이상 선발과정을 거쳐 신초가 다수 형성된 형질전환 나리 인편들을 PPT가 첨가되지 않는 증식 MS 고체배지로 옮겨 발근 및 추가 생육을 유도 하였다. 생육이 우수하고 발근이 우수한 개체들을 기외 상태에서 1~2주간 순화과정을 거쳐 혼합상토가 들어있는 직경 10 cm 화분으로 이식하여 증식 및 활착 하였다.
- 실험 조건 확립을 위하여 금 입자 크기(0.6, 1.0 및 1.6 µm), 헬륨가스 압력(900, 1100 및 1350 psi) 그리고 목적 절편체까지의 거리(3, 6 및 9 cm)로 조건을 달리하여 실험을 수행하였으며, 유전자 총 챔버 내의 진공 시 압력은 28 in Hg로 통일하였다.
- 2M mannitol을 혼합해서 MS배지에 첨가한 프로토콜로부터 우수한 형질전환 결과를 나타내었다. 유전자총 발사 처리 후, 1주간 선발제로 사용되는 PPT가 없는 MS 배지로 이식하여 배양 후, PPT 10 mg/l이 첨가된 선발배지에서 4주 간격의 계대배양을 통해 8-12주간 선발과정을 거친다. PPT 선발 배지에서 생존한 신초가 형성된 형질전환 나리 인편 조직들을 호르몬이 없는 MS 배지로 다시 옮겨주면 발근 및 추가 생육이 이루어진다.
- 2 M sorbitol 이렇게4개 처리구로 비교 실험을 진행하였다. 이 삼투압처리제들을 실험 수행 하기 24시간 전에 인편증식용 고체 MS배지에첨가하여 24시간 동안 배양 후, 유전자총 실험을 수행한 후에도 동일한 배지에 24시간 정도 배양한 후, 삼투압 조절제가 들어있지 않은 일반 MS배지로 이식하였다. 그리고 나서위와 동일하게 1주일 후, PPT 10 mg/l이 첨가된 선발배지로옮겨 4주 후 선발배지에서 생존한 인편조직을 조사하였다.
- PCR 조건은 pre-denaturation은 94°C에서 4분, denaturation은 94°C에서 30초, annealing은 58°C에서 30초, extension은 72°C에서 50초로 33 cycles 그리고 last extension은 72°C 에서 10분간 반응시켜 증폭반응을 수행하였다. 증폭된 DNA는 0.8% agarose gel에서 100 V 에서 30분간 전기영동을 실시하여 목표유전자의 도입여부를 확인하였다.
대상 데이터
- 반면 최초로 유전자총을 적용한 나리 연구보고에서는 0.75 µm크기의 텅스텐 입자를 사용하였으며, Kamo and Han (2008)은 동일한 크기의 금 입자를 사용하였다.
- 본 실험에 재료로 사용된 나리 식물체는 국립원예특작과학원 화훼과에서 육성한 ‘레드플레임’ 품종의 기내식물체로부터 인편절편체를 분리하여 MS basal salts with vitamins 4.41g/l, plant agar 7.0 g/l (Duchefa, Haarlem, The Netherlands), sucrose 30 g/l이 첨가되고 pH는 5.8로 조정된 인편증식용 MS(Murashige and Skoog 1962) 배지에서 4주 간격으로 계대배양으로 증식한 인편조직들을 형질전환 재료로 사용하였다.
- 유전자총 실험에 사용된 vector는 선발유전자로 bar 유전자와 목적 유용유전자인 AtSIZ(복합환경저항성유전자; 내건성 및 내염성) 유전자가 포함된 pCAMBIA3301 vector를 제 노마인㈜ 첨단생명공학연구소(경북 포항 소재)로부터 분양 받아 사용하였다(Fig. 1 참고). 유전자의 금입자 코팅과정은 Roh et al.
- 유전자총을 이용한 형질전환 체계와 PPT (D-L-phosphinothricin) 선발을 통하여 나리 인편조직으로부터 형질전환 식물체가 획득되었다. 본 연구에서 나리 ‘레드플레임’ 품종의 인편조직에 선발유전자로 제초제저항성 유전자인 bar 유전자 그리고 내염성과 내건성의 복합환경저항성을 나타내는 AtSIZ유전자를 목적유전자로 가지고 있는 플라스미드를 금입자에 코팅해서 유전자총을 이용해서 형질전환 하였다.
데이터처리
- 모든 처리구는 각 100개씩 백합 인편을 사용하였으며, 유전자총 최적 조건실험은 5반복 그리고 삼투압조절제 효과 검정실험은 4반복 수행하였다. 모든 통계처리는 SPSS (window version)으로 던컨다중검정(DMRT)에 의한 ANOVA 검정을 수행하였다.
이론/모형
- 1 참고). 유전자의 금입자 코팅과정은 Roh et al. (2011)의 방법에 따라 수행하였으며, 유전자총실험은 PDS-1000/He (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를 이용하여 나리 인편조직에 bombarding 하였다. 실험 조건 확립을 위하여 금 입자 크기(0.
성능/효과
- 6 µm과 비교해서 6주 후 PPT가 10mg/l 첨가된 선발배지에서 2배 이상의 선발배지에서의 생존율을 보여 주었다. 12주 경과 후, 신초가 형성된 나리 인편의 개수에서도 약 6.5% 내외의 효율을 보여 주었다. 따라서 본 연구에서도 1.
- 8주에서 12주 정도 선발과정을 거친 형질전환 나리 소식물체로부터 유엽을 채취해서 DNA 추출 후, 선발유전자인 bar 유전자와 목적유전자인 AtSIZ유전자가 도입되었는지 여부를 PCR 검정으로 확인한 결과, Figure 4A에서처럼 선발과정을 거친 백합식물체 중 무작위로 6계통을 선발하여 검정하였다. 그 결과 그 중 5개체에서 bar (552 bp) 밴드가 관찰되었으며, 이 중 4계통을 다시 선발하여 AtSIZ 유전자(1,794bp)가 도입되었는지를 확인한 결과, Figure 4B처럼 4 계통 중3 계통에서 밴드가 확인되었다. 이렇게 유전자 도입이 안된 계통은 온전하게 나리 게놈으로 삽입이 부분적으로 되었거나 선발 및 증식과정 중에 escape 발생된 것으로 추정된다.
- 1999).또한 헬륨가스 압력은 Table 2에서 나타나듯이 900 psi에서PPT 선발배지에서 생존율이 8.2%로 낮았으나, 1,100 및1,350 psi는 20%정도의 생존율을 보여주었고 신초형성율도10-11%로 900 psi의 5.9%와 비교해서 1.5배 이상 높은 효율을 보여주었다. 1,100 및 1,350 psi 두 처리구 사이의 유의성있는 차이는 없었지만, 1,350 psi의 경우, 더욱 강한 압력으로 인하여 bombarding 후, 선발 및 형질전환 식물체 분화과정에서 물리적인 피해가 예상되므로 1,100 psi를 최적 압력으로 선정하였다.
- 목표 절편체까지의 거리에 대한 최적화 실험은 Table 3에서 나타난 것처럼 3 cm와 6 cm에서 100개 인편 중 6주 후에 20여개 정도가 PPT 저항성을 나타내었고, 9 cm에서는 절반 이하의 생존율을 나타내었다. 본 연구에서는 3 cm는 생존율이나 12주 후 신초발생율도 6 cm와 차이도 없거나 오히려 낮으므로 본 연구에서는 6 cm가 최적 거리라는 결과가 나왔는데 이 역시 심비디움의 6 cm (Roh et al.
- 일반적으로 제초제저항성 유전자인 bar 유전자가 제대로 삽입되었을 경우, PPT를 첨가한 배지에서 형질전환 개체는 생존하게 되는데 식물 종마다 감수성이나 저항성이 달라 형질전환 실험 전에 최적의 선발농도를 정하지 않으면 선발에 어려움을 겪게 된다. 본 실험에서 PPT 0, 5, 10, 15 및 20mg/l 농도로 첨가된 MS고체배지에서 인편을 대상으로 4주간 배양한 결과, Figure 2는 무처리구에서는 100% 생존하였으나, 5 mg/l에서 이미 93% 인편이 고사하였고, 10 mg/l 이상 농도에서는 100% 고사하였음을 나타내고 있다. 이러한 PPT 선발농도는 유전자총을 이용한 알스트로메리아(Lin etal.
- 1,100 및 1,350 psi 두 처리구 사이의 유의성있는 차이는 없었지만, 1,350 psi의 경우, 더욱 강한 압력으로 인하여 bombarding 후, 선발 및 형질전환 식물체 분화과정에서 물리적인 피해가 예상되므로 1,100 psi를 최적 압력으로 선정하였다. 본 실험에서 최적 압력으로 선정된 1,100psi는 최초의 유전자총을 이용한 백합연구보고(Watad et al.1998)뿐만 아니라 심비디움(Roh et al. 2011)과도 같은 압력수준임을 보여 주었다.
- 목표 절편체까지의 거리에 대한 최적화 실험은 Table 3에서 나타난 것처럼 3 cm와 6 cm에서 100개 인편 중 6주 후에 20여개 정도가 PPT 저항성을 나타내었고, 9 cm에서는 절반 이하의 생존율을 나타내었다. 본 연구에서는 3 cm는 생존율이나 12주 후 신초발생율도 6 cm와 차이도 없거나 오히려 낮으므로 본 연구에서는 6 cm가 최적 거리라는 결과가 나왔는데 이 역시 심비디움의 6 cm (Roh et al. 2011)와 같거나 알스트로메리아의 5.5 cm (Lin et al. 2000)처럼 거의 차이가 나지 않는 결과라고 할 수 있다.
- PPT 선발 배지에서 생존한 신초가 형성된 형질전환 나리 인편 조직들을 호르몬이 없는 MS 배지로 다시 옮겨주면 발근 및 추가 생육이 이루어진다. 생존한 형질전환 나리 기내 소식물체들로부터 PCR 검정을 통해 선발유전자인 bar 유전자 그리고 목적유전자인 AtSIZ 유전자의 도입이 확인되었다. 결론적으로 100여개의 나리 인편조직을 본 연구에서 확립된 유전자총 실험프로토콜을 이용하면 대략적으로 형질전환 나리 17-18 개체를 획득할 수 있으며 본 연구에 기술된 유전자 총 매개 형질전환 체계는 추가적인 보완이 이루어지면, 향후 나리 육종 프로그램에 기여할 것이다.
- 유전자총 실험에서 텅스텐 등 다른 금속 입자를 제외하고 금입자를 사용한 이유는 텅스텐 입자는 금 입자와 비교하여 효율도 낮고(데이터 미 제시),식물과 연구자 모두에게 잠재적 위험성이 있는 것으로 판단되어 본 연구에서는 금 입자를 사용하였는데, Table 1에서 나타난 것처럼 금 입자 크기는 0.6 µm에서만 효율이 낮았고, 1.0과 1.6 µm에서는 0.6 µm과 비교해서 6주 후 PPT가 10mg/l 첨가된 선발배지에서 2배 이상의 선발배지에서의 생존율을 보여 주었다.
- 이러한 형질전환 체계 확립을 위해 헬륨가스 압력은 1,100 psi, 금 입자크기는 1.0 µm 그리고 목적 절편체까지의 거리는 6 cm 그리고 유전자총 처리 24시간 전과 후에 0.2 M sorbitol과 0.2M mannitol을 혼합해서 MS배지에 첨가한 프로토콜로부터 우수한 형질전환 결과를 나타내었다.
후속연구
- 생존한 형질전환 나리 기내 소식물체들로부터 PCR 검정을 통해 선발유전자인 bar 유전자 그리고 목적유전자인 AtSIZ 유전자의 도입이 확인되었다. 결론적으로 100여개의 나리 인편조직을 본 연구에서 확립된 유전자총 실험프로토콜을 이용하면 대략적으로 형질전환 나리 17-18 개체를 획득할 수 있으며 본 연구에 기술된 유전자 총 매개 형질전환 체계는 추가적인 보완이 이루어지면, 향후 나리 육종 프로그램에 기여할 것이다.
- 이렇게 유전자 도입이 안된 계통은 온전하게 나리 게놈으로 삽입이 부분적으로 되었거나 선발 및 증식과정 중에 escape 발생된 것으로 추정된다. 본 연구 수행 결과, 형질전환 나리 16계통 65 식물체가 생산되어 증식 중에 있고, 추가 증식과정을 통하여 향후 기내 및기외 상태에서 형질전환 및 비형질전환 나리 식물체들간의 변이발생 여부조사를 포함하는 생육 및 배수체 검정 그리고 내염성 및 내건성에 대한 추가적인 기능성 검정이 이루어져야 할 것으로 판단된다.
- 선발농도가 너무 낮은 경우, Roh et al (2011)에서 지적한 것처럼 ‘escape’ 발생 우려도 있고 또한 일부 난과 식물(Roh et al. 2011) 및 알스트로메리아(Kim et al. 2007; Lin et al. 2000)와 나리에서도 제초제성분이 아닌 항생제인kanamycin을 형질전환체 선발약제로 사용 시 비형질전환 세포나 조직도 상당한 카나마이신 저항성을 나타내므로 이러한 화훼류 형질전환에 있어서는 현재로서 제초제저항성 기반의 선발체계가 도입되어야 한다고 판단된다.
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