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문제 정의
- 현재 체질별 병증이나 약리 작용에 대해 비임상 연구를 좀 더 용이하게 하기 위한 체질별 동물 모델 개발에 대한 연구가 시도되고 있다. Bleomycin으로 폐약(肺弱) 상태를 만들어 비만상태에서의 일반 쥐 군과의 차이점을 비교한 김 등의 연구15), Acetaminophen으로 간약(肝弱) 상태를 만들어 비만을 유도하고 그 특징을 비교한 박 등의 연구16) 등이 진행되었으며, 본 연구에서는 신절제(Unilateral Ureteral Obstruction)를 통한 신약(腎弱) 상태를 가정하고 비만을 유도하여 일반적 고지방식이를 유도한 군과의 차이점과, 그 영향평가를 알아보고자 한다.
- 이것은 사상체질에 따라 대사증후군 인자들의 취약도와 위험도가 다를 수 있음을 시사하며, 吸聚之氣의 과다로 비만이 好發되는 것으로 알려져 있는 태음인 이외의 체질에 대한 연구도 필요함을 시사한다. 이에 본 연구에서는 태음인 다음으로 비만 및 대사증후군 환자의 분포가 비슷하게 나타난 소음인・소양인 중 소양인에 대한 연구를 위해 동물모델 개발을 하였다. 소양인은 신강기능이 약하다는 것을 가정하고 신장의 물리적 절제를 이용하여 인위적으로 subacute renal injury를 유도한 신약(腎弱)병태 모델을 만든 후, 체중, 식이효율, 혈액학적 특성 및 관련 유전자 발현에 대해 관찰하였다22).
제안 방법
- 우측 신장 절제 1주일 후 마취 하에서 C57bl/6J 생쥐의 좌상복부를 절개하여 좌측 신장을 노출시킨 다음 좌측 신동맥,신정맥, 요관 및 신우를 보전하면서 좌측 신장의 2/3를 선택적으로 절제한다. 24시간 후 수술을 완료한 쥐를 실험군으로 분류하여 실험을 진행하였다.
- 5. 실험군의 신장조직에서 PCR 증폭법을 사용하여 mRNA 유전자 발현량을 비교하였다. 요산 대사와 관련된 GLUT-9 유전자 발현이 신약 비만 모델에서 비만대조군보다 유의하게 감소하였다(p<0.
- 8주령의 수컷 C57bl/6J 생쥐를 일반대조군(C57bl/6J-Nr), 60% 고지방식이(High-fat Diet)를 투여하는 고지방식이군(HFD-CTL), UUO 후 고지방식이를 투여하는 신약(腎弱) 비만 모델군(UUO_HFDCTL)의 3군으로 분류하여 각각 5마리씩 배분하였다. 이후 6주간 C57bl/6J-Nr의 경우 일반 고형사료, HFD-CTL 및 UUO_HFD-CTL군의 경우 고지방사료를 투여하였다.
- 고지방사료를 6주간 투여한 대조군과 UUO유도 후 동일 기간 동안 고지방사료 투여한 후 혈청 분리를 통해 혈청 내 Glucose의 변화를 비교하였다.
- 고지방사료를 6주간 투여한 대조군과 UUO유도 후동일 기간 동안 고지방사료 투여한 후 혈청 분리를 통해 Total Cholesterol, HDL-Cholesterol, LDL-Cholesterol 및 중성지방을 비교하였다.
- 고지방사료를 6주간 투여한 대조군과 UUO유도 후동일 기간 동안 고지방사료 투여한 후 혈청 분리를 통해 간기능 및 신장 관련 수치를 비교하였다.
- 고지방식이 투여 6주 후 실험군을 비교하여 간과 부고환의 지방조직량을 비교하였다. 간의 경우 지방조직량에서 비만대조군과 크게 차이가 나타나지 않았으나 부고환 지방조직량의 경우 신약 비만 모델에서 비만대조군보다 유의하게 적은 지방 증가량을 나타내었다(Fig.
- 체중은 매주 화요일 10시에 동물용 체중계(카스전자 저울, 한국)로 측정하여 기록하였다. 또한 동일한 날짜에 맞추어 1주일에 1회씩 식이섭취량(g)을 측정하였다. 식이섭취량은 매주 측정일의 일정한 시간에 측정하여 일평균 섭취 식이량을 산출하였으며, 식이 효율(feed efficiency ratio, FER)은 다음과 같이 체중증가량을 식이섭취량으로 나누어서 계산하였다.
- 부검 하루 전 절식시킨 생쥐를 실험 최종일에 에테르 (Ethyl ether, 덕산제약, 한국)로 마취한 후 심장 천자법으로 항응고제인 EDTA가 들어있는 채혈관을 이용하여 채혈하였다. 채혈된 혈액을 자동혈구분석기(HEMAVET, CDC Technolgy, USA)를 사용하여 분석하였다.
- 부검 후 각 실험동물의 장기조직(간, 지방조직)은 혈액 채취 후 즉시 적출하여 칭량한 후, 그 무게를 비교하였다. 지방조직의 경우 피하지방량(Abdominal subcutaneous fat)과 복부지방량 (Epididymaladipose tissue)으로 비교하여 비교하였다.
- 부검 후 적출한 급속 동결 신장조직에서 real-time PCR 증폭법을 사용하여 비만과 만성 염증 및 에너지대사와 관련 있는 유전자 발현 양상을 확인하여, 신약(腎弱) 모델과 비만과의 연관성을 확인하였다. 실험 결과 요산 순환 및 배설 대사와 관련있는 GLUT-9 유전자 발현은 HFD-CTL군보다 유의하게 감소하였다(p<0.
- 부검 후 확보한 신장조직을 10% 포르말린 용액, 4% paraformaldehyde를 사용하여 유지시킨 후 급속 동결하여 확보하였다. 확보한 신장 조직에서 유전자발현 양상을 알아보기 위해 조직내에서 RNA를 추출한 후, Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(AB Science)을 사용하여 real-time PCR 분석을 시행하여 GLUT-9, IL-6, COX-2 등의 mRNA 유전자 발현 정도를 측정하였다.
- 분리한 혈청 (serum)을즉시 생화학자동 분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 혈장 및 간의 지질함량의 지표인 총 콜레스테롤(Total Cholesterol, HDL(Highdensity Lipoprotein)-cholesterol, LDL(Low-densityLipoprotein)-cholesterol, 중성지방(triglyceride),그리고 혈중 Glucose 등의 대사증후군 관련 지표 및 간·신기능 지표를 측정하였다.
- 분석고지방사료를 6주간 투여한 대조군과 UUO유도 후동일 기간 동안 고지방사료 투여한 군에 대하여 부검 후 간 및 피하지방량의 무게를 비교하였다.
- 이에 본 연구에서는 태음인 다음으로 비만 및 대사증후군 환자의 분포가 비슷하게 나타난 소음인・소양인 중 소양인에 대한 연구를 위해 동물모델 개발을 하였다. 소양인은 신강기능이 약하다는 것을 가정하고 신장의 물리적 절제를 이용하여 인위적으로 subacute renal injury를 유도한 신약(腎弱)병태 모델을 만든 후, 체중, 식이효율, 혈액학적 특성 및 관련 유전자 발현에 대해 관찰하였다22).
- 또한 동일한 날짜에 맞추어 1주일에 1회씩 식이섭취량(g)을 측정하였다. 식이섭취량은 매주 측정일의 일정한 시간에 측정하여 일평균 섭취 식이량을 산출하였으며, 식이 효율(feed efficiency ratio, FER)은 다음과 같이 체중증가량을 식이섭취량으로 나누어서 계산하였다.
- 신장의 염증성 변화를 초래하기 위한 실험동물로서 25g내외의 성년기의 수컷 C57bl/6J 생쥐를 대상으로 마취 후 우상등부를 절개하여 우측 신장을 노출시킨후 신동맥, 신정맥, 우측 요관을 봉합사로 묶은 다음 우측 신장 2/3를 선택적으로 절제한다 (Unilateral Ureteral Obstruction, UUO, Fig.1). 우측 신장 절제 1주일 후 마취 하에서 C57bl/6J 생쥐의 좌상복부를 절개하여 좌측 신장을 노출시킨 다음 좌측 신동맥,신정맥, 요관 및 신우를 보전하면서 좌측 신장의 2/3를 선택적으로 절제한다.
- 신절제로 유발한 신약(腎弱) 동물 모델을 만든 후 고지방식이를 투여하여 비만 유도 후 비만 및 지질대사,대사증후군 관련 인자에 대한 영향을 평가하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 1). 우측 신장 절제 1주일 후 마취 하에서 C57bl/6J 생쥐의 좌상복부를 절개하여 좌측 신장을 노출시킨 다음 좌측 신동맥,신정맥, 요관 및 신우를 보전하면서 좌측 신장의 2/3를 선택적으로 절제한다. 24시간 후 수술을 완료한 쥐를 실험군으로 분류하여 실험을 진행하였다.
- . 이렇게 소양인은 소증으로 약한 신장기능을 가지고 있고 신약(腎弱)이 더욱 심화될 때 裏熱證이 생기게 되는데 이러한 신약(腎弱)소증을 가진 동물모델을 만들기 위해 신장의 일부를 절제하였다. 신장절제를 할 경우 감수분열능이 증가되어 RNA합성을가속화시키며 신장의 비후를 유도하고, 이런 상태가 지속되면 수개월내에 남은 신장에서 신장기능 및 구조적 퇴화가 일어난다고 보고되어 신약신약(腎弱)상태를 가정하기 좋은 방법으로 사료된다5).
- 박 등20)의 연구에서는 부적절한 식사를 한 경우 소양인에서 가장 뚜렷하게 BUN의 혈중농도가 증가하여 소양인의 신장기능이 약하다는 해설을 지지하였다. 이에 따라 소양인에서 나타나는 신장기능 약화를 유발한 동물모델을 만들었다. 김 등14), 박 등15)의 연구도 태음인의 肺大肝小가 폐기능이 약하고 간기능이 강하다는 가정을 바탕으로 폐약병태 동물모델을 설정하였으며, 후속연구인 본 연구 또한 동일한 가정 하에 진행하였다.
- 8주령의 수컷 C57bl/6J 생쥐를 일반대조군(C57bl/6J-Nr), 60% 고지방식이(High-fat Diet)를 투여하는 고지방식이군(HFD-CTL), UUO 후 고지방식이를 투여하는 신약(腎弱) 비만 모델군(UUO_HFDCTL)의 3군으로 분류하여 각각 5마리씩 배분하였다. 이후 6주간 C57bl/6J-Nr의 경우 일반 고형사료, HFD-CTL 및 UUO_HFD-CTL군의 경우 고지방사료를 투여하였다.
- 부검 후 각 실험동물의 장기조직(간, 지방조직)은 혈액 채취 후 즉시 적출하여 칭량한 후, 그 무게를 비교하였다. 지방조직의 경우 피하지방량(Abdominal subcutaneous fat)과 복부지방량 (Epididymaladipose tissue)으로 비교하여 비교하였다.
- 부검 하루 전 절식시킨 생쥐를 실험 최종일에 에테르 (Ethyl ether, 덕산제약, 한국)로 마취한 후 심장 천자법으로 항응고제인 EDTA가 들어있는 채혈관을 이용하여 채혈하였다. 채혈된 혈액을 자동혈구분석기(HEMAVET, CDC Technolgy, USA)를 사용하여 분석하였다. 혈청분리용 tube의 혈액은 3000 rpm에서 20분간 원심분리 후 혈청을 얻어 생화학적 지표 분석을 위한 시료로 이용한다.
- 체중은 매주 화요일 10시에 동물용 체중계(카스전자 저울, 한국)로 측정하여 기록하였다. 또한 동일한 날짜에 맞추어 1주일에 1회씩 식이섭취량(g)을 측정하였다.
- 부검 후 확보한 신장조직을 10% 포르말린 용액, 4% paraformaldehyde를 사용하여 유지시킨 후 급속 동결하여 확보하였다. 확보한 신장 조직에서 유전자발현 양상을 알아보기 위해 조직내에서 RNA를 추출한 후, Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(AB Science)을 사용하여 real-time PCR 분석을 시행하여 GLUT-9, IL-6, COX-2 등의 mRNA 유전자 발현 정도를 측정하였다.
대상 데이터
- 수컷 7주령의 C57bl/6J 생쥐 (웅성 8주령 24g 생쥐)는 샘타코바이오코리아사 (Osan, Korea)에서 공급받았고, 동물은 대전대학교 준SPF 실험동물실험실(식약처등록 제270호)에서 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고,온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12 시간 light-dark cycle의 환경을 유지하며 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용한다.
데이터처리
- 각 실험군 결과 값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을 사용하여 통계 처리하였으며, p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시한다.
성능/효과
- 1. 신약 비만 모델은 비만대조군과 비교하여 체중증가율이 약 8.45% 감소하였으며, 고지방식이 투여 기간 동안 식이효율(Food Efficiency)은 일반대조군과 비슷하였다.
- 2. 혈액화학적 검사 결과 Total Cholesterol은 세군 모두 경도 상승하였으나 통계적 유의성은 없었으며, LDL-Cholesterol 및 중성지방은 신약 비만 모델이 비만 대조군에 비해 유의하게 낮은 상승률을 보였다(각각 p<0.01, p<0.005).
- 3, 혈액화학적 검사 결과 신약 비만 모델의 혈중 Glucose는 비만대조군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.01).
- 4. 실험 후 부검하여 실험군의 간 및 복부, 부고환의 피하지방 무게를 비교한 결과, 간과 복부 피하지방의 무게는 비만대조군과 큰 차이가 없었으나 부고환 지방조직의 경우 신약 비만 모델이 비만대조군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05).
- 60% 고지방사료를 6주간 투여한 고지방식이 대조군(HFD-CTD)과 UUO유도 후 고지방사료 투여한 UUO 실험군(UUO_HFD-CTD)은 일반대조군(C57bl/6-Nr)과 비교하여 모두 통계적으로 유의한 체중증가를 나타내었으나(p<0.005), UUO대조군이 고지방식이 대조군(HFD-CTD)에 비해 체중 증가율의 감소 경향을 보였다(Fig. 2).
- AST의 경우 6주 후 일반대조군에 비해 HFD-CTD군과 UUO_HFD-CTD 모두 경도 상승 경향이 관찰되었으나, 통계적 유의성은 없었다. ALT의 경우HFD-CTD군(p<0.
- HFD-CTD군에 비해 UUO_HFD-CTD군이 통계적으로 유의하게 혈중 Glucose 값이 상승하였다(p<0.01)(Fig. 9).
- UUO_HFD-CTD군의 경우 복부 피하지방량변화에 대하여 HFD-CTL군과 유의한 차이가 없었으나, 부고환 지방조직량의 경우 유의하게 지방조직량이 감소하였다(p<0.05)(Fig. 10).
- 간 무게에 대해 측정한 결과, HFD-CTL군의 경우일반대조군에 비해 유의하게 증가 경향을 나타내었다(p<0.01).
- 고지방사료를 6주간 투여한 대조군과 UUO유도 후동일 기간 동안 고지방사료 투여한 후 식이효율을 분석한 결과로, 일반대조군에 비하여 HFD-CTD은 현저하게 식이효율의 증가를 나타내었으나(p<0.005).
- 고지방식이 6주 투여 후 조직에서 각각 비만과 만성 염증 및 에너지 대사와 관련 있는 유전자 발현 양상을 확인한 결과, 요산 순환 및 배설 대사와 관련있는 GLUT-9 유전자 발현은 신약 비만 모델에서 비만대조군보다 유의하게 감소하였다(Fig. 12). GLUT-9는 소장의 공장(jejunum)과 회장(ileum) 상피세포에서 단백질 소화 대사의 산물인 요산(uric acid)을 배설하는 단백질의 일종으로, 감소 시 장벽에서의 요산 배설대사에 문제를 일으켜 단기적으로 고요산 혈증을 유발하며 장기적 결핍 시 혈압의 상승, 혈중 내 콜레스테롤 수치의 증가, 고인슐린혈증, 지방간 침착 등의 초기 대사증후군 환경을 유발하게 된다28).
- 고지방식이 투여 6주 후 비만대조군과 신약 비만 모델의 체중과 식이효율을 먼저 비교해보면, 체중 증가의 경우 비만대조군에서 실험기간 동안 평균 18.8g 증가한 반면, 신약 모델에서는 평균 16.2g 증가하여 약 16.04%의 체중증가율 감소를 보였다. 또한 식이효율의 경우에도 비만대조군은 크게 증가한 반면, 신약 비만 모델에서는 일반대조군과 큰 차이가 없을 정도로 낮았는데 이는 식이 섭취량이 신약 비만모델에서 비만 대조군의 2배 이상으로 증가한 반면 체중증가는 오히려 감소했기 때문이다.
- 이는 섭취량에 비해 체내에 저장되는 양이 적다는 의미로 설명할 수 있다. 또한 mRNA 유전자 발현에서 요산 배설 및 대사증후군 발현과 연관 있는 GLUT-9 유전자 발현이 유의하게 감소하였으며 비만으로 인한 지방조직에서 분비되는 만성 염증 물질인 IL-6의 발현 증가 또한 확인되어, 동일한 비만상태에서도 신약 비만 모델에서 요산 배설대사의 장애와 만성 염증의 심화가 더 심하게 나타날 수 있다는 것이다.
- 종합해보면, 신약 비만 모델은 동일한 고지방식이섭취 기간 동안 섭취량은 오히려 많았으나 체중 증가율은 비만대조군에 비해 적었다. 또한 지질대사에서 저밀도콜레스테롤 및 중성지방의 증가율 또한 유의하게 적었다. 반면에 혈중 glucose의 증가율은 비만대조군에 비해 크게 나타났다.
- 이중 IL-6의 경우, 지방조직에서 전신적으로 방출되어 혈중 유리지방산의 농도 상승을 촉진하고 인슐린 저항성을 유발한다33). 본 연구에서 신약 비만 모델이 비만대조군에 비해 통계적으로 유의하게 IL-6의 발현이 증가한 것을 확인하였다(Fig. 12). 이 발현의 증가가 의미하는 것은, 신약 비만 모델에서는 동일한 체중에서도 비만으로 인한 만성 염증 상태가 더 심하게 나타난다는 것을 의미한다.
- 방출된 유리지방산은 간세포 내로 유입되어 VLDL 중성지방의 생성을 증가시키고,말초로 유입되어 근육에서의 포도당 흡수를 저하시켜고혈당을 유발한다24-26). 본 연구에서는 고지방식이의 섭취량이 많았던 신약 비만 모델에서 저밀도 콜레스테롤과 중성지방의 증가율은 오히려 비만대조군에 비해 적으나, 혈중 glucose의 농도는 상승하여 지방대사보다는 당대사의 이상이 더 예민하게 나타난 것으로 관찰되었다.
- 또한 반대로 인슐린의 혈중 증가는 신장에서의 요산 배설을 방해하는 등 대사증후군의 발병과 밀접한 연관을 지닌다29-30). 본 연구에서는 신약 비만 모델에서 비만대조군에 비해 GLUT-9의 유전자 발현 정도가 유의하게 감소하여,장내와 신장에서의 요산 배설대사에도 영향을 끼치는 것으로 확인되었다.
- 실험 결과 IL-6는 HFD-CTL와 비교하여 통계적으로 유의하게 유전자 발현이 높게 나타났다(p<0.01).
- 실험 결과 요산 순환 및 배설 대사와 관련있는 GLUT-9 유전자 발현은 HFD-CTL군보다 유의하게 감소하였다(p<0.05).
- 실험군의 신장조직에서 PCR 증폭법을 사용하여 mRNA 유전자 발현량을 비교하였다. 요산 대사와 관련된 GLUT-9 유전자 발현이 신약 비만 모델에서 비만대조군보다 유의하게 감소하였다(p<0.05).사이토카인(cytokine)의 일종인 Interleukin-6(IL-6)의 경우 신약 비만 모델이 비만대조군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.
- 종합해보면, 신약 비만 모델은 동일한 고지방식이섭취 기간 동안 섭취량은 오히려 많았으나 체중 증가율은 비만대조군에 비해 적었다. 또한 지질대사에서 저밀도콜레스테롤 및 중성지방의 증가율 또한 유의하게 적었다.
- 중성지방(Triglyceride) 또한 UUO_HFD-CTD군이 HFD-CTD군에 비해 통계적으로 유의하게 적은 상승경향을 나타났다(p<0.005)(Fig. 8.)
- 혈액화학적 검사 결과를 살펴보면, 고지방식이 투여 후 비만대조군과 신약 비만 모델 모두 저밀도 콜레스테롤 및 중성지방이 상승하였으나, 신약 비만 모델에서 비만대조군에 비해 유의하게 상승의 저하 소견을 보였다(Fig. 7-8). 혈중 glucose의 경우 비만대조군에 비해 신약 비만 모델에서 통계적으로 유의하게 상승한 소견을 보여주었다(Fig.
후속연구
- 229)이 높게 나타났다. 이것은 사상체질에 따라 대사증후군 인자들의 취약도와 위험도가 다를 수 있음을 시사하며, 吸聚之氣의 과다로 비만이 好發되는 것으로 알려져 있는 태음인 이외의 체질에 대한 연구도 필요함을 시사한다. 이에 본 연구에서는 태음인 다음으로 비만 및 대사증후군 환자의 분포가 비슷하게 나타난 소음인・소양인 중 소양인에 대한 연구를 위해 동물모델 개발을 하였다.
- 그러나 상기 모델의 소증을 단순히 가정하여 추론해보면, 일반 비만대조군보다 만성 염증상태가 심화되는 상황이나 요산 배설대사의 장애가 나타나는 것을 熱證의 심화로 봤을 때 제어되지 못한 수곡열기가 腎局의 腎・大腸을 상하게 하는 소양인 裏熱證의 소증과 유사하게 가정한 비만 소증모델로 설명할 수 있을 것 같다. 이에 상기 연구에서 나온 지질대사 및 당대사 결과에 대한 인슐린 저항성 혹은 대사증후군 유전 인자들에 대한 추가적인 연구 혹은 상기 모델에서 나타난 요산 배설인자 관련 GLUT-9의 감소 등 유의한 인자들에 대한 체질 임상연구를 통하여 모델 자체의 유의성에 대한 확인이 필요할 것으로 보인다. 재현하기 힘든 체질 동물 모델에 대하여 새로운 관점으로 모델 개발을 접근해 봤다는 1차적 의의를 찾을 수 있으며 추후 추가적인 연구가 필요할 것으로 기대된다.
- 이에 상기 연구에서 나온 지질대사 및 당대사 결과에 대한 인슐린 저항성 혹은 대사증후군 유전 인자들에 대한 추가적인 연구 혹은 상기 모델에서 나타난 요산 배설인자 관련 GLUT-9의 감소 등 유의한 인자들에 대한 체질 임상연구를 통하여 모델 자체의 유의성에 대한 확인이 필요할 것으로 보인다. 재현하기 힘든 체질 동물 모델에 대하여 새로운 관점으로 모델 개발을 접근해 봤다는 1차적 의의를 찾을 수 있으며 추후 추가적인 연구가 필요할 것으로 기대된다.
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