제주도 양식 넙치(Paralichthys olivaceus)에서 분리한 병원균 3종에 대한 Mixed Oxidant 및 차아염소산나트륨 살균효과 Effect of Mixed Oxidants and Sodium Hypochlorite on Pathogenic Microorganisms in Olive flounder Paralichthys olivaceus Aquaculture on Jeju Island원문보기
Marine pathogenic bacteria, such as Streptococcus parauberis, Edwardsiella tarda and Vibrio harveyi, can cause lethal infections in farmed fish, ozone and antibiotics, are employed to sterilize waters used for rearing fish to mitigate this threat. The most widely used method is treatment with sodium...
Marine pathogenic bacteria, such as Streptococcus parauberis, Edwardsiella tarda and Vibrio harveyi, can cause lethal infections in farmed fish, ozone and antibiotics, are employed to sterilize waters used for rearing fish to mitigate this threat. The most widely used method is treatment with sodium hypochlorite solution. However, the maintenance of a constant concentration of chlorine in rearing waters can be difficult. We investigated the potential of a mixed oxidant (MO) solution generated by electrolysis of sea water to improve water quality. We measured the survival rates of fish pathogenic bacteria exposed to different concentrations of MO (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 MO) and sodium hypochlorite (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 ppm) for various lengths of time (0, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min). We found a time-dependent decrease in the survival rates of the tested pathogenic microorganisms. The sterilization effect of the MO solution on pathogenic organisms was greater than that of sodium hypochlorite for gram-negative and gram-positive bacteria. We conclude that MO solution produced by electrolysis could be used to maintain a constant chlorine concentration in aquaculture systems.
Marine pathogenic bacteria, such as Streptococcus parauberis, Edwardsiella tarda and Vibrio harveyi, can cause lethal infections in farmed fish, ozone and antibiotics, are employed to sterilize waters used for rearing fish to mitigate this threat. The most widely used method is treatment with sodium hypochlorite solution. However, the maintenance of a constant concentration of chlorine in rearing waters can be difficult. We investigated the potential of a mixed oxidant (MO) solution generated by electrolysis of sea water to improve water quality. We measured the survival rates of fish pathogenic bacteria exposed to different concentrations of MO (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 MO) and sodium hypochlorite (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 ppm) for various lengths of time (0, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min). We found a time-dependent decrease in the survival rates of the tested pathogenic microorganisms. The sterilization effect of the MO solution on pathogenic organisms was greater than that of sodium hypochlorite for gram-negative and gram-positive bacteria. We conclude that MO solution produced by electrolysis could be used to maintain a constant chlorine concentration in aquaculture systems.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구에서는 양식어류의 질병차단을 위한 방법으로 차아염소산나트륨 및 전기분해장치에서 발생한 mixed oxidant (MO)에 따른 사육수의 살균능을 파악하여 사육수의 살균 효과를 검정하고자 제주도 양식장에서 가장 흔히 발생하는 병원성 질병원인균을 분리 배양한 후 실험을 실시하였다.
제안 방법
0 ppm 차아염소산나트륨 희석액을 만들었다. MO는 전기분해장치(대봉LF)를 사용하여 해수를 전기분해하여 만들었으며, 약 1,000 MO가 포함된 전기분해 해수를 멸균해수에 희석하여 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 MO를 차아염소산나트륨과 동량 처리하여 실험에 사용하였다.
MO와 차아염소산나트륨을 각각의 병원성세균과 반응을 시켰을 때 보다 병원균의 용균현상 및 세포표면의 변형을 유발에 따른 농도 변화를 조사하였다. 그 결과, 병원균에 MO 및 차아염소산나트륨 희석액을 첨가하였을 경우, 시간의 경과에 따라 농도가 점점 낮아지는 결과를 나타났으나, MO의 경우에는 그 농도가 차아염소산나트륨 실험군에 비교하여 지속적으로 높은 농도를 유지하는 것으로 나타났다(Fig.
5% NaCl와 대조구로서 PBS를 사용하였으며, 실험군으로 2% sodium thiosulfate 이용하였다. 중화제를 첨가한 후 5분 단위로 30분간 측정하여 잔류 염소 농도를 chlorine pocket photometer (Hach inc., USA)를 이용하여 측정하여 본 실험에서 염소 중화의 목적으로 효과적인 중화제를 검토하였다.
차아염소산나트륨 희석액은 sodium hypchlorite solution 4.00-4.99% (Sigma aldrich, USA)를 멸균해수와 혼합하여 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 ppm 차아염소산나트륨 희석액을 만들었다. MO는 전기분해장치(대봉LF)를 사용하여 해수를 전기분해하여 만들었으며, 약 1,000 MO가 포함된 전기분해 해수를 멸균해수에 희석하여 0.
대상 데이터
MO는 지속적인 살균효과를 가지고 있어 생물독성을 유발할 수 있으므로 이를 제거하기 위하여 염소의 중화제로 일반적으로 사용되는 것으로 알려진 1.5% NaCl와 대조구로서 PBS를 사용하였으며, 실험군으로 2% sodium thiosulfate 이용하였다. 중화제를 첨가한 후 5분 단위로 30분간 측정하여 잔류 염소 농도를 chlorine pocket photometer (Hach inc.
실험 균주는 제주도 소재 양식장에서 외견상 질병에 감염된 것으로 추정되는 넙치에서 분리 배양한 병원균을 확인하기 위하여 brain heart infusion (BHI, Difco, USA), salmonella-shigella (SS, Difco, USA) 및 thiosulfate citrate bile salts sucrose(TCBS, Difco, USA) 세균 분리용 평판배지에 시료의 환부와 신장, 비장 등 내부 장기를 도말하였고, 균의 배양은 300 mL의 삼각플라스크에 접종한 후, 25℃로 유지되는 배양기에서 48시간 배양하였다. 유기물의 영향에 의한 실험 결과의 오차를 최소화하기 위하여 각 세균 배양액을 멸균된 원심분리용 튜브에 넣고 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 균체를 모은 다음 멸균된 생리식염수로 현탁하는 조건으로 3회 반복하여 균체를 수세하였다.
데이터처리
MO 및 차아염소산나트륨 처리에 따른 병원균의 살균능력 결과는 SPSS version 21 (SPSS Inc., USA)을 활용하여 One-way ANOVA-test로 통계 분석을 실시하였다. 데이터 값의 유의차는 Duncan’s multiple test 사후분석을 실시하여 측정하였으며, P<0.
, USA)을 활용하여 One-way ANOVA-test로 통계 분석을 실시하였다. 데이터 값의 유의차는 Duncan’s multiple test 사후분석을 실시하여 측정하였으며, P<0.05에서 유의성을 판단하였다.
증폭된 16S rDNA는 염기서열 결정은 ㈜SolGent에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 염기서열은 미국 국립생물정보센터 NCBI (national center for biotechnology information)의 BLAST (basic local alignment search tool) search program에서 Genbank database와 Ez Taxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)의 database를 이용하여 유사한 염기서열을 비교하였으며 근연 속 또는 종으로 나타나는 서열을 확인하였다. 결정된 염기서열과 database에서 확인한 표준 미생물 염기서열을 clustal W software로 multiple alignment를 수행하였다.
이론/모형
MO 및 차아염소산나트륨을 농도 및 시간(0, 5, 10, 15, 20, 25 및 30분)별 정치 후 실험균의 생균수의 변화를 측정하기 위하여 agar plating법으로 측정하였다. 반응 종료 후 실험균 부유액을 멸균 phosphate buffer saline (PBS)로 연속 희석한 후 BHI agar에 100 μL씩 떨어뜨리고 멸균된 삼각스프레더로 도말하여 25℃에서 24시간 배양한 다음 배지에 형성된 실험균의 colony를 mL당 반응균의 수로 측정하였다.
병원세균 첨가에 따른 MO 및 차아염소산나트륨의 각 시간 별 유효농도는 발색법을 원리로 하는 chlorine pocket photometer(Hach inc., USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 본 실험에서 염소희석에 사용한 멸균해수가 염소농도에 관여하는지 추가적으로 측정을 실시하였다.
성능/효과
tarda과 그람양성균인 S. parauberis 모두에서 높은 살균능을 가지는 결과를 보였다. 따라서 해양 내 잠재적으로 포함된 유입수를 살균시에 전기분해수를 이용한 MO의 사용이 차아염소산나트륨보다 효과적인 것으로 판단된다.
tarda 와 그람양성균인 S. parauberis에서 모두 높은 MO에 대한 살균능이 나타나 균의 차이에 따른 살균능의 유의한 차이는 나타내지 않는 것으로 나타났다(Fig. 1-3).
MO와 차아염소산나트륨을 각각의 병원성세균과 반응을 시켰을 때 보다 병원균의 용균현상 및 세포표면의 변형을 유발에 따른 농도 변화를 조사하였다. 그 결과, 병원균에 MO 및 차아염소산나트륨 희석액을 첨가하였을 경우, 시간의 경과에 따라 농도가 점점 낮아지는 결과를 나타났으나, MO의 경우에는 그 농도가 차아염소산나트륨 실험군에 비교하여 지속적으로 높은 농도를 유지하는 것으로 나타났다(Fig. 4, 5).
parauberis 모두에서 높은 살균능을 가지는 결과를 보였다. 따라서 해양 내 잠재적으로 포함된 유입수를 살균시에 전기분해수를 이용한 MO의 사용이 차아염소산나트륨보다 효과적인 것으로 판단된다.
, 2003), 본 실험에서는 2% sodium thiosulfate의 처리에 의해 4Cl2 + 5H2O + Na2S2O3 → 8HCl + H2SO4 + Na2SO4의 반응이 유도되어 MO 희석액에 첨가 후 5초 이내에 잔류 염소가 검출되지 않았다. 따라서, MO의 중화제로서는 기존에 사용되어진 1.5% NaCl 보다 2% sodium thiosulfate가 보다 더 적합한 것으로 판단되어졌다.
또한 본 연구에서 중화제로 사용된 Sodium thiosulfate 자체가 살균효과를 가질 수 있으므로 이에 대한 살균능을 조사한 결과, Sodium thiosulfate는 V. harveyi, E. tarda 및 S. parauberis에 살균능에 영향이 없는 것으로 나타났다(data not shown).
이와 같은 염소 농도 감소 현상이 병원성균이 아닌 환경수로 사용한 멸균 해수에 의하여 일어나는지를 조사한 결과, 멸균해수는 염소농도 저하에 관여하지 않는 것으로 관찰되었다(Data not shown). 이상의 결과로 MO가 차아염소산나트륨에 비교하여 사육수 중에 오랫동안 남게 되어 살균효과가 더 커지는 것으로 추정된다.
이상의 결과를 종합해보면, 본 연구에서 MO가 차아염소산나트륨보다 유효 염소농도가 시간이 경과함에 따라 높게 유지되며, 유효 염소농도 또한 높아 차아염소산나트륨보다 MO에서 병원균 3종에 대하여 살균능이 높게 나타나는 경향을 보였으며, 그람음성균인 V. harveyi 및 E.
, 2005). 이에 본 실험에서 넙치에게 주로 발생되는 병원균에 대하여 일반적으로 사용하는 염소 종인 차아염소산나트륨과 전기분해를 통해 생성된 복합적인 염소종이 포함된 MO를 처리 하였을 때 비교한 결과 차아염소산나트륨보다 MO가 병원균에 대하여 효과적으로 살균하는 것으로 관찰되었다(Fig. 1-3).
제주 양식 넙치의 연간 생산량은 2010년 21,370톤에 비해 2015년에는 21배나 증가한 27,142톤으로 해마다 증가하는 추세로 생산량이 증가함에 따라 제주 양식 넙치의 연간 폐사량 또한 2010년 4,519톤에 비해 2015년에는 53.31배 증가한 6,928톤으로 해마다 증가하고 있는 추세이다. 이에 따라 양식 넙치의 폐사로 인한 경제적 피해액은 2010년 294억원에서 2015년 529억원으로 79.
후속연구
1-3). 이러한 결과는 사용 균주의 종에 따라 실험 결과가 달라질 수 있으므로 균의 종류에 따른 살균능의 변화는 지속적인 연구가 진행되어져야 할 것으로 여겨진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
차아염소산나트륨 살균제는 어디에 사용되는가?
일반적인 수질의 살균을 위해서는 UV나 오존 처리 이외에 주로 염소 살균제인 차아염소산나트륨이 사용되고 있는데 이 방법은 주로 물이 유동적이지 않은 수영장, 식음수 살균 등에 주로 사용되고 있다(Matsunaga et al., 2000; Li et al.
해양에 존재하는 병원균이 양식장으로 유입되는 과정에서 살균하는 사육 수의 관리방법이 주목받고 있는 이유는 무엇인가?
이러한 직접적인 투여 방법은 대상 수산생물의 체표, 아가미 및 체내에서 발생되는 질병에 치유효과가 크나, 고농도 처리 시에는 어체 내 스트레스로 작용할 수 있는 것으로 알려져 있다(Barton and Iwama, 1991; Pickering, 1992). 반면, 간접적으로 해양에 존재하고 있는 병원균이 양식장으로 유입되는 과정에서 살균을 하는 사육 수의 관리방법은 2차적 오염 가능성이 적고, 스트레스 유발이 낮아 질병 예방 및 치료방법으로 주목받고 있다.
전기분해장치에서 발생한 MO를 이용한 살균효과는 차아염소산나트륨에 비하여 어떠한 특성을 나타내는가?
이상의 결과를 종합해보면, 본 연구에서 MO가 차아염소산나트륨보다 유효 염소농도가 시간이 경과함에 따라 높게 유지되며, 유효 염소농도 또한 높아 차아염소산나트륨보다 MO에서 병원균 3종에 대하여 살균능이 높게 나타나는 경향을 보였으며, 그람음성균인 V. harveyi 및 E. tarda과 그람양성균인 S. parauberis 모두에서 높은 살균능을 가지는 결과를 보였다. 따라서 해양 내 잠재적으로 포함된 유입수를 살균시에 전기분해수를 이용한 MO의 사용이 차아염소산나트륨보다 효과적인 것으로 판단된다.
참고문헌 (46)
Alvarez JJ, Austin B, Alvarze AM and Reyes H. 1998. Vibrio harveyi: A pathogen of penaeid shirimps and fish in Venezuela. J Fish Dis 21, 313-316. https://doi.org/10.1046/j.1365-2761.1998.00101.x.
Ann k and Rimstad E. 2001. Inactivation of infectious salmon virus, viral haemorrhagic septicaemina virus and infectious pancreatic necrosis virus in water using UVC irradiation. Dis Aqua Org 48, 1-5. https://doi.org/10.3354/dao048001.
Baeck GW, Kim JH, Gomez DK and Park SC. 2006. Isolation and characterization of Streptococcus sp. from diseased flounder (Paralichthys olivaceus) in Jeju island. J Vet Sci 7, 53-58. https://doi.org/10.4142/jvs.2006.7.1.53.
Barton BA and Iwama GK. 1991. Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids. Annu Rev Fish Dis 1, 3-26. https://doi.org/10.1016/0959-8030(91)90019-g.
Blaser MJ, Smith PF, Wang WLL and Hoff JC. 1986. Inactiviation of campylobacter jejuni by chlorine and monochloramine. Appl Environ Microbiol 51, 307-311.
Boylan JA, Lawrence KA, Downey JS and Gherardini FC. 2008. Borrelia burgdorferi membranes are the primary targets of reactive oxygen species. Mol Microbiol 68, 786-799. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2008.06204.x.
Diao HF, Li XY, Gu JD, Shi HC and Xie ZM. 2004. Electron microscopic investigation of the bactericidal action of electrochemical disinfection in comparison with chlorination, ozonation and fenton reaction. Process Biochem 39, 1421-1426. https://doi.org/10.1016/S0032-9592(03)00274-7.
Drees KP, Abbaszadegan M and Maier RM, 2003. Comparative electrochemical inactivation of bacteria and bacteriophage. Water Res 37, 2291-2300. https://doi.org/10.1016/S0043-1354(03)00009-5.
Fang Q, Shang C and Chen G. 2006. MS2 inactivation by chloride-assisted electrochemical disinfection. J Environ Eng 132, 13-22. https://doi.org/10.1061/(asce)0733-9372(2006)132:1(13).
Hwang SD, Woo SH, Kim SH, Ha SJ, Jung YE and Park SI. 2008. Immunomodulatory characteristics of Streptococcus parauberis isolated from infected olive flounder, Paralichthys olivaceus. J Fish Pathol 21, 157-166.
Jorquera MA., Valencia G, Eguchi M, Katayose M and Riquelme C. 2002. Disinfection of seawater for hatchery aquaculture systems using electrolytic water treatment. Aquaculture 207, 213-224. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(01)00766-9.
Joshi SG, Cooper M, Yost A, Paff M, Ercan UK, Fridman G, Friedman G, Fridman A and Brooks AD. 2011. Nonthermal dielectric-barrier discharge plasma-induced in activation involves oxidative DNA damage and membrane lipid peroxidation in Escherichia coli. Antimicrob Agents and Chemother 55, 1053-1062. https://doi.org/10.1128/aac.01002-10.
Kang CY, Kang BJ, Moon YG, Kim KY and Heo MS. 2007. Characterization of Streptococcus parauberis isolated from cultured olive flounder, Paralichthys olivaceus in the Jeju Island. J Fish Pathol 39, 56-61.
Kerwick MI, Reddy SM, Chamberlain AHL and Holt DM. 2005. Electrochemical disinfection, an environmentally acceptable method of drinking water disinfection?. Electrochim Acta 50, 5270-5277. https://doi.org/10.1016/j.electacta.2005.02.074.
Kim JW, Cho MY, Park GH, Won KM, Choi HS, Kim MS and Park M. 2010. Statistical data on infectious diseases of cultured olive flounder Paralichthys olivaceus from 2005 to 2007. J fish pathol 23, 369-377.
Kim JW, Lee HN, Jee BY, Woo SH, Kim YJ and Lee MK. 2012. Monitoring of the mortalities in the aquaculture farms of south korea. J Fish Pathol 25, 271-277. https://doi.org/10.7847/jfp.2012.25.3.271.
Lane DJ. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Stackebrandt, E and Goodfellow M, Eds. 115-175.
Lee CH, Kim PY, Ko CS, Oh DC and Kang BJ. 2007. Biological characteristics of Streptococcus iniae and Streptococcus parauberis isolated from cultured flounder, Paralichthys olivaceus in Jeju. J Fish Pathol 20, 33-40.
Lee SJ, Lee DC, Kim H and Lee H. 2002. Comparison of chlorine, chlorine dioxide and ozone as disinfectants in drinking water. Kor J Env Hlth Soc 28, 1-8.
Letux F and Meyer FP. 1972. Mixture of malachite green and formaline for controling Ichthyophthirius and other protozoan parasites of fish. Prog Fish Cult 34. 21-26. https://doi.org/10.1577/1548-8640(1972)34[21:momgaf]2.0.co;2.
Li XY, Ding F, Lo PSY and Sin SHP. 2002. Electrochemical disinfection of saline wastewater effluent. J Environ Eng 128, 697-704. https://doi.org/10.1061/(asce)0733-9372(2002)128:8(697).
Ludwig W. 2007. Nucleic acid techniques in bacterial systematics and identification. Int j food microbiol 120, 225-236. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.06.023.
Martinez-Huitle CA and Enric B. 2008. Electrochemical alternatives for drinking water disinfection. Angew Chem Int Ed. 47, 1998-2005. https://doi.org/10.1002/anie.200703621.
Matsunaga T, Nakasono S, Kitajima Y and Horiguchi K. 1994. Electrochemical disinfection of bacteria in drinking water using activated carbon fibers. Biotechnol Bioeng 43, 429-433. https://doi.org/10.1002/bit.260430511.
Matsunaga T, Okochi M, Takahashi M, Nakayama T, Wake H and Nakamura N. 2000. TiN electrode reactor for disinfection of drinking water. Water Res 34, 3117-3122. https://doi.org/10.1016/s0043-1354(00)00066-x.
Merrell BR, Walker BI and Coolbaugh JC. 1981. Campylobacter fetus ss. Jejuni, a newly recognized enteric pathogen: morphology and intestinal colonization. Scanning Electron Microse 4, 125-131.
MOMAF (Ministry of Maritime Affairs and Fisheries). 1998. Statistical yearbook of maritime affairs and fisheries. Ministry of Maritime Affairs and Fisheries, Seoul, Korea.
Nakayama T, Wake H, Ozawa K, Kodama H, Nakamura N and Matsunaga T. 1998. Use of a titanium nitride for electrochemical inactivation of marine bacteria. Environ Sci Technol 32, 798-801. https://doi.org/10.1021/es970578h.
NFRDI (National Fisheries Research and Development Institute). 2015. Prevention of bacterial fish disease and medical treatment for produce health fish. National Fisheries Research and Development Institute, Busan, Korea.
Nguyen HT and Kanai K. 1999. Selective agars for the isolation of Streptococcus iniae from Japanese flounder, Paralichthys olivaceus and its cultural environment. J Appl Microbiol 86, 769-776. ttps://doi.org/10.1046/j.1365-2672.1999.00724.x.
Palumbo SA. 1984. Heat injury and repair in Campylobacter jejuni. Appl Envirion Microbiol 48, 477-480.
Park KH, Oh MJ and Kim HY. 2003. Disinfection effect of chlorine dioxide on pathogenic bacteria. J aquaculture 16, 118-123. https://doi.org/10.1002/0471263397.env295.
Patermarakis G and Fountoukidis E. 1990. Disinfection of water by electrochemical treatment. Water Res 24, 1491-1496. https://doi.org/10.1016/0043-1354(90)90083-i.
Raphael D, Wong TA, Moodnik R and Borden BG. 1981. The effect of temperature on the bactericidal efficiency of sodium hypochlorite. J Endod 7, 330-334. https://doi.org/10.1016/s0099-2399(81)80101-x.
RhamanSME Ding T and Oh DH. 2010. Effectiveness of low concentration electrolyzed water to inactive foodborne pathogens under different environmental conditions. Int J Food Microbiol 139, 147-153. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.03.020 .
Speare DJ, Goff G, MacIsaac P, Wechrkiwsky J and MacNair N. 1996. Effects of formalin and chloramine-T treatments on oxygen consumption of juvenile salmonids. J Aquatic Anim Health 8. 285-291. https://doi.org/10.1577/1548-8667(1996)008 2.3.co;2.
Statistics Korea. 2015. Aquaculture Status Survey. Statistics Korea, Daejeon, Korea.
Stoner GE, Cahen GLJ, Sachyani M and Gileadi E. 1982. The mechanism of low frequency a.c. electrochemical disinfection. Bioelectrochem Bioenerg 9, 229-24. https://doi.org/10.1016/0302-4598(82)80013-5.
Tak JK and Park JW. 2009. The use of ebselen for radioprotection in cultured cells and mice. Free Radic Biol Med 46, 1177-1185. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2009.01.023.
Tanaka T, Shimoda M, Hosokawa M, Taguchi T Wake H and Matsunaga T. 2013. Electrochemical disinfection of fish pathogens in seawater without the production of a lethal concentration of chlorine using a flow reactor. J biosci bioeng 116, 480-484. https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2013.04.013.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.