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문제 정의
- 본 연구는 밤나무 근권토양에서 분리한 C. destructans를 재분류하고, 이들 분리균의 병원성 검정을 통해 인삼에 대한 발병여부를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- , 2013)을 이용하여 alignment를 실시하여 일치하지 않은 염기서열은 분석에서 제외하였다. 1,000 회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였으며, 새롭게 종이 분류된 I. radicicola species complex를 대조균주의 DNA 염기서열로 사용하였다 (Cabral et al., 2012).
- PCR 검출을 통해 병원균의 존재가 확인된 토양으로부터 균주를 분리하기 위하여 토양 시료 1,000 배 희석액 100 ㎕를 반선택배지 [czapek solution agar 49 g, pentachloronitrobenzene(PCNB) 0.5 g, difenoconazol 2 ㎎, chloramphenicol 0.2 g,azoxystrobin 1 ㎎)에 도말을 하였고, 암조건하에서 15℃, 21 일간 보관하였다. 그 후 배지에 유도된 colony 중 형태학적으로 인삼뿌리썩음병균과 유사한 균사를 potato dextorse agar(Difco Laboratories Inc.
- PDA 배지에 분리된 I. radicicola 균주를 14 일간 20℃에서 배양하였으며, 배양된 균사는 40 ㎖의 멸균수를 넣고 마쇄하여 현탁액을 만든 다음, 묘삼을 배양현탁액에 침지시킨 후예정지 관리를 한 충남 금산에 위치한 인삼약초연구소에서 묘삼을 이식하고 그 병원성 정도를 확인하였다.
- 공주 5 곳의 밤나무 포장으로부터 각각 20 개의 밤나무 근권토양 시료를 채집하여 Ilyonectria radicicola가 존재하는 토양을 선발하고 병원균을 얻기 위하여 nested PCR 방법을 활용해 PCR 검정을 수행하였다 (Fig. 1).
- 균사를 수확하여 동결건조시켜 마쇄한 후, proteinase K(50 ㎕)와 extraction buffer [200 mM NaCl, 30 mMEDTA, 200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% SDS]를 넣고, 2× CTAB solution [2% CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0),1% PVP, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA]를 첨가하였다.
- 2 g,azoxystrobin 1 ㎎)에 도말을 하였고, 암조건하에서 15℃, 21 일간 보관하였다. 그 후 배지에 유도된 colony 중 형태학적으로 인삼뿌리썩음병균과 유사한 균사를 potato dextorse agar(Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA)에 각각 단균사를 떼어 재분리하였으며, 추후 정확한 종 동정을 위해 DNA를 분리하여 histone h3 영역의 염기서열 분석에 사용하였다.
- 또한 인삼에서 분리된 I. mors-panacis CY8005 균주와 I.cyclaminicola CY8073 균주를 대조균주로 사용하여 병원성의 차이를 확인하였다.
- 밤나무 근권토양 분리균과 인삼에서 분리된 CY8005,CY8014, CY8073 균주의 histone h3 영역을 PCR 증폭을 위하여 제작된 CYLH3F와 CYLH3R primer를 이용하여 PCR을 수행하였다 (Crous et al., 2004).
- 밤나무 근권토양에서 I. radicicola의 존재를 확인한 토양으로부터 반선택배지를 이용하여 균 분리를 하였으며 (chestnut 7, 11, 12, 17, 18 and 24), histone h3 영역의 유연관계분석을 실시하여 종 동정을 실시하였다 (Fig. 2.)
- 밤나무 근권토양에서 분리된 I. radicicola 균주는 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)에 대한 병원성 유무 및 그 차이를 알아보기 위하여 묘삼을 이용하여 병원성 검정를 실시하였다.
- 밤나무 근권토양에서 얻은 C. destructans 균주들의 genomic DNA 분리를 위해 PDA 배지에 분주하여 20℃, 암조건에서 정치 배양하였다.
- 밤나무 근권토양으로부터 균을 분리하기 위하여 충남 공주 5 개 지역의 밤나무 포장에서 각각 20 개씩, 총 100 개의 토양시료를 채집하였다. 이들을 nested PCR (first round; ITS 1, 4 primer set, second round; dest 1, 4 primer set) 방법을 이용한 PCR 분석으로 토양 내 인삼뿌리썩음병균 (C.destructans)의 존재를 확인하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 Macrogen (Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰한 후, 미국 국립생물정보센터 (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용하여 NCBI에 등록된 병원균의 염기서열과 비교하였다.
- 최근 형태학적 분석과 multi-locus를 활용한 유전적 특성을 비교하여 C. destructans 그룹을 I. radicicola 그룹로 재분류하였고 이들을 다시 총 16 개의 종으로 나누었다. 또한 인삼으로부터 분리된 종으로는 I.
대상 데이터
- radicicola complex. The bootstrap analysis was performed with 1,000 replications.
- 밤나무 근권토양으로부터 균을 분리하기 위하여 충남 공주 5 개 지역의 밤나무 포장에서 각각 20 개씩, 총 100 개의 토양시료를 채집하였다. 이들을 nested PCR (first round; ITS 1, 4 primer set, second round; dest 1, 4 primer set) 방법을 이용한 PCR 분석으로 토양 내 인삼뿌리썩음병균 (C.
성능/효과
- Jang (2005)은 이들 마커를 활용하여 인삼재배 예정지의 토양으로부터 인삼뿌리썩음병균의 존재를 판단하는 시스템을 개발한 바 있다. 5 지역 밤나무 포장의 모든 곳에서 I.radicicola의 존재가 확인되었으며, 100개의 토양시료 중 35개의 토양시료에서 400 bp의 증폭산물을 나타내는 병원균의 존재를 확인할 수 있었다.
- cyclaminicola를 분리한 바 있으며, 이들로부터 병원성을 확인하였다. 또한 밤나무 근권토양에서 분리된 균주가 인삼에서 분리된 CY8014와 유전적으로 일치하는 것으로 보아 밤나무 또는 밤나무 근권토양에서 존재하는 병원균이 인삼밭으로 유입하여 인삼에 뿌리썩음병을 일으킬 수 있는 가능성을 보여주었다.
- mors-panacis로동정이 된 CY8005 균주의 경우에는 병 접종 6 주 후, 발병 도가 100%로 모두 썩은 반면 밤나무 근권토양에서 분리된 병원균들은 접종 초기에는 CY8005에 비하여 병의 진전은 없었지만, 시간이 지남에 따라 인삼에 약하게 뿌리썩음병을 일으켰다. 또한 인삼에 대하여 약병원성인 I. cyclamicicola로 분류된 CY8073과 비교하였을 때 초기 병 진전속도는 느리지만,병 접종 3 년 후에 인삼에 병을 야기하는 것을 확인하였다.
- 밤나무 근권토양으로부터 분리된 균들은 모두 새로운 분류체계에 의해 I. radicicola complex 내에 모두 포함되었으며, 시클라멘에서 분리한 I. cyclaminicola와 가장 근연의 종을 이루었다.
- , 2017). 이는 기존 인삼에서 분리된 I. mors-panacis, I. panacis, I. robusta, I. crassa등 4 종 중 하나로 인삼에 뿌리썩음병을 일으킬 수 있는 가능성이 컸지만, 이번 밤나무 근권으로부터 분리된 균 (I.radicicola complex)은 지금까지 보고된 인삼 병원균이 아님에도 인삼에 뿌리썩음병을 일으키는 것을 확인하였다.
- 포장검정을 통해 밤나무 근권토양으로부터 분리된 I.radicicola 균이 인삼에 직접 침입하여 병을 일으키는 것을 확인하였다 (Fig. 3 and 4, Table 1).
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