[논문]저온 민감성 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주에서 glycine betaine의 저온 내성에 미치는 영향에 대한 연구

김도형; 이상수

doi:10.7845/kjm.2018.8035

저온 민감성 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주에서 glycine betaine의 저온 내성에 미치는 영향에 대한 연구
Studies of cold resistant glycine betaine effect on cold sensitive Bacillus subtilis mutant strains 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.54 no.3, 2018년, pp.200 - 207

초록
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높은 염분 농도에서 glycine betaine은 Bacillus subtilis 안으로 유입되어 세포 생장이 지속될 수 있게 한다. 뿐만 아니라 최근 연구 결과에 따르면 저온에서도 glycine betaine이 세포 생장을 지속시키는 것으로 알려져 있다. 저온에서 Bacillus subtilis의 생장을 저해시키는 세포 대사 활동으로는 세포막 운송과 단백질 합성을 들 수 있다. 세포막 구조와 관련하여 저온에서 세포막 운송에 영향을 주는 유전자들로는 bkdR과 des가 있고, 단백질 합성 과정에서 RNA helicase 유전자인 ydbR과 yqfR들은 저온 민감성을 보인다. 따라서 Bacillus subtilis 저온 민감성 유전자 결손 세포들에 대한 glycine betaine의 효과를 조사하여 저온에서의 glycine betaine 생리적 기능에 대해 알아보고자 하였다. 이 결과 glycine betaine의 존재 유무에 따라 야생형 Bacillus subtilis와 ydbR과 yqfR 결손 균주의 저온생장에 큰 차이를 보였다($T_d$차이 190~686 min). 반면에 bkdR이나 des 결손균주의 경우에는 glycine betaine 존재 유무에 따라 차이를 보이지 않았다. Glycine betaine의 전구체인 choline으로 대치하여도 저온에서의 생장은 같은 결과를 보였다. Glycine betaine의 영향이 세포막 구조와 관련이 있는 유전자 bkdR과 des 결손균주에 미치는 영향이 적은 것을 알아보기 위해 세포막에 영향을 주는 세제의 효과를 조사하였다. Triton X-100과 N-lauryl sarcosine 세제에 의해 bkdR 결손 균주가 야생형에 비해 더 영향 받는 것을 확인하였고 이는 bkdR 결손이 저온에서 막 구조를 변형하여 glycine betaine의 투과에 영향을 미치는 것으로 보인다.

Abstract ▼ AI-Helper

At high salt concentration, glycine betaine is transported into Bacillus subtilis and growing rate of the cell is not suppressed. Also according to recent studies, cell growth is maintained normal growth rate at low temperature. Low temperature results in a stress response of Bacillus subtilis that is characterized by strong repression of major metabolic activities such as translation machinery and membrane transport. In this regards, genes showing cold sensitive phenotype are cold-induced DEAD box RNA helicases (ydbR, yqfR) and fatty acid desaturases (bkdR, des). Therefore to understand the effect of glycine betaine on cold growth of Bacillus subtilis, we investigated the effect of glycine betaine on growth rate of these deletion mutants showing cold sensitive phenotype. Glycine betaine strongly stimulated growth of wild type Bacillus subtilis JH642 and deletion mutants of ydbR and yqfR at $20^{\circ}C$ (190~686 min $T_d$ difference). On the other hands, glycine betaine does not show growth promoting effects on deletion mutants of bkdR, and des at cold conditions. Same cold protectant growth results were shown with the precursor choline instead of glycine betaine. We investigated the effects of detergents on the cell membrane in bkdR and des deficient strains associated with cell membrane. It was identified that bkdR deficient strain shows retarded growth with detergent such as Triton X-100 or N-lauryl sarcosine compared with wild type cell. Thus, it is possible that deletion mutation of bkdR modifies membrane structure and effects on transport of glycine betaine.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

Glycine betaine의 전구체인 choline으로 대치하여도 저온에서의 생장은 같은 결과를 보였다. Glycine betaine의 영향이 세포막 구조와 관련이 있는 유전자 bkdR과 des 결손 균주에 미치는 영향이 적은 것을 알아보기 위해 세포막에 영향을 주는 세제의 효과를 조사하였다. Triton X-100과 N-lauryl sarcosine 세제에 의해 bkdR 결손 균주가 야생형에 비해 더 영향 받는 것을 확인하였고 이는 bkdR 결손이 저온에서 막 구조를 변형하여 glycine betaine의 투과에 영향을 미치는 것으로 보인다.
세포막 구조와 관련하여 저온에서 세포막 운송에 영향을 주는 유전자들로는 bkdR과 des가 있고, 단백질 합성 과정에서 RNA helicase 유전자인 ydbR과 yqfR들은 저온 민감성을 보인다. 따라서 Bacillus subtilis 저온 민감성 유전자 결손 세포들에 대한 glycine betaine의 효과를 조사하여 저온에서의 glycine betaine 생리적 기능에 대해 알아보고자 하였다. 이 결과 glycine betaine의 존재 유무에 따라 야생형 Bacillus subtilis와 ydbR과 yqfR 결손 균주의 저온생장에 큰 차이를 보였다(Td차이 190~686 min).
Choline은 glycine betaine의 전구물질로 작용하며 Bacillus subtilis 세포 내로 흡수되어 glycine betaine을 생합성 하는데 이용된다. 따라서 choline을 배양액에 첨가하여 glycine betaine과 같은 효과가 일어나는지 알아보고자 하였다. 저온에서 choline이 Bacillus subtilis 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 저온 민감성 유전자 bkdR과 des가 결손된 균주와 야생형 균주 JH642를 20°C에서 SMM broth로 진탕 배양하여 생장을 측정하였다.
, 2006). 따라서 저온 민감성 돌연변이로 세포막의 지질 성분과 관련이 있는 유전자로 bkdR과 des와 RNA 구조 형성과 관련이 있는 RNA helicase 유전자인 ydbR과 yqfR을 대상으로 glycine betaine의 효과를 조사하였다.
이와 같은 glycine betaine의 저온에서의 역할에 대하여 알아보기 위하여 야생형 Bacillus subtilis와 저온에 민감한 생장을(37°C에서 15~20°C로 온도 변화에 민감성을 보이는 생장) 보이는 여러 돌연변이 균주들을 대상으로 저온 조건에서 glycine betaine과 그 전구체인 choline의 효과에 대해서도 알아보고자 하였다.

제안 방법

Bacillus subtilis JH642로 유전자 결손 돌연변이체를 제조하는 방법으로 LFH (Long-flanking homology) PCR을 이용하였다(Kim and Lee, 2018). JH642 유전체 DNA를 주형으로 PCR하여 각각의 up-stream, down-stream, 항생제 저항성 cassette 부분의 DNA를 합성한다(Table 1). 첫 번째 PCR에서 얻은 각 upstream, cassette, down stream의 비율은 1:2:1로 넣고 프라이머로는 upstream F와 downstream R을 사용하여 두 번째 PCR을 수행한다.
이는 결과적으로 ydbR과 yqfR의 경우 RNA helicase 유전자로 RNA 구조에 영향을 주어 저온 민감성을 보이는 경우이므로 glycine betaine에 의한 생체물질 안정화로 저온에서의 생장 지속효과가 가능할 것으로 생각된다. 다른 비교대상으로 glycine betaine의 전구물질로 작용하는 choline으로 실험을 진행 해보았다. 이 역시 실험결과는 glycine betaine과 같은 결과를 보였다.
따라서 이와 같은 세제의 세포막에 대한 효과를 알아보기 위하여 LB plate의 disk에 TritonX-100, N-lauryl sarcosine (25%) 10 µl을 넣어 plate 주변의 세포 생장에 방해되는 정도를 clean zone의 크기를 비교하였다(Fig. 5).
반면에 저온 조건인 20°C에서 1 mM glycine betaine을 첨가한 것과 첨가 하지 않은 경우의 생장을 비교하였다.
세포막 운송과 관련이 있는 유전자 bkdR과 des 결손 균주에 세포막에 영향을 주는 세제의 효과를 저온에서 조사하였다. 세제인 triton X-100과 N-lauryl sarcosine에 의한 세포 사멸이 일어난 zone의 크기는 bkdR, des, 야생형 균주 순으로 관찰되었으며, bkdR과 des의 이중 돌연변이도 des 결손 단일돌연변이와 야생형에 비해 zone의 크기가 더 큰 것을 확인 할 수 있었다.
이들 유전자들의 결손은 RNA의 생체 내 구조를 형성하는데 기여하며 특히 저온에서는 이들의 역할이 리보솜이 정상적으로 작용하는 구조 형성에 중요한 역할을 한다. 이들 유전자들의 결손이 저온 조건에서 생장에 미치는 영향에 대한 glycine betaine의 효과를 알아보기 위해 저온 민감성 유전자 ydbR, yqfR 결손 균주에 glycine betaine을 첨가하여 저온 생장을 확인하였다(Fig. 4). Glycine betaine이 없을 때는 ydbR과 yqfR 결손 균주들의 T_d값이1290 min와 1584 min로 매우 느리게 생장한다.
250 ml 삼각플라스크에 SMM 배양액을 30 ml 넣은 후 각각의 삼각플라스크에 같은 양의 세포로 접종하고 20°C 조건에서 200 rpm으로 진탕 배양한다. 저온 조건에서의 세포 생장은 OD₆₀₀값을 측정하여 알아보았다.
저온 조건인 20°C에서 20 mM choline을 첨가한 것과 첨가 하지 않은 경우의 생장을 비교하였다(Fig. 3).
저온에서 choline이 Bacillus subtilis 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 저온 민감성 유전자 bkdR과 des가 결손된 균주와 야생형 균주 JH642를 20°C에서 SMM broth로 진탕 배양하여 생장을 측정하였다.
저온에서 glycine betaine의 Bacillus subtilis 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포막의 지질 성분과 관련이 있는 저온 민감성 유전자 bkdR과 des가 결손된 균주와 야생형 균주 JH642를 37°C와 20°C에서 진탕 배양하여 생장을 측정하였다.
저온에서 glycine betaine의 Bacillus subtilis 생장에 미치는 영향을 알아보기 위해 bkdR, des, ydbR과 yqfR 각각의 유전자 결손 돌연변이 균주와 야생형 균주 JH642의 20°C에서의 생장을 관찰하였다.
JH642 유전체 DNA를 주형으로 PCR하여 각각의 up-stream, down-stream, 항생제 저항성 cassette 부분의 DNA를 합성한다(Table 1). 첫 번째 PCR에서 얻은 각 upstream, cassette, down stream의 비율은 1:2:1로 넣고 프라이머로는 upstream F와 downstream R을 사용하여 두 번째 PCR을 수행한다. 이 때 반응 조건은 94°C로 30초 동안 변성시키고 30초, 55°C에서 30초 동안 annealing, 그리고 72°C 6분간 extention한다.

대상 데이터

Bacillus subtilis는 JH642 (W168 trpC2 PheA1)를 사용하였으며 SMM (Spizizen’s Minimal Media) 배지에서 배양하여 생장곡선 실험에 사용하였다.

이론/모형

Bacillus subtilis JH642로 유전자 결손 돌연변이체를 제조하는 방법으로 LFH (Long-flanking homology) PCR을 이용하였다(Kim and Lee, 2018). JH642 유전체 DNA를 주형으로 PCR하여 각각의 up-stream, down-stream, 항생제 저항성 cassette 부분의 DNA를 합성한다(Table 1).

성능/효과

Glycine betaine의 영향이 세포막 구조와 관련이 있는 유전자 bkdR과 des 결손 균주에 미치는 영향이 적은 것을 알아보기 위해 세포막에 영향을 주는 세제의 효과를 조사하였다. Triton X-100과 N-lauryl sarcosine 세제에 의해 bkdR 결손 균주가 야생형에 비해 더 영향 받는 것을 확인하였고 이는 bkdR 결손이 저온에서 막 구조를 변형하여 glycine betaine의 투과에 영향을 미치는 것으로 보인다.
이 결과 야생형 균주 JH642는 glycine betaine에 의해 저온에서 생장이 지속되는 것을 관찰 하였으나, 반면에 bkdR과 des 결실 균주에서는 glycine betaine 첨가가 저온 생장을 지속시키지 못하는 것을 확인하였다. 그리고 이를 보다 확인하기 위해 저온 민감성 유전자인 ydbR과 yqfR 결손 돌연변이를 통하여 확인해본 결과 glycine betaine을 첨가하니 이들의 생장이 지속되는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 결과적으로 ydbR과 yqfR의 경우 RNA helicase 유전자로 RNA 구조에 영향을 주어 저온 민감성을 보이는 경우이므로 glycine betaine에 의한 생체물질 안정화로 저온에서의 생장 지속효과가 가능할 것으로 생각된다.
Glycine betaine이 없을 때는 ydbR과 yqfR 결손 균주들의 T_d값이1290 min와 1584 min로 매우 느리게 생장한다. 반면에 glycine betaine이 첨가된 경우 ydbR과 yqfR 결손 균주들의 T_d값이 700 min와 898 min으로 저온에서의 생장이 지속됨을 알 수 있었다. Glycine betaine은 저온에서 단백질 등의 생체물질 안정성에 기여한다고 알려져 있다(Holtmann and Bremer, 2004, 2011).
세포막 운송과 관련이 있는 유전자 bkdR과 des 결손 균주에 세포막에 영향을 주는 세제의 효과를 저온에서 조사하였다. 세제인 triton X-100과 N-lauryl sarcosine에 의한 세포 사멸이 일어난 zone의 크기는 bkdR, des, 야생형 균주 순으로 관찰되었으며, bkdR과 des의 이중 돌연변이도 des 결손 단일돌연변이와 야생형에 비해 zone의 크기가 더 큰 것을 확인 할 수 있었다. 이로써bkdR과 des 결손은 야생형에 비하여 세포막이 세제에 의한 손상이 더 잘 일어나고 있음을 알 수 있었다.
따라서 Bacillus subtilis 저온 민감성 유전자 결손 세포들에 대한 glycine betaine의 효과를 조사하여 저온에서의 glycine betaine 생리적 기능에 대해 알아보고자 하였다. 이 결과 glycine betaine의 존재 유무에 따라 야생형 Bacillus subtilis와 ydbR과 yqfR 결손 균주의 저온생장에 큰 차이를 보였다(Td차이 190~686 min). 반면에 bkdR이나 des 결손 균주의 경우에는 glycine betaine 존재 유무에 따라 차이를 보이지 않았다.
저온에서 glycine betaine의 Bacillus subtilis 생장에 미치는 영향을 알아보기 위해 bkdR, des, ydbR과 yqfR 각각의 유전자 결손 돌연변이 균주와 야생형 균주 JH642의 20°C에서의 생장을 관찰하였다. 이 결과 야생형 균주 JH642는 glycine betaine에 의해 저온에서 생장이 지속되는 것을 관찰 하였으나, 반면에 bkdR과 des 결실 균주에서는 glycine betaine 첨가가 저온 생장을 지속시키지 못하는 것을 확인하였다. 그리고 이를 보다 확인하기 위해 저온 민감성 유전자인 ydbR과 yqfR 결손 돌연변이를 통하여 확인해본 결과 glycine betaine을 첨가하니 이들의 생장이 지속되는 것을 확인 할 수 있었다.
그리고 이를 보다 확인하기 위해 저온 민감성 유전자인 ydbR과 yqfR 결손 돌연변이를 통하여 확인해본 결과 glycine betaine을 첨가하니 이들의 생장이 지속되는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 결과적으로 ydbR과 yqfR의 경우 RNA helicase 유전자로 RNA 구조에 영향을 주어 저온 민감성을 보이는 경우이므로 glycine betaine에 의한 생체물질 안정화로 저온에서의 생장 지속효과가 가능할 것으로 생각된다. 다른 비교대상으로 glycine betaine의 전구물질로 작용하는 choline으로 실험을 진행 해보았다.
세제인 triton X-100과 N-lauryl sarcosine에 의한 세포 사멸이 일어난 zone의 크기는 bkdR, des, 야생형 균주 순으로 관찰되었으며, bkdR과 des의 이중 돌연변이도 des 결손 단일돌연변이와 야생형에 비해 zone의 크기가 더 큰 것을 확인 할 수 있었다. 이로써bkdR과 des 결손은 야생형에 비하여 세포막이 세제에 의한 손상이 더 잘 일어나고 있음을 알 수 있었다. 이는 저온에서 bkdR과 des 결손 균주세포막의 유동성이 감소되거나 불안정하여 세제의 영향이 더 잘받는 것으로 생각된다.
75 cm로 Triton X-100의 결과와 비슷한 결과를 보였다. 이와 같은 실험 결과 유전자 bkdR의 결손 균주는 세제에 불안정한 세포막 구조를 형성하는 것으로 보인다. 반면에 야생형 균주JH642와 des 결손 균주들은 세제에 민감하지 않았다.
2B and C). 이와 같이 bkdR과 des 결손 균주의 경우 저온에서 glycine betaine에 의한 생장 지속이 일어나지 않았음을 확인할 수 있었다.

후속연구

이는 저온에서 세포막 유동성 감소로 glycine betaine이 세포막 투과에 영향을 미치는 것으로 보인다. 따라서 저온 조건 bkdR 결손 균주에서는 glycine betaine의 막 통과가 잘 일어나는지 확인 할 필요가 있을 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	glycine betaine을 생산하지 못하는 Bacillus subtilis는 무엇을 통해 glycine betaine를 사용하는가?	Bacillus subtilis는 glycine betaine을 생산하지 못하고 외부로부터 흡수하여 사용하거나 전구체인 choline으로부터 합성하여 사용한다(Bremer, 2002). Glycine betaine은 3개의 삼투압 유도성 수송 시스템인 Opu 수송체가 있는데, 이들은 OpuA, OpuC, OpuD로 glycine betaine를 수송한다(Bremer and Krämer, 2000; Bremer, 2002; Ziegler, 2010).
	glycine betaine의 Bacillus subtilis 생장이 염 농도가 높은 조건에서도 가능한 이유는 무엇인가?	, 1994). 이와 같이 세포 내에 축적된 물질들은 세포의 기능이나 프로세스에 영향을 주지 않고 물이 세포 밖으로 빠져나가는 것을 억제하여 세포 내의 삼투압을 유지시킨다(Krempf and Bremer, 1998; Bremer and Krämer, 2000). 따라서 glycine betaine은 Bacillus subtilis 생장이 염 농도가 높은 조건에서도 가능하게 한다.
	Opu 수송체에 의하여 수송된 glycine betaine는 무엇으로 작용해 다양한 염 농도 조건에서도 생장이 지속되는가?	Glycine betaine은 3개의 삼투압 유도성 수송 시스템인 Opu 수송체가 있는데, 이들은 OpuA, OpuC, OpuD로 glycine betaine를 수송한다(Bremer and Krämer, 2000; Bremer, 2002; Ziegler, 2010). 이와 같이 Opu 수송체에 의하여 수송된 glycine betaine은 삼투보호제로 작용하여 다양한 염 농도 조건에서도 생장이 지속된다. 적절한 삼투보호제가 없을 경우 삼투조절이 가능한 proline를 합성한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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