[논문]패류에서 분리한 고농도 streptomycin에 대해 저항성인 대장균의 저항성 유전자

임찬석; 이영선; 강형일; 안삼영; 정재성

doi:10.7845/kjm.2018.8021

패류에서 분리한 고농도 streptomycin에 대해 저항성인 대장균의 저항성 유전자
Resistance genes in high-level streptomycin resistant Escherichia coli isolated from shellfish 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.54 no.3, 2018년, pp.228 - 236

임찬석 (순천대학교 생물학과) , 이영선 (순천대학교 생물학과) , 강형일 (순천대학교 환경교육과) , 안삼영 (순천대학교 환경교육과) , 정재성 (순천대학교 생물학과)

초록
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2015년 4월부터 2016년 3월까지 우리나라에서 채취한 패류로부터 분리한 대장균 중에서 고농도의 streptomycin에 저항성을 갖는 균주의 저항성 유전자를 조사하기 위하여 이 연구를 수행하였다. 패류 시료로부터 분리한 269개 대장균 중에서 최소저해농도(MIC)가 $1,024{\mu}g/ml$ 이상인 40개 균주를 선발하여 PCR을 통해 저항성 유전자를 확인하였다. 전체의 77.5%가 strA-strB 유전자를 가지고 있어 출현빈도가 가장 높았으며, 그 다음이 aadA 유전자로 30.0%에 달하였다. 6개 균주(15.0%)는 aadA와 strA-strB를 함께 가지고 있었다. 반면에 3개 균주(7.5%)는 조사된 두 유전자 어느 것도 가지고 있지 않았다. 동일한 저항성 유전자를 가지고 있으면서 MIC가 다른 이유를 real-time PCR로 규명하였다. aadA 또는 strA-strB를 단독으로 가지고 있는 균주들 사이에 MIC가 다른 이유는 가지고 있는 저항성 유전자의 copy number에서 차이가 나기 때문이었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to investigate the distribution of resistance genes in high-level streptomycin resistant Escherichia coli isolated from shellfish collected between April 2015 and March 2016 in Korea. From the 269 E. coli isolates obtained from shellfish samples, a total of 40 streptomycin-resistant isolates with MICs of > $1,024{\mu}g/ml$ were screened and the prevalence of streptomycin resistance determinants was analyzed by PCR. Among the isolates, strA-strB gene structure (77.5%) was the most frequent streptomycin resistance determinant, followed by aadA (30.0%). Six isolates (15.0%) simultaneously contained aadA and strA-strB determinants, whereas three of the isolates (7.5%) did not contain both resistance determinants examined in this work. The difference of MICs between the isolates having the same resistance gene was elucidated by real-time PCR results. The copy number of resistance genes differed considerably among the isolates, which solely harbored an aadA or strA-strB and showed different MICs.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

2015년 4월부터 2016년 3월까지 우리나라에서 채취한 패류로부터 분리한 대장균 중에서 고농도의 streptomycin에 저항성을 갖는 균주의 저항성 유전자를 조사하기 위하여 이 연구를 수행하였다. 패류 시료로부터 분리한 269개 대장균 중에서 최소저해농도(MIC)가 1,024 µg/ml 이상인 40개 균주를 선발하여 PCR을 통해 저항성 유전자를 확인하였다.
본 연구에서는 우리나라 남해안에서 채취한 패류로부터 분리한 대장균 중 높은 농도의 streptomycin에 저항성을 갖는 균주가 어떤 저항성유전자를 갖고 있는지를 조사하였다. 또한 동일한 저항성유전자를 가지고 있으면서도 MIC에서 차이가 나는 이유를 규명하고자 하였다. 이를 통해 남해안에서 생산 되는 패류의 위생상태를 점검하고 공중보건에 미칠 영향을 분석하는데 필요한 기초자료를 제공하고자 하였다.
본 연구에서는 우리나라 남해안에서 채취한 패류로부터 분리한 대장균 중 높은 농도의 streptomycin에 저항성을 갖는 균주가 어떤 저항성유전자를 갖고 있는지를 조사하였다. 또한 동일한 저항성유전자를 가지고 있으면서도 MIC에서 차이가 나는 이유를 규명하고자 하였다.
또한 동일한 저항성유전자를 가지고 있으면서도 MIC에서 차이가 나는 이유를 규명하고자 하였다. 이를 통해 남해안에서 생산 되는 패류의 위생상태를 점검하고 공중보건에 미칠 영향을 분석하는데 필요한 기초자료를 제공하고자 하였다.

제안 방법

1,024 µg/ml의 streptomycin에서 자란 균주를 대상으로 한 MIC의 측정을 위해 4,096 µg/ml에서 1,024 µg/ml까지 1/2씩 streptomycin 농도를 달리하여 배지를 제조한 뒤, 같은 방법으로 접종 및 배양을 하였다.
PCR기기는 Thermal Cycler Dice (Takara Shuzo)를 사용하였으며, 반응조건은 ant(3″) F/R, aph(3″) F/R 및 aph(6) F/R primer의경우 95°C에서 5분간 전 처리한 후, 95°C에서 30초 동안 denaturing, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 30초간 extension 과정을 30회 반복하였고, 마지막으로 72°C에서 7분간 final extension을 실시하였다.
Real-time PCR의 조건은 95°C에서 3분간 전 처리한 후, 95°C에서 10초간 denaturing, 55°C에서 10초간 annealing, 72°C에서 10초간 extension을 30회 반복하고 마지막 extension 반응은 72°C에서 7분간 실시하였다.
양성 시험관으로부터 백금이로 배양액을 TBX agar (tryptone bile glucuronide agar) (Oxoid) 평판배지에 도말하여 44°C에서 24시간 배양하였다. TBX agar에서 푸른색 콜로니가 형성되면 대장균 양성으로 판정하고 단일 균주를 확보하였다. 분리된 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열을 결정하여 대장균으로 최종 동정하였다.
strA-strB 유전자구조를 확인하기 위한 primer set인 strA/strB의 annealing은 60°C에서 30초 동안 실시하였다.
대장균으로부터 genomic DNA의 추출은 AccuPrep DNA Extraction Kit (Bioneer)를 사용하여 제조사가 추천한 방법으로실시하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop One spectrophotometer (Thermo Scientific)로 농도를 측정하였다.
동일한 strA-strB 구조를 가지면서 MIC가 다른 세 개의 균주를 대상으로 real-time PCR를 수행하였다(Fig. 2). MIC가 2,048 µg/ml인 DMRP546는 바지락(R.
5%)는 조사된 두 유전자 어느 것도 가지고 있지 않았다. 동일한 저항성 유전자를 가지고 있으면서 MIC가 다른 이유를 real-time PCR로 규명하였다. aadA 또는 strA-strB를 단독으로 가지고 있는 균주들 사이에 MIC가 다른 이유는 가지고 있는 저항성 유전자의 copy number에서 차이가 나기 때문이었다.
TBX agar에서 푸른색 콜로니가 형성되면 대장균 양성으로 판정하고 단일 균주를 확보하였다. 분리된 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열을 결정하여 대장균으로 최종 동정하였다. 16S rRNA 유전자는 27f와 1525r primers (Lane, 1991)를 사용하여 증폭하였고, 염기서열은 SolGent Co.
시료를 접종한 배지는 37°C에서 24시간 배양한 뒤 배지의 색이 노란색으로 변한 시험관을 대상으로 확정시험을 실시하였다.
여기에 LB broth에서 전 배양한 대장균 배양액 10 µl를 접종하여 35°C에서 18시간 배양한 후 세균의 증식 여부를 확인하였다.
최소저해농도(MIC)는 Kim 등(2016)의 방법을 변형하여 측정하였다. 먼저, 분리된 대장균 중에서 고농도의 streptomycin 에 대해 저항성을 갖는 균주를 선발하였다.
대장균으로부터 genomic DNA의 추출은 AccuPrep DNA Extraction Kit (Bioneer)를 사용하여 제조사가 추천한 방법으로실시하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop One spectrophotometer (Thermo Scientific)로 농도를 측정하였다.
패류 시료로부터 분리한 269개 대장균 중에서 최소저해농도(MIC)가 1,024 µg/ml 이상인 40개 균주를 선발하여 PCR을 통해 저항성 유전자를 확인하였다.

대상 데이터

2015년 4월부터 2016년 3월까지 채취한 패류로부터 총 269개의 대장균 균주를 분리하였다. 그 중 1,024 µg/ml의 streptomycin 에서 자라는 고농도 저항성 균주는 40개로 전체의 14.
Real-time PCR의 조건은 95°C에서 3분간 전 처리한 후, 95°C에서 10초간 denaturing, 55°C에서 10초간 annealing, 72°C에서 10초간 extension을 30회 반복하고 마지막 extension 반응은 72°C에서 7분간 실시하였다. Real-time PCR 기기는 Thermal Cycler Dice Real Time System III (Takara Shuzo)를 사용하였다. 이 실험은 3회 반복 하였다.
대장균을 분리하기 위한 패류 시료는 2015년 4월부터 2016 년 3월까지 전남지역 남해안에서 채취하였다. 바지락(Ruditapes philippinarum)과 새꼬막(Scapharca subcrenata)은 고흥군 득량만 해역에서, 굴(Crassostrea gigas)과 전복(Haliotis discus) 은 완도 주변 해역에서 채취하였다.
Real-time PCR 반응액의 조성은 1 µl (20 ng)의 주형 DNA, 10 µl의 iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad)에 각 5 pmol의 primer를 넣은 후 증류수로 최종 반응용액의 부피를 20 µl로조절하였다. 대조군 유전자로는 대장균의 adenylate kinase 유전자인 adk를 사용하였다. House keeping 유전자인 adk의 증폭을 위한 primer 염기서열은 adk-F; 5′-ATT CTG CTT GGC GCT CCG GG-3′, adk-R; 5′-CCG TCA ACT TTC GCG TAT TT-3′이었다(Nemoy et al.
최소저해농도(MIC)는 Kim 등(2016)의 방법을 변형하여 측정하였다. 먼저, 분리된 대장균 중에서 고농도의 streptomycin 에 대해 저항성을 갖는 균주를 선발하였다. 이를 위해 1,024 µg/ml 되도록 streptomycin을 첨가한 Muller-Hinton broth (Becton Dickson) 3 ml를 시험관에 분주하였다.
대장균을 분리하기 위한 패류 시료는 2015년 4월부터 2016 년 3월까지 전남지역 남해안에서 채취하였다. 바지락(Ruditapes philippinarum)과 새꼬막(Scapharca subcrenata)은 고흥군 득량만 해역에서, 굴(Crassostrea gigas)과 전복(Haliotis discus) 은 완도 주변 해역에서 채취하였다.

이론/모형

대장균의 분리는 ISO 16649-3 (2015)의 방법에 따라 패류에 존재하는 대장균을 계수하는 과정을 통해 이루어졌다. 요약하면, 탈각한 패류시료 200 g에 2배의 0.

성능/효과

MIC가 > 4,098 µg/ml인 WSCG51110의 저항성 유전자 수가 2,048 µg/ml인 JDCG571보다 2.42배 많은 것으로 나타났다(Fig. 3).
1B and C). strA에서 forward primer를 strB에서 reverse primer를 제작하여 PCR을 수행한 결과에서도, strA 또는 strB 유전자를 가지고 있는 모든 대장균에서 예상되었던 538 bp의 DNA가 증폭되어 두 유전자가 나란히 결합되어 있는 strA-strB구조를 하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 1D). strA-strB는 사람을 비롯한 동·식물에 병원성인 다양한 세균에서 흔히 나타나는 유전자 구조이다(Sundin and Bender, 1996).
△△Ct 방법으로 유전자의 copy number를 상대적으로 정량 하였을 때, MIC가 2,048µg/ml인 DMRP546을 기준으로 4,096 µg/ml인 WSCG5105는 2.52배, > 4,096 µg/ml인 WSCG5119는 9.96배의 copy number를 갖는 것으로 나타났다.
고농도의 streptomycin에 대한 저항성 균주를 대상으로 유전자의 분포를 조사한 본 연구에서는 77.5%가 strA-strB를 가지고 있었다. strA-strB는 streptomycin을 불활성화 시키는 두개의 효소를 암호화하는 유전자가 반복적으로 연결된 구조이기 때문에 고농도 저항성 균주 중에서 높은 빈도로 출현한 것으로 보인다.
그러나 본 연구 결과에서 aadA를 단독으로 가지고 있는 6개 균주 중 4 개 균주의 MIC가 > 4,096 µg/ml로 높았다(Fig. 1 and Table 1).
strA-strB는 사람을 비롯한 동·식물에 병원성인 다양한 세균에서 흔히 나타나는 유전자 구조이다(Sundin and Bender, 1996). 본 연구에서는 40개 균주 중 strA-strB를 가지고 있는 균주가 77.5% (31/40)로 가장 많은 것으로 나타났다. aadA는 30.
9%에 달하였다(Table 1). 저항성 균주들에 대한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 결과 대장균의 type strain과 비교하여 1~3 염기가 차이 나는 것으로 확인되어 99.8% 이상의 유사성을 보였다.
패류 시료로부터 분리한 269개 대장균 중에서 최소저해농도(MIC)가 1,024 µg/ml 이상인 40개 균주를 선발하여 PCR을 통해 저항성 유전자를 확인하였다. 전체의 77.5%가 strA-strB 유전자를 가지고 있어 출현빈도가 가장 높았으며, 그 다음이 aadA 유전자로 30.0%에 달하였다. 6개 균 주(15.
한편, 건강한 돼지로부터 분리된 streptomycin 저항성 대장균에서 strA-strB가 61.1% (44/72)를 차지하여 가장 출현빈도가 높았고, 그 다음으로 aadA가 54.2% (39/72)를 차지하였다. 25.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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