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문제 정의
- 따라서 본 연구는 난소의 난자형성과정에서 발생되는 각 단계별 미분화 세포에서 방사선 에너지에 의한 형태학적 손상을 알아보고자 하였다. 그 일환으로 흰쥐에 전신 7Gy X선을 피폭하여 일정 간격으로 희생하여 난포의 형성과정에서 주변 세포들과 소기관들에 대한 손상 기전을 밝히고, 알리인을 투여하여 천연물질의 방호효과를 알아보고자 하였다.
- 따라서 본 연구는 난소의 난자형성과정에서 발생되는 각 단계별 미분화 세포에서 방사선 에너지에 의한 형태학적 손상을 알아보고자 하였다. 그 일환으로 흰쥐에 전신 7Gy X선을 피폭하여 일정 간격으로 희생하여 난포의 형성과정에서 주변 세포들과 소기관들에 대한 손상 기전을 밝히고, 알리인을 투여하여 천연물질의 방호효과를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 실험동물은 가로 30 ㎝ × 세로 30 ㎝로 특수 제작한 상자에 넣고 윗부분은 투명 아크릴로 덮은 후 높이를 같게 하였다.
- 실험을 위한 흰쥐는 200～250 g 크기의 암컷 24 마리를 사용하였다. 실험은 대조군, 방사선 조사군, 알리인 투여 후방사선 조사군으로 구분하였다. 방사선 조사 후 15일, 20일, 30일, 40일 간격으로 실험 군 별로 2 마리씩 희생시킨 후 난소 조직을 적출하여 시료로 사용하였다(Table 1).
- 실험은 대조군, 방사선 조사군, 알리인 투여 후방사선 조사군으로 구분하였다. 방사선 조사 후 15일, 20일, 30일, 40일 간격으로 실험 군 별로 2 마리씩 희생시킨 후 난소 조직을 적출하여 시료로 사용하였다(Table 1).
- 방사선조사는 선형가속기(Linac 21 EX-S, USA, 2006)을 이용하여 6 Mev X선으로 대향이문조사를 실시하였다. 실험동물은 가로 30 ㎝ × 세로 30 ㎝로 특수 제작한 상자에 넣고 윗부분은 투명 아크릴로 덮은 후 높이를 같게 하였다.
- 실험동물은 가로 30 ㎝ × 세로 30 ㎝로 특수 제작한 상자에 넣고 윗부분은 투명 아크릴로 덮은 후 높이를 같게 하였다. 방사선 조사는 SSD는 98 ㎝로 고정하고 심부 선량을 2 ㎝로 한 다음 전신 7 Gy로 X선을 조사하였다(Fig. 1).
- 본 실험을 위해 사용된 시약은 SIGMA-ALDRICH Korea에서 구입한 알리인(Synonym: 3-(2-Propenylsulfinyl) -L-alanine, S-AllylL-cysteine sulfoxide, L-Alliin)은 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 백색의 동결 건조된 고체 분말 10 mg 2개를 사용하였다. 알리인의 투여는 흰쥐를 고정틀에 고정시킨 후 꼬리정맥을 통하여 투여하였다. 투여량은 생리식염수 5 ml에 알리인 분말 10 mg 1개를 희석하여 사용하였다.
- 투여량은 생리식염수 5 ml에 알리인 분말 10 mg 1개를 희석하여 사용하였다. 투여량은 방사선 조사 직전 한 마리당 희석된 1 ml을 정맥 투여하였다(Fig. 2).
- 난소 조직을 적출하여 시료제작을 위해 약품처리는 glutaraldehyde (2.5%, Polyscience)에서 3시간 동안 전고정한 후, osmmium tetraoxide (1%, Polyscience)로 1시간 30분 후 고정하였다. 이후 ethyl alcohol (Merck)을 사용하여 계대탈수과정을 시행하고, propylene oxide (Merck)로 치환하였다.
- 이후 ethyl alcohol (Merck)을 사용하여 계대탈수과정을 시행하고, propylene oxide (Merck)로 치환하였다. epon resin (polyscience)에 포매하여 60℃ 배양기에서 48시간 중합하여 block을 제작하였다. ultra microtome(Leica, Ultra-S, 2003)을 이용하여 80 nm로 박절 후 uranyl acetate (Polyscience)와 lead nitrate (Polyscience)로 이중염색하여 투과전자현미경(H-7000, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다(Fig.
- epon resin (polyscience)에 포매하여 60℃ 배양기에서 48시간 중합하여 block을 제작하였다. ultra microtome(Leica, Ultra-S, 2003)을 이용하여 80 nm로 박절 후 uranyl acetate (Polyscience)와 lead nitrate (Polyscience)로 이중염색하여 투과전자현미경(H-7000, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다(Fig. 3).
- 또한 천연방어 물질인 알리인의 방어 효과에서도 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 지금까지 알려진 혈소판의 연구와 간세포에서 밝혀진 연구 결과와 일치하는 방어효과를 확인하였다. 그 중 세포막과 핵막의 보호효과가 가장 크게 작용한 것으로 확인되었으며, 미토콘드리아, 조면소포체 등의 소기관들에 대한 보호효과도 확인되었다.
대상 데이터
- 실험을 위한 흰쥐는 200～250 g 크기의 암컷 24 마리를 사용하였다. 실험은 대조군, 방사선 조사군, 알리인 투여 후방사선 조사군으로 구분하였다.
- COOH)은 알리신의 전구체로서 알리나아제의 효소 작용에 의해 매운 맛과 냄새가 나는 알리신으로 변한다. 본 실험을 위해 사용된 시약은 SIGMA-ALDRICH Korea에서 구입한 알리인(Synonym: 3-(2-Propenylsulfinyl) -L-alanine, S-AllylL-cysteine sulfoxide, L-Alliin)은 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 백색의 동결 건조된 고체 분말 10 mg 2개를 사용하였다. 알리인의 투여는 흰쥐를 고정틀에 고정시킨 후 꼬리정맥을 통하여 투여하였다.
성능/효과
- 본 연구에서도 방사선 피폭 후 15일 지난 난조세포에서 세포막이 손상되고 간질세포에 형성된 섬유모세포도 가장자리의 형태가 변화된 것으로 관찰되었다. 또한 핵막 안쪽에서 공포화가 관찰되고 핵주변의 소기관인 조면소포체에서 리보좀이 분리된 것으로 확인되었다.
- 본 연구에서도 방사선 피폭 후 15일 지난 난조세포에서 세포막이 손상되고 간질세포에 형성된 섬유모세포도 가장자리의 형태가 변화된 것으로 관찰되었다. 또한 핵막 안쪽에서 공포화가 관찰되고 핵주변의 소기관인 조면소포체에서 리보좀이 분리된 것으로 확인되었다. 내 난포막을 구성하는 세포질에는 지방과립이 엉켜서 가장자리가 선명하게 관찰되지 않았다.
- 20일 경과된 조직에서는 지방소적들이 많이 분포되어 과립이 형성되는 것을 볼 때 다음 단계로 진행하기 위한 에너지 저장을 하는 것으로 보였다. 또한 방사선에 의해 손상된 낡은 세포 소기관과 노폐물 및 식작용의 산물들을 소화하는 2차 리소좀이 확인되어 스스로 보호하는 것으로 판단된다. 이러한 현상은 방사선에 의한 apoptosis가 일어나는 과정으로 보여 진다.
- 한편 마늘 성분의 알리인을 정맥 투여한 실험의 조직에서는 방사선 조사 후 15일된 난조세포에서 일부 세포막이 위축되어 있었으나 주변 섬유모세포와 소기관들의 손상은 심각한 형태의 변화는 관찰되지 않았다. 알리인 투여 후 30일 경과된 조직관찰에서는 내 난포막을 구성하는 세포질에 정상적인 지방소적이 많이 분포되어 있었으며 분비과립이 증가되는 것으로 보아 성선자극호르몬의 분비가 촉진되는 것으로 보였다.
- 따라서 본 연구 결과 방사선의 피폭에 대한 영향이 난소에서 난조세포에 크게 손상을 주어 다음 단계의 성장에 장해를 초래하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 출생 이후 한정되어 있는 생식세포에서 방사선에 대한 방어는 더욱 필요하다고 보여진다.
- 이러한 결과는 출생 이후 한정되어 있는 생식세포에서 방사선에 대한 방어는 더욱 필요하다고 보여진다. 또한 천연방어 물질인 알리인의 방어 효과에서도 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 지금까지 알려진 혈소판의 연구와 간세포에서 밝혀진 연구 결과와 일치하는 방어효과를 확인하였다.
- 지금까지 알려진 혈소판의 연구와 간세포에서 밝혀진 연구 결과와 일치하는 방어효과를 확인하였다. 그 중 세포막과 핵막의 보호효과가 가장 크게 작용한 것으로 확인되었으며, 미토콘드리아, 조면소포체 등의 소기관들에 대한 보호효과도 확인되었다. 따라서 향후 새로운 연구 방식으로 방어효과를 확인한다면 천연물질 방호제로서 충분한 역할을 할 것으로 판단된다.
- 난모세포로 성장하는 과정에서 7 Gy 방사선에 의한 영향은 초기 미분화된 세포에서 손상이 큰 것으로 확인되었다.
- 1. 난조세포의 세포막과 핵막이 크게 손상된 것으로 확인되었다. 핵막 주변의 조면소포체에서 리보좀 분리되어 관찰되었으며, 세포질에는 공포화 된 곳이 관찰되었다
- 2. 20일 후의 조직에서는 미토콘드리아 한쪽막이 부풀어져 일부 내용물이 유출되어 손상된 것으로 관찰되었고, 세포질에는 소기관들과 지방소적들이 서로 엉켜서 일그러져 있거나 가장자리의 윤곽이 분명하지 않은 상태로 관찰되었다.
- 3. 알리인을 투여한 조직에서는 세포막이 밀부 함몰되어 관찰되었으나 이중막의 형태는 정상적으로 관찰되었다. 또한 소기관들의 형태도 정상적으로 보였으며 분비과립과 지방소적의 손상도 관찰되지 않았다.
- 따라서 난소조직의 방사선에 의한 손상은 초기 난조세포와 주변 소기관들에서 손상이 많았으며, 알리인의 방호효과도 확인할 수 있었다.
- 일부 큰 소기관에서는 한쪽막이 옅은 농도로 두꺼워져 있었으며, 막 속의 내용물이 밖으로 유출된 것으로 확인되었다. 또한 자가소화과정이나 낡은 세포 소기관과 노폐물 및 식작용의 산물들을 소화하는 2차 리소좀이 확인되었다(Fig. 6 A, B). 이러한 현상은 세포사멸(apoptosis) 과정에서 나타나며, 배아 발생 과정에서 확인된다.
- 이러한 현상은 세포사멸(apoptosis) 과정에서 나타나며, 배아 발생 과정에서 확인된다. 30일 후의 난조세포의 관찰에서는 핵막이 일부 함몰된 것을 볼 수 있었으나 염색질은 일정하게 분포된 것으로 확인되었다. 20일까지 손상이 없었던 미토콘드리아에서 내외막이 분리되었으며, 일부에서는 공포화된 부분이 관찰되었고 30% 정도에서는 일부 막은 엷은 두께로 층이 비후된 것으로 확인되었다(Fig.
- 알리인 투여 후 15일 지난 난조세포에서는 세포막이 일부 함몰되어 있었지만 전체적인 윤곽에서 볼 때 손상의 정도는 심하게 관찰되지 않았다. 핵의 모양은 정상적으로 관찰되었고, 주변 섬유모세포도 크기나 형태적인 손상은 정상적인 모양으로 관찰되었다.
- 알리인 투여 후 15일 지난 난조세포에서는 세포막이 일부 함몰되어 있었지만 전체적인 윤곽에서 볼 때 손상의 정도는 심하게 관찰되지 않았다. 핵의 모양은 정상적으로 관찰되었고, 주변 섬유모세포도 크기나 형태적인 손상은 정상적인 모양으로 관찰되었다. 혈관 벽에서도 두께가 일정하게 유지된 것으로 관찰되었다(Fig.
- 8 A). 미토콘드리아 속의 크리스테도 정상적으로 확인되고 핵막의 이중구조도 정상적으로 관찰되었다(Fig. 8 B). 20일된 난소조직에서는 난모상피세포들이 정상적인 형태를 유지하고 가장자리의 막의 윤곽도 선명하게 관찰되었다(Fig.
- 8 C). 난모세포의 핵 주변에는 많은 수의 미토콘드리아의 형태가 정상적으로 확인되었으며, 내외‧분비선에서 생산되어 농축된 분비과립이 진하게 염색되었고, 지방소적도 선명하게 관찰되었다(Fig. 8 D).
후속연구
- 하지만 난자형성 과정에서 주변 세포를 구성하고 있는 미토콘드리아, 소포체, 골지체를 포함한 핵막과 핵소체에 대한 미세구조의 손상을 밝히는 연구는 부족한 실정이다. 또한 손상을 최소화 할 수 있는 방호제 연구도 필요하다. 지금까지 알려진 방호제 물질로는 SH 화합물이 선량감소 효과가 있는 것으로 보고되었다[1,5].
- 그 중 세포막과 핵막의 보호효과가 가장 크게 작용한 것으로 확인되었으며, 미토콘드리아, 조면소포체 등의 소기관들에 대한 보호효과도 확인되었다. 따라서 향후 새로운 연구 방식으로 방어효과를 확인한다면 천연물질 방호제로서 충분한 역할을 할 것으로 판단된다.
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